CN104531795A - 一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于生物工程技术领域的一种符合新资源食品公告工艺规定的生产高纯度γ-氨基丁酸方法。以L-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌发酵、加热杀菌，冷却，活性炭处理，过滤，将上述过滤后的发酵液，再经离心分离菌体，采用离子交换脱盐法进行纯化，经过喷射循环真空浓缩后，冷却结晶，获得纯化的γ-氨基丁酸结晶产品，白色至淡黄色粉末或颗粒，纯度95％以上。本发明是在新资源食品公告工艺基础上，提供一种高纯度新资源食品γ-氨基丁酸的工艺，符合食品法规，为透明饮料或功能水的食品饮料研发提供高品质原料。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种符合新资源食品公告工艺规定的生产高纯度γ-氨基丁酸方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(Gamma aminobutyric acid，简称GABA)于1883年作为一种化学物质被合成，1950年弗洛瑞和罗伯特在哺乳类动物脑萃取液中首次发现GABA，在人体内，脑组织中的GABA含量最高，大约为0.1-0.6mg/克组织。1979年发现人体消化道内也可作为神经传导物质，在人体组织内的存在也被证实。GABA是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经***中重要的抑制性神经传达物质。具有许多重要的生理功能，如抗焦虑、抗抑郁、改善睡眠、降血压、营养脑神经细胞、健肝利肾等。但是年龄增长和精神压力加大使GABA的积累困难。目前，我国的食品法规中，GABA有2处与食品相关，一是用作新资源食品，一是作为食品添加剂中用作合成各类香精的香料原料。γ-氨基丁酸的生产有四种方法：化学合成法、大肠杆菌发酵法、植物富集法和乳酸菌发酵法(包括希氏乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌等多种乳酸菌发酵法)。
化学合成法是目前最主要的生产方法，产量最大。其工艺是以化工产品吡咯烷酮(剧毒物质)为原料，在碱性条件下，保持一定温度和压力，吡咯烷酮开环加水合成GABA，成本极低，得率很高，纯度也很高。达到99.5％以上，目前市场价格仅为60-100元/kg。由于化学合成GABA的原料为剧毒物质吡咯烷酮，当反应结束，产品GABA与未完全反应的残留原料吡咯烷酮混合在一个体系中，尽管进行了多个单元操作的GABA的分离提取、以及结晶纯化，产品GABA中残留的吡咯烷酮是必然的，不可用于食品中。
大肠杆菌发酵法，是以谷氨酸钠为原料经大肠杆菌发酵生产获得GABA。此方法属于生物合成方法，但是，此方法生产的GABA也不能作为食品食用，不符合食品法规。此法生产的氨基丁酸也不被人们接受，因为大肠杆菌属于人畜肠道菌，在于人畜***物中。如果产品中带有的大肠杆菌含量超标，人体食用后会引起肠胃腹泻，发烧，长期食用会引起更为严重的疾病。此方法不是主要的GABA生成方法。全国范围内生产厂家未曾报道。
植物富集法，可来源于一些特定植物食物，例如茶叶和糙米。对茶叶进行一些物理方法的处理，或将糙米进行发芽处理，植物本身所含的GABA大量增加。绿茶起始GABA 1.74-17.4mg/100g，制备过程中如果经过二氧化碳等嫌气处理，GABA可达200mg/100g左右。该方法原料安全可靠，没有毒副作用。然而该方法生产GABA产量和产品纯度很低，以mg级为计量单位，无法获得高纯度的氨基丁酸产品，不能满足人体对GABA的量的需求。
乳酸菌发酵法。乳酸菌是一类细菌的统称，包括多个种类。目前，科技期刊文献和专利中报道了多种乳酸菌发酵生产GABA，例如希氏乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌等。从国家食品法规严格意义上讲，根据中华人民共和国***新资源食品公告规定，只有以希氏乳杆菌发酵L-谷氨酸钠生产的GABA才可作为新资源食品。尽管有些乳酸菌来源于食品泡菜等，例如短乳杆菌，也能催化L-谷氨酸钠生成GABA。
2001年，日本最早批准GABA作为食品使用，在台湾于2005年被批准作为食品使用。在我国，中华人民共和国***于2009年09月27日公告中(2009年第12号)批准为新资源食品，并规定的使用范围为：饮料、可可制品、巧克力和巧克力制品、糖果、焙烤食品、膨化食品，但不包括婴幼儿食品。从此可用于一般营养食品和功能食品的开发。但是新资源食品GABA，必须是按公告中规定的工艺生产，即以L-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌(Lactobacillushilgardii)发酵、加热杀菌、冷却、活性炭处理、过滤、加入调配辅料(淀粉)、喷雾干燥等步骤生产而成。产品GABA含量≥20％。这意味着使用化学合成的GABA作为食品或食品原料，则不符合食品法规，属于非食用物质的食品添加。
专利“一种高效生产γ-氨基丁酸的发酵方法”(申请号201010045843.5)，该发明公开了一种高效生产γ-氨基丁酸的发酵方法，其特征是方法步骤为：将短乳杆菌活化后，以10％的接种量接种于发酵培养基，32℃培养36-84h；并于12h和24h分别补入1.5mol和0.7mol的L-谷氨酸钠；整个发酵过程用10N的硫酸控制pH5.0即可。
专利“γ-氨基丁酸的高效制备工艺”(申请号201110092472.0)，该发明公开了一种γ-氨基丁酸的高效制备工艺。利用希氏乳杆菌(Lactobacillushilgardii)经过改良优化的MRS培养基分级扩大培养后，离心浓缩菌液，再与谷氨酸钠的悬浊液混合，采用细胞转化法，获得γ-氨基丁酸。用电渗析脱盐法进行纯化，离心分离菌体，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到10-25％，再纯化即得γ-氨基丁酸产品，白色粉末状，纯度98％以上，利用糊精制备20％含量的成品。本专利符合食品法规，但是扩大培养菌体后离心收集菌体，工艺繁琐，规模化生产实现比较困难。另外电渗析脱盐法进行纯化，成本较高。
专利“一种利用食果糖乳杆菌生产γ-氨基丁酸的方法”(申请号201110202922.7)，该发明公开了一种利用食果糖乳杆菌生产γ-氨基丁酸的方法，包括(1)活化：将食果糖乳杆菌菌块溶解后接种于MRS液体培养基上培养活化；(2)发酵：活化后的食果糖乳杆菌接种于含1％谷氨酸钠的MRS培养基中，在30～35℃、pH3.0～4.0条件下发酵培养2～10天，所得培养液中即含有γ-氨基丁酸。
专利“谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法”(申请号201210171992.5)，该发明公开了本发明提供了一种谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法。主要工艺包括：(1)将底物谷氨酸钠溶液与固相酶催化合成生成γ-氨基丁酸，再通过离心分离生物固相酶与反应液；(2)反应液经过阳离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，生成纯化γ-氨基丁酸；(3)γ-氨基丁酸水溶液活性炭脱色后，真空薄膜浓缩得γ-氨基丁酸浓溶液；(4)γ-氨基丁酸浓溶液加入95％酒精，析出γ-氨基丁酸白色沉淀结晶，离心分离，真空干燥得白色γ-氨基丁酸粉末。
专利“利用重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法”(申请号201310043508.5)，该发明公布了利用重组钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum SYP，保藏编号CCTCC NO：M208133)以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明应用基因工程方法，将钝齿棒杆菌SYPA5-5基因argB敲除，获得能够积累谷氨酸的安全菌株钝齿棒杆菌E01；从上.Plantarum GB01-21克隆谷氨酸脱羧酶基因于钝齿棒杆菌E01中表达，获得以葡萄萄糖为底物直接合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌C.crenatum E01/pGAD。重组菌发酵液γ-氨基丁酸积累量达13.98g/L。
专利“一株产谷氨酸脱羧酶的菌株及用其生产γ-氨基丁酸的方法”(申请号201310276458.5)，该发明公布了一株产谷氨酸脱羧酶的菌株及用其生产γ-氨基丁酸的方法，属于食品生物技术领域。本发明提供了一株从泡菜中筛选而来的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SK30.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013250，并提供了一种利用该菌株发酵生产γ-氨基丁酸的方法，该方法包括：(a)在发酵培养基中对该菌株进行培养，以得到该植物乳杆菌菌体；(b)用植物乳杆菌菌体转化谷氨酸钠生成γ-氨基丁酸；(c)γ-氨基丁酸的分离纯化。
专利“一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法”(申请号201410291576.8)，该发明公布了一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，属于微生物发酵工程领域。本发明采用一株产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis SYFS1.009)为菌种，在加有15g/L谷氨酸钠的MRS培养基中与酿酒酵母W303-1A(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)混菌培养，同时接种，36h发酵液中γ-氨基丁酸含量是乳酸菌单菌培养条件下的4.7倍。
专利“一种利用乳酸菌静息细胞发酵生产γ-氨基丁酸工艺”(申请号201410295837.3)，该发明公布了本发明公开了乳酸菌[(Lactic acid bacteria)，包括短乳杆菌、肠球菌、戊糖片球菌等]静息细胞发酵生产γ-氨基丁酸(GABA)工艺，利用经过诱导的乳酸菌活性静息细胞体，分散于含有底物的转化缓冲液中，在合适的条件下转化生产γ-氨基丁酸。
γ-氨基丁酸作为人体内源性抑制性神经递质，具有多种生理功能。在***公告(2009年第12号)批准γ-氨基丁酸为新资源食品之后，可合法上市销售，可根据食品法规在食品中使用。由于新资源食品γ-氨基丁酸的价格昂贵，纯度为20％以上的γ-氨基丁酸产品目前的市场价格800～1200元/kg，研究者对其乳酸菌等菌种发酵生产γ-氨基丁酸的研究兴趣更加浓厚，有更多的科技期刊论文和和专利公开发表。在众多的研究中，使用的菌种多不符合食品法规。要么使用的不是乳酸菌而是其他细菌，例如大肠杆菌、钝齿棒杆菌等，要么使用的是乳酸菌，但不是公告中规定的希氏乳杆菌，而是其他乳酸菌如乳酸乳球菌、植物乳杆菌、短乳杆菌等。即使使用的是希氏乳杆菌，或者工艺复杂，发酵产率较低，难以工程放大生产，或者其产业化生产的成本相对高昂，只能生产纯度为≥20％的γ-氨基丁酸产品。到目前为止，在国内取得γ-氨基丁酸生成许可证的厂家中，还没有任何厂家能够生产高纯度(95％)新资源食品γ-氨基丁酸。本项工艺技术的研究目的是采用新资源食品γ-氨基丁酸的工艺生产，经分离提取获得高纯度(95％)新资源食品γ-氨基丁酸，这对我国市场乃至对外出口，提供高品质的新资源食品γ-氨基丁酸具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种符合新资源食品公告工艺规定的生产高纯度γ-氨基丁酸方法。以L-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)发酵生产γ-氨基丁酸，并纯化得到纯度为95％以上的食品级γ-氨基丁酸。
一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法，按照如下步骤进行：
(1)26-28℃条件下，将希氏乳杆菌在乳酸细菌培养基中培养，160-220rpm振荡培养24-48h，获得种子菌液，按照接种量1-5％，在温度28-30℃的条件下供气在种子扩大培养基中培养48-72h，分批流加L-谷氨酸钠至扩大培养发酵液，同时流加2-4mol/L的盐酸，控制pH 4.5-6.0和反应温度30-40℃，继续反应3-5天，即停止反应；
(2)加热杀菌：发酵结束，将体系升温80-100℃，保持20-40min，杀灭菌体；
(3)冷却：采用薄板冷却器，将上述的发酵液冷却至40-70℃，并导入脱色罐中，待用；
(4)活性炭处理：采用活性炭脱色，发酵液加入占发酵液质量0.1-1.0％的活性炭，保持40-70℃，搅拌20-40min进行脱色；
(5)过滤：脱色后的发酵液进行趁热过滤，采用0.20-0.24μm钛棒过滤，分离直至滤液澄清；
(6)离心固液分离：将上述澄清液进行离心，2000-4000g离心10-20min，收集含γ-氨基丁酸的上清液；
(7)离子交换法脱盐：将上述上清液以1-2倍床体积流速流过强酸性离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，待阳离子交换树脂吸附饱和后，然后用纯水洗到中性，用2mol/L稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计；树脂用纯水洗到中性，再用盐酸再生备用；采用离子交换法脱盐法进行纯化，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到5-10％；
(8)喷射循环真空浓缩：采用外循环式真空浓缩，温度60-90℃，获得浓缩γ-氨基丁酸溶液，γ-氨基丁酸浓度达到30-40％；
(9)结晶干燥：γ-氨基丁酸浓溶液加入95％食用酒精，浓溶液与95％食用酒精用量的体积比为1∶5-10，析出γ-氨基丁酸沉淀结晶，搅拌冷却至室温，离心分离，95％酒精洗涤，甩干，60℃真空干燥4-8小时，得γ-氨基丁酸结晶，白色至淡黄色粉末或颗粒，纯度95％以上。
所述分批流加L-谷氨酸钠的质量为扩大培养发酵液质量的5％。
所述乳酸细菌培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，余量为去离子水，培养基总量为1L。
所述种子扩大培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，谷氨酸钠50g，余量为反渗透水，调pH5-6.5，培养基总量为1L。
本发明的有益效果：本发明是在新资源食品公告工艺基础上的创新性方法，生产的食品γ-氨基丁酸纯度达到95％，符合食品法规，获得的高纯度氨基丁酸，为透明饮料或功能水的食品饮料研发提供高品质原料。
附图说明
图1实施例1γ-氨基丁酸样品HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法，按照如下步骤进行：
(1)27℃条件下，将希氏乳杆菌在乳酸细菌培养基中培养，180rpm振荡培养30h，获得种子菌液，按照接种量3％，在温度29℃的条件下供气在种子扩大培养基中培养56h，分批流加L-谷氨酸钠至扩大培养发酵液，加入量为扩大培养发酵液质量的5％，同时流加3mol/L的盐酸，控制pH 5.0和反应温度35℃，继续反应4天，即停止反应；
所述乳酸细菌培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，余量为去离子水，培养基总量为1L。
所述种子扩大培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，谷氨酸钠50g，余量为反渗透水，调pH5.5，培养基总量为1L。
(2)加热杀菌：发酵结束，将体系升温90℃，保持30min，杀灭菌体；
(3)冷却：采用薄板冷却器，将上述的发酵液冷却至50℃，并导入脱色罐中，待用；
(4)活性炭处理：采用活性炭脱色，发酵液加入占发酵液质量0.5％的活性炭，保持50℃，搅拌30min进行脱色；
(5)过滤：脱色后的发酵液进行趁热过滤，采用0.22μm钛棒过滤，分离直至滤液澄清；
(6)离心固液分离：将上述澄清液进行离心，3000g离心15min，收集含γ-氨基丁酸的上清液；
(7)离子交换法脱盐：将上述上清液以1.5倍床体积流速流过强酸性离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，待阳离子交换树脂吸附饱和后，然后用纯水洗到中性，用2mol/L稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计；树脂用纯水洗到中性，再用盐酸再生备用；采用离子交换法脱盐法进行纯化，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到8％；
(8)喷射循环真空浓缩：采用外循环式真空浓缩，温度70℃，获得浓缩γ-氨基丁酸溶液，γ-氨基丁酸浓度达到35％；
(9)结晶干燥：γ-氨基丁酸浓溶液加入95％食用酒精，浓溶液与95％食用酒精用量的体积比为1∶7，析出γ-氨基丁酸沉淀结晶，搅拌冷却至室温，离心分离，95％酒精洗涤，甩干，60℃真空干燥6小时，得γ-氨基丁酸结晶，白色至淡黄色粉末或颗粒，纯度为96％，其HPLC图谱如图1所示。
实施例2
一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法，按照如下步骤进行：
(1)26℃条件下，将希氏乳杆菌在乳酸细菌培养基中培养，160rpm振荡培养24h，获得种子菌液，按照接种量1％，在温度28℃的条件下供气在种子扩大培养基中培养48h，分批流加L-谷氨酸钠至扩大培养发酵液，加入量为扩大培养发酵液质量的5％，同时流加2mol/L的盐酸，控制pH 4.5和反应温度30℃，继续反应3天，即停止反应；
所述乳酸细菌培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，余量为去离子水，培养基总量为1L。
所述种子扩大培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，谷氨酸钠50g，余量为反渗透水，调pH5，培养基总量为1L。
(2)加热杀菌：发酵结束，将体系升温80℃，保持20min，杀灭菌体；
(3)冷却：采用薄板冷却器，将上述的发酵液冷却至40℃，并导入脱色罐中，待用；
(4)活性炭处理：采用活性炭脱色，发酵液加入占发酵液质量0.1％的活性炭，保持40℃，搅拌20min进行脱色；
(5)过滤：脱色后的发酵液进行趁热过滤，采用0.20μm钛棒过滤，分离直至滤液澄清；
(6)离心固液分离：将上述澄清液进行离心，2000g离心10min，收集含γ-氨基丁酸的上清液；
(7)离子交换法脱盐：将上述上清液以1倍床体积流速流过强酸性离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，待阳离子交换树脂吸附饱和后，然后用纯水洗到中性，用2mol/L稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计；树脂用纯水洗到中性，再用盐酸再生备用；采用离子交换法脱盐法进行纯化，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到5％；
(8)喷射循环真空浓缩：采用外循环式真空浓缩，温度60℃，获得浓缩γ-氨基丁酸溶液，γ-氨基丁酸浓度达到30％；
(9)结晶干燥：γ-氨基丁酸浓溶液加入95％食用酒精，浓溶液与95％食用酒精用量的体积比为1∶5，析出γ-氨基丁酸沉淀结晶，搅拌冷却至室温，离心分离，95％酒精洗涤，甩干，60℃真空干燥4小时，得γ-氨基丁酸结晶，白色至淡黄色粉末或颗粒，纯度为95％。
实施例3
一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法，按照如下步骤进行：
(1)28℃条件下，将希氏乳杆菌在乳酸细菌培养基中培养，220rpm振荡培养48h，获得种子菌液，按照接种量5％，在温度30℃的条件下供气在种子扩大培养基中培养72h，分批流加L-谷氨酸钠至扩大培养发酵液，加入量为扩大培养发酵液质量的5％，同时流加4mol/L的盐酸，控制pH6.0和反应温度40℃，继续反应5天，即停止反应；
所述乳酸细菌培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，余量为去离子水，培养基总量为1L。
所述种子扩大培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，谷氨酸钠50g，余量为反渗透水，调pH6.5，培养基总量为1L。
(2)加热杀菌：发酵结束，将体系升温100℃，保持40min，杀灭菌体；
(3)冷却：采用薄板冷却器，将上述的发酵液冷却至70℃，并导入脱色罐中，待用；
(4)活性炭处理：采用活性炭脱色，发酵液加入占发酵液质量1.0％的活性炭，保持70℃，搅拌40min进行脱色；
(5)过滤：脱色后的发酵液进行趁热过滤，采用0.24μm钛棒过滤，分离直至滤液澄清；
(6)离心固液分离：将上述澄清液进行离心，4000g离心20min，收集含γ-氨基丁酸的上清液；
(7)离子交换法脱盐：将上述上清液以2倍床体积流速流过强酸性离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，待阳离子交换树脂吸附饱和后，然后用纯水洗到中性，用2mol/L稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计；树脂用纯水洗到中性，再用盐酸再生备用；采用离子交换法脱盐法进行纯化，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到5％；
(8)喷射循环真空浓缩：采用外循环式真空浓缩，温度90℃，获得浓缩γ-氨基丁酸溶液，γ-氨基丁酸浓度达到30％；
(9)结晶干燥：γ-氨基丁酸浓溶液加入95％食用酒精，浓溶液与95％食用酒精用量的体积比为1∶10，析出γ-氨基丁酸沉淀结晶，搅拌冷却至室温，离心分离，95％酒精洗涤，甩干，60℃真空干燥8小时，得γ-氨基丁酸结晶，白色至淡黄色粉末或颗粒，纯度为95％。
实施例4
一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法，按照如下步骤进行：
(1)27℃条件下，将希氏乳杆菌在乳酸细菌培养基中培养，180rpm振荡培养30h，获得种子菌液，按照接种量3％，在温度29℃的条件下供气在种子扩大培养基中培养56h，分批流加L-谷氨酸钠至扩大培养发酵液，加入量为扩大培养发酵液质量的5％，同时流加3mol/L的盐酸，控制pH 5.0和反应温度35℃，继续反应4天，即停止反应；
所述乳酸细菌培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，余量为去离子水，培养基总量为1L。
所述种子扩大培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，马唐提取物5.0g、葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，谷氨酸钠50g，余量为反渗透水，调pH5.5，培养基总量为1L。
所述马唐提取物的提取方法如下：将马唐植株晒干，用3-7倍质量的30％异丙醇水溶液在60-70℃减压回流提取。提取2次，每次1-3小时，合并提取液，减压回收溶媒，浓缩提取液至原体积的0.1-0.05倍，向浓缩液中加入95％乙醇使乙醇浓度达到50％，沉淀过滤，用70％乙醇洗涤沉淀至百色，在60℃下真空干燥制成。
(2)加热杀菌：发酵结束，将体系升温90℃，保持30min，杀灭菌体；
(3)冷却：采用薄板冷却器，将上述的发酵液冷却至50℃，并导入脱色罐中，待用；
(4)活性炭处理：采用活性炭脱色，发酵液加入占发酵液质量0.5％的活性炭，保持50℃，搅拌30min进行脱色；
(5)过滤：脱色后的发酵液进行趁热过滤，采用0.22μm钛棒过滤，分离直至滤液澄清；
(6)离心固液分离：将上述澄清液进行离心，3000g离心15min，收集含γ-氨基丁酸的上清液；
(7)离子交换法脱盐：将上述上清液以1.5倍床体积流速流过强酸性离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，待阳离子交换树脂吸附饱和后，然后用纯水洗到中性，用2mol/L稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计；树脂用纯水洗到中性，再用盐酸再生备用；采用离子交换法脱盐法进行纯化，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到10％；
(8)喷射循环真空浓缩：采用外循环式真空浓缩，温度70℃，获得浓缩γ-氨基丁酸溶液，γ-氨基丁酸浓度达到40％；
(9)结晶干燥：γ-氨基丁酸浓溶液加入95％食用酒精，浓溶液与95％食用酒精用量的体积比为1∶7，析出γ-氨基丁酸沉淀结晶，搅拌冷却至室温，离心分离，95％酒精洗涤，甩干，60℃真空干燥6小时，得γ-氨基丁酸结晶，白色至淡黄色粉末或颗粒，纯度为99％。
实施例5
一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法，按照如下步骤进行：
(1)27℃条件下，将希氏乳杆菌在乳酸细菌培养基中培养，180rpm振荡培养30h，获得种子菌液，按照接种量3％，在温度29℃的条件下供气在种子扩大培养基中培养56h，分批流加L-谷氨酸钠至扩大培养发酵液，加入量为扩大培养发酵液质量的5％，同时流加3mol/L的盐酸，控制pH 5.0和反应温度35℃，继续反应4天，即停止反应；
所述乳酸细菌培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，余量为去离子水，培养基总量为1L。
所述种子扩大培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g，苹果酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，谷氨酸钠50g，余量为反渗透水，调pH5.5，培养基总量为1L。
(2)加热杀菌：发酵结束，将体系升温90℃，保持30min，杀灭菌体；
(3)冷却：采用薄板冷却器，将上述的发酵液冷却至50℃，并导入脱色罐中，待用；
(4)活性炭处理：采用活性炭脱色，发酵液加入占发酵液质量0.5％的活性炭，保持50℃，搅拌30min进行脱色；
(5)过滤：脱色后的发酵液进行趁热过滤，采用0.22μm钛棒过滤，分离直至滤液澄清；
(6)离心固液分离：将上述澄清液进行离心，3000g离心15min，收集含γ-氨基丁酸的上清液；
(7)离子交换法脱盐：将上述上清液以1.5倍床体积流速流过强酸性离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，待阳离子交换树脂吸附饱和后，然后用纯水洗到中性，用2mol/L稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计；树脂用纯水洗到中性，再用盐酸再生备用；采用离子交换法脱盐法进行纯化，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到9％；
(8)喷射循环真空浓缩：采用外循环式真空浓缩，温度70℃，获得浓缩γ-氨基丁酸溶液，γ-氨基丁酸浓度达到40％；
(9)结晶干燥：γ-氨基丁酸浓溶液加入95％食用酒精，浓溶液与95％食用酒精用量的体积比为1∶7，析出γ-氨基丁酸沉淀结晶，搅拌冷却至室温，离心分离，95％酒精洗涤，甩干，60℃真空干燥6小时，得γ-氨基丁酸结晶，白色至淡黄色粉末或颗粒，纯度为99％。
实施例6
一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法，按照如下步骤进行：
(1)27℃条件下，将希氏乳杆菌在乳酸细菌培养基中培养，180rpm振荡培养30h，获得种子菌液，按照接种量3％，在温度29℃的条件下供气在种子扩大培养基中培养56h，分批流加L-谷氨酸钠至扩大培养发酵液，加入量为扩大培养发酵液质量的5％，同时流加3mol/L的盐酸，控制pH 5.0和反应温度35℃，继续反应4天，即停止反应；
所述乳酸细菌培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，余量为去离子水，培养基总量为1L。
所述种子扩大培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，谷氨酸钠50g，余量为反渗透水，调pH5.5，培养基总量为1L。
(2)加热杀菌：发酵结束，将体系升温90℃，保持30min，杀灭菌体；
(3)冷却：采用薄板冷却器，将上述的发酵液冷却至50℃，并导入脱色罐中，待用；
(4)活性炭处理：采用活性炭脱色，发酵液加入占发酵液质量0.5％的活性炭，保持50℃，搅拌30min进行脱色；
(5)过滤：脱色后的发酵液进行趁热过滤，采用0.22μm钛棒过滤，分离直至滤液澄清；
(6)离心固液分离：将上述澄清液进行离心，3000g离心15min，收集含γ-氨基丁酸的上清液；
(7)离子交换法脱盐：将上述上清液以1.5倍床体积流速流过强酸性离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，待阳离子交换树脂吸附饱和后，然后用纯水洗到中性，用2mol/L稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计；树脂用纯水洗到中性，再用盐酸再生备用；采用离子交换法脱盐法进行纯化，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到8％；
(8)蒸发浓缩：在温度100℃条件下，将步骤(1)得到的γ-氨基丁酸溶液蒸发浓缩2小时，获得浓缩γ-氨基丁酸溶液，γ-氨基丁酸浓度达到35％；
(9)结晶干燥：γ-氨基丁酸浓溶液加入95％食用酒精，浓溶液与95％食用酒精用量的体积比为1∶7，析出γ-氨基丁酸沉淀结晶，搅拌冷却至室温，离心分离，95％酒精洗涤，甩干，60℃真空干燥6小时，得γ-氨基丁酸结晶，灰白色至黄色粉末或颗粒，纯度为85％，不符合食品级γ-氨基丁酸的要求。
Claims (4)
1.一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)26-28℃条件下，将希氏乳杆菌在乳酸细菌培养基中培养，160-220rpm振荡培养24-48h，获得种子菌液，按照接种量1-5％，在温度28-30℃的条件下供气在种子扩大培养基中培养48-72h，分批流加L-谷氨酸钠至扩大培养发酵液，同时流加2-4mol/L的盐酸，控制pH 4.5-6.0和反应温度30-40℃，继续反应3-5天，即停止反应；
(2)加热杀菌：发酵结束，将体系升温80-100℃，保持20-40min，杀灭菌体；
(3)冷却：采用薄板冷却器，将上述的发酵液冷却至40-70℃，并导入脱色罐中，待用；
(4)活性炭处理：采用活性炭脱色，发酵液加入占发酵液质量0.1-1.0％的活性炭，保持40-70℃，搅拌20-40min进行脱色；
(5)过滤：脱色后的发酵液进行趁热过滤，采用0.20-0.24μm钛棒过滤，分离直至滤液澄清；
(6)离心固液分离：将上述澄清液进行离心，2000-4000g离心10-20min，收集含γ-氨基丁酸的上清液；
(7)离子交换法脱盐：将上述上清液以1-2倍床体积流速流过强酸性离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，待阳离子交换树脂吸附饱和后，然后用纯水洗到中性，用2mol/L稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计；树脂用纯水洗到中性，再用盐酸再生备用；采用离子交换法脱盐法进行纯化，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到5-10％；
(8)喷射循环真空浓缩：采用外循环式真空浓缩，温度60-90℃，获得浓缩γ-氨基丁酸溶液，γ-氨基丁酸浓度达到30-40％；
(9)结晶干燥：γ-氨基丁酸浓溶液加入95％食用酒精，浓溶液与95％食用酒精用量的体积比为1∶5-10，析出γ-氨基丁酸沉淀结晶，搅拌冷却至室温，离心分离，95％酒精洗涤，甩干，60℃真空干燥4-8小时，得γ-氨基丁酸结晶，白色至淡黄色粉末或颗粒，纯度95％以上。
2.根据权利要求1所述一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述分批流加L-谷氨酸钠的质量为扩大培养发酵液质量的5％。
3.根据权利要求1所述一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述乳酸细菌培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，余量为去离子水，培养基总量为1L。
4.根据权利要求1所述一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述种子扩大培养基的配方为：鱼蛋白胨或胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钠2.0g，谷氨酸钠50g，余量为反渗透水，调pH5-6.5，培养基总量为1L。
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