CN111662987A - 一种黄颡鱼抗红头病性状相关的snp标记、筛选方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记、筛选方法及应用。本发明基于黄颡鱼基因组信息和混池测序技术分析CypA基因，得到潜在SNP位点，并设计引物扩增验证。将潜在的SNP位点与黄颡鱼红头病进行关联分析发现其中一个SNP具有显著性差异，该SNP位于CypA基因组序列的第528个核苷酸上存在一个等位基因突变(T/C)。该SNP 528T/C在另一个养殖群体的黄颡鱼也存在显著性差异。此外，构建表达黄颡鱼CypA的转基因斑马鱼品系，通过攻毒实验证明了转基因的斑马鱼对鮰爱德华氏菌更具有抗性，进一步说明了黄颡鱼CypA基因的SNP位点与抗黄颡鱼“红头病”的关联的真实有效性。

Description

一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记、筛选方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记、筛选方法及应用。

背景技术

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)隶属于鲇形目，鲿科，黄颡鱼属，是我国重要的淡水经济鱼类之一。近年来，我国科研人员对黄颡鱼生殖调控和品种改良进行了大量研究。黄颡鱼新品种全雄黄颡鱼“全雄1号”和杂交黄颡鱼“黄优1号”的接连问世推动了黄颡鱼产业的发展。但由于高密度集约化水产养殖、水环境污染等因素，导致黄颡鱼各种疾病爆发使养殖户损失惨重。黄颡鱼常见的疾病包括：红头病、腐皮病、腹水病和白点病等。其中，由鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)引起的感染性疾病“红头病”是目前养殖黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)危害较大的疾病之一，具有传染性强、发病率高和死亡率高等特点，已给我国黄颡鱼养殖业造成重大的经济损失(汪开毓等2014)。

亲环素A(Cyclophilin A,CypA)作为亲环素蛋白家族的关键成员，是胞浆中含量最丰富的蛋白质之一(约占细胞总蛋白的0.1～0.4％)(Fischer and Aumüller 2003)，当细胞处于静息状态时，主要位于细胞质中；当发生炎症反应或者受到外界的一些刺激时，才会分泌到细胞外(Jin et al 2000)，能够参与多种生物学过程包括免疫调节、细胞信号传导、转录调节、蛋白质折叠和运输等(Nigro et al 2013)。CypA也发挥着重要的免疫作用，可以诱导炎性细胞因子(IL-1β,TNF-α,IL-8,MMP-2,MMP-9)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的产生，还可以在体外对中性粒细胞以及人和小鼠的白细胞发挥趋化作用(Wang et al2010,Gwinn et al 2006，Obchoei et al 2015)等。

分子标记辅助育种(marker assisted selection,MAS)是与目标基因紧密连锁的分子标记，通过不同个体鉴定的基因型与表型有效结合，从而显著提高育种效率缩短育种周期。SNP(single nucleotide polymorphism)即单核苷酸多态性标记是目前遗传标记研究中最多、最具发展潜力的分子标记，广泛用于鱼类选择育种中。然而，关于黄颡鱼抗病相关SNP未见报道，因此选择有效于黄颡鱼抗病相关性状选育的SNP对黄颡鱼产业的发展至关重要。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记、筛选方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明基于黄颡鱼基因组信息，从CypA基因筛选得到与黄颡鱼抗病相关性状尤其是与黄颡鱼抗鮰爱德华氏菌引起的红头病性状相关的SNP分子标记，为黄颡鱼抗病品种的育种提供有效的遗传标记。另外，通过分子生物学手段以模式生物斑马鱼为材料，构建了表达黄颡鱼CypA的转基因斑马鱼品系，通过攻毒实验证明了转基因的斑马鱼对鮰爱德华氏菌更具有抗性，进一步证实了其功能。

本发明是这样实现的，一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记，所述SNP标记为黄颡鱼CypA基因组序列的第528个核苷酸T或C。

如上述的一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记在黄颡鱼选育中的应用。

如上述的一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记在制备用于检测或治疗黄颡鱼红头病的试剂或试剂盒中的应用。

CypA基因在黄颡鱼选育中的应用。

CypA基因在制备用于检测或治疗黄颡鱼红头病的试剂或试剂盒中的应用。

进一步地，所述红头病由感染鮰爱德华氏菌引起。

一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记筛选方法，包括以下步骤：

将多个个体基因组DNA混池测序；

将目标基因序列与黄颡鱼的参考基因组序列进行比对，分析，初步预测出目标基因中的候选SNP位点；

设计引物扩增黄颡鱼基因组序列中的候选SNPs，并测序、分析候选位点的多态性；

对红头病抗病组和易感组黄颡鱼进行目标基因序列扩增，测序，分析候选位点的多态性，并与混池测序筛选的多态性位点进行关联分析，筛选出重合的多态性位点；

构建表达黄颡鱼目标基因的转基因鱼系，以野生斑马鱼为对照，在转基因鱼系组和野生斑马鱼组内分别设计病菌注射组和对照组，观察黄颡鱼的生命状态，验证目标基因与目标性状的关联性。

进一步地，所述目标基因为CypA基因。

进一步地，所述SNP标记为CypA基因组序列的第528个核苷酸T或C。

如上述的一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记筛选方法在黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记筛选中的应用。

本申请的技术部分主要包括：

(1)黄颡鱼CypA基因结构及SNP位点的筛选。

(2)CypA基因SNPs与黄颡鱼抗鮰爱德华氏菌性状的关联分析。

(3)抗黄颡鱼鮰爱德华氏菌性状关联位点的二次验证。

(4)构建表达黄颡鱼CypA的转基因斑马鱼品系：提取黄颡鱼RNA，逆转录合成cDNA,构建转基因质粒，显微注射，筛选纯化的转基因品系斑马鱼。

(5)鮰爱德华氏菌攻毒试验：通过鮰爱德华氏菌感染实验进行转基因斑马鱼和普通斑马鱼对鮰爱德华氏菌比较。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明通过基于黄颡鱼基因组信息和混池测序技术分析亲环素A(CyclophilinA,CypA)基因快速的得到一些潜在SNP位点，并进一步设计引物PCR扩增验证。将潜在的SNP位点与黄颡鱼红头病进行关联分析发现其中一个SNP具有显著性差异，该SNP位于CypA基因组序列的第528个核苷酸上存在一个等位基因突变(T/C)。该SNP 528T/C在另一个养殖群体的黄颡鱼也存在显著性差异。此外，本申请构建了表达黄颡鱼CypA的转基因斑马鱼品系，通过攻毒实验证明了转基因的斑马鱼对鮰爱德华氏菌更具有抗性，进一步说明了黄颡鱼CypA基因的SNP位点与抗黄颡鱼“红头病”的关联的真实有效性。

与以往传统的SNP分析不同，本发明通过生物信息学手段以黄颡鱼基因组为参考和混池测序为技术支撑，能够快速高效的筛选出黄颡鱼CypA基因潜在的SNP位点。此外，通过转基因技术对该基因的功能进一步抗病验证。进一步说明了黄颡鱼CypA基因的SNP位点与抗黄颡鱼红头病的关联的真实有效性。

附图说明

图1是黄颡鱼CypA基因结构图以及候选SNPs分布；其中，UTR:成熟mRNA分子5'或3'端不被翻译的部分,Exon:外显子，Intron:内含子；

图2是基因型频率在易感与抗性组之间差异显著的SNP位点的测序峰图序列；箭头示CypA-528-T/C突变位点；

图3是CypA-EGFP转基因斑马鱼；其中，(A)在不同发育阶段观察EGFP信号。EGFP信号普遍存在；(B)通过PCR检测外源性基因CypA-EGFP mRNA表达；以7-dpf幼鱼中的cDNA为模板进行PCR扩增，其中在TG-CypA-1和TG-CypA-2中检测到PCR信号，但在野生斑马鱼中未检测到PCR信号；

图4是野生斑马鱼和转基因斑马鱼感染鮰爱德华氏菌后的生存曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记、筛选方法及应用，具体如下各实施例所示。

实施例1

1、黄颡鱼CypA基因结构及SNP位点的筛选

CypA基因中SNP位点的筛选主要由DNA混池测序初步预测和个体验证两部分组成，具体步骤如下：

(1)在黄颡鱼的攻毒实验前，随机从选自湖北省仙桃市的雄性黄颡鱼中选取30尾，剪取尾鳍，使用酚-氯仿法提取鳍条样品基因组DNA，并检测提取的DNA的质量。

(2)将30个个体的基因组DNA等量混合后，送北京诺禾致源科技股份有限公司进行建库测序。其中质检合格的文库在Illumina HiSeq-PE150平台进行测序。下机之后，对下机数据进行质量控制，过滤其中低质量的数据，获得高质量的数据(Clean Data)。

(3)使用带有默认参数的BWA软件(Li and Richard 2009)将CypA基因序列比对到黄颡鱼的参考基因组序列上(Gong et al 2018)，并通过基因组分析工具包(GATK 4.0)进行SNP检测(Mckenna et al 2010)。经检测分析，初步预测出CypA基因中的候选SNP位点。

(4)为进一步验证CypA基因中预测的候选SNP，采用Primer5软件设计3对引物用于SNPs的特异性扩增，引物序列详细信息见表1，其中Cypa-SNP-F1/R1用于489bp(G/A)位点和528bp(T/C)位点的扩增与分型。Cypa-SNP-F2/R2用于1917bp(T/C)位点的扩增与分型。Cypa-SNP-F3/R3用于2662bp(T/C)位点。并随机选择20条个体的DNA为模板，进行PCR的扩增条件如下。扩增所得PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至擎科生物有限公司直接测序，使用BioEdit软件对PCR产物测序结果进行分析。

表1 SNP位点的特异性扩增和基因分型的引物信息

1)PCR扩增反应体系如下：

2)PCR扩增反应条件如下：

2、CypA基因SNPs与黄颡鱼抗鮰爱德华氏菌性状的关联分析

(1)人工感染及样品收集

为获得黄颡鱼的抗病和易感群体，将选自湖北省仙桃市的雄性黄颡鱼随机分为2组，其中实验组(n＝560)经MS-222(Sigma)麻醉处理后，腹腔注射100μL 3.2×10⁷CFU/mL鮰爱德华氏菌的细菌稀释液，对照组(n＝40)腹腔注射100μL 0.65％NaCl溶液。感染后，连续14d，每天观察记录黄颡鱼的发病和死亡情况，并及时收集死亡鱼体。将最先死亡并具有明显病症的50条黄颡鱼作为易感组，14d仍存活或最后几天死亡的50条黄颡鱼作为抗性组。对于易感个体，根据死亡先后顺序编号；对于抗病个体，依次编号。分别采集易感组和抗病组个体的鳍条，放入无水乙醇中保存，于–20℃冰箱中保存备用。

(2)基因组DNA提取

1)取适量尾鳍置于2mL离心管中，待乙醇挥发后，用小剪刀将其剪碎。

2)向离心管中加入500μL抽提缓冲液和10μL 1mg/mL蛋白酶K，充分混匀后置于55℃水浴直至组织完全消化(约8h，期间每隔15min摇晃离心管以加快消化速度)。

3)向上述离心管中加入500μL平衡酚(pH＝8.0)，颠倒混匀20min后，然后放入4℃冷冻离心机中，10000r/min离心10min。

4)用枪头轻轻吸取上清液，转入新的2mL离心管中，加入平衡酚和氯仿各250μL，颠倒混匀20min后，然后放入4℃冷冻离心机中，10000r/min离心10min。

5)重复操作步骤4，即用平衡酚和氯仿抽提两次。

6)用剪口的枪头轻轻吸取上清液，转入新的2mL离心管中，加入500μL氯仿/异戊醇(体积比24:1)，颠倒混匀20min后，然后放入4℃冷冻离心机中，10000rpm/min离心10min。

7)用剪口的枪头轻轻吸取上清液，转入新的2mL离心管中，加入1mL无水乙醇(-20℃预冷)沉淀DNA，上下颠倒摇晃约10min至絮状DNA形成。

8)用牙签挑取絮状DNA于新的2mL离心管中，开盖静放，待酒精挥发后(约10-20min)依据絮状大小加入100-300μL TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存。

(3)DNA的质量检测

取2μL的基因组DNA用1％琼脂糖凝胶进行电泳，用紫外凝胶成像***观察DNA是否降解及是否含有蛋白质残留。另外，将提取的DNA样品用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计测定其浓度，并以测得DNA浓度为参考，将DNA工作液稀释为50ng/μL。

3、与性状关联位点的二次验证

为了进一步验证与性状相关联位点的可靠性，本申请中对另一独立种(n＝550，40-60g)的雄性黄颡鱼进行了攻毒试验，该种群采集自湖北省武汉市江夏区的养殖场。其感染和分类方法同上所述。将新获得的易感组和抗病组的DNA样品用前述方法进行分型，并用SPSS 13.0进行卡方检验验证显著性关联位点的可靠性。

实验结果：

本申请本实施例中采集了黄颡鱼CypA基因序列的信息，CypA基因定位在黄颡鱼的20号染色体上，整个基因组包含5个外显子(长度分别为69、31、115、173、133bp)和4个内含子(长度分别为1925、92、64、340bp)，cDNA的长度为1056bp。黄颡鱼CypA基因的结构图如图1所示。根据混池测序的数据分析结果，本申请本实施例中初步筛选出了6个候选SNP位点。为了验证这6个候选位点，设计了三对引物扩增了CypA基因，并通过对以易感和抗病组中各随机选择10个个体的DNA为模板，进行的PCR扩增产物直接测序、分析，确认了所有候选位点均具多态性。在筛选出的6个SNP位点中，有4个位于内含子，其中3个位于第一内含子上，1个位于第四内含子上。此外有2个同义SNPs位于第五外显子，其具体情况如图1。

通过对第一次的人工感染实验中(仙桃市，n＝560)获得的易感组和抗病组的个体进行基因分型和统计分析后发现，在易感组和抗病组中只有位于528T/C位点的SNP存在显著差异。对于该位点在抗病组中检测到三种基因型CC，TC和TT的频率分别为22％，54％和24％，而易感组的基因型频率分别为10％，44％和46％(表2)。528T/C位点的基因型频率和等位基因的频率在易感组和抗病组中差异显著(P<0.05)，该位点的测序峰图如图2，基因型由上往下依次为TT、TC、CC。

表2 CypA核酸多态性位点基因型分布

为探讨位于528T/C的位点的多态性与鮰爱德华氏菌抗性/易感性状之间的关系是否具有普遍性，本申请在另一个独立群体(武汉市，n＝510)中，进行了第二次的人工感染实验。统计分析发现，抗病组CC、TC和TT基因型频率分别为20％、64％和16％，易感组的基因型频率分别为2％、72％和26％(表3)。528T/C位点的基因型频率和等位基因的频率在易感组和抗病组中同样有差异显著(P<0.05)。这些结果进一步证实了位于528T/C单核苷酸多态性与黄颡鱼对鮰爱德华氏菌的抗性之间存在显著的相关性。

表3验证实验中SNPs与抗病/易感性状的关联性分析

实施例2转基因斑马鱼系攻毒实验

1、构建表达黄颡鱼CypA的转基因斑马鱼品系

(1)表达质粒的构建

1)提取黄颡鱼RNA，通过试剂盒逆转录为cDNA备用。

2)从NCBI上获取黄颡鱼CypA的ORF序列，利用Primer 5.0软件设计引物，并在上游引物和下游引物中分别引入XmaI酶切位点。

CypA的ORF扩增引物

1)PCR扩增反应体系同上

2)PCR扩增反应条件如下：

3)PCR扩增目的条带，用试剂盒回收PCR产物；

4)将PCR产物与pTol2-EGFP载体分别使用XmaI进行酶切，并对酶切产物进行纯化回收；

将上述酶切反应体系混匀(在冰上操作)，于37℃水浴中消化3-4h。

酶切反应结束后，取1μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认是否酶切完全。酶切完全后，将酶切产物离心10s，65℃水浴20min使酶失活，各取2μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，其余样品置于4℃待用。

5)用T4连接酶，按照通用方法将酶切、回收后的载体和目的条带进行连接，转化进入DH5a感受态细胞，37℃培养；

6)挑选阳性克隆，进行菌液PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测后将阳性克隆送往公司测序；

1)PCR扩增反应体系如下：

2)PCR扩增反应条件如下：

7)取已测序验证正确的阳性克隆菌液，扩大培养，利用试剂盒提取pTol2-CypA-EGFP质粒，测定浓度后-20℃保存备用。

(2)显微注射

显微注射胚胎盛放板的制备：用40mL去离子无菌水配置1.5-2％的琼脂溶液，微波炉煮沸后，导入水平放置的90mm一次性平皿中，厚度约为平皿高度的1/2-2/3。待琼脂液面静止后将PVC有机玻璃模具倒置于琼脂糖液面上，待其完全冷却凝固后，小心取出模具，得到显微注射胚胎盛放板。

显微注射针的制备：显微注射针制作原材料选用World Precision Instruments直径1mm玻璃管。将玻璃管两端牢固地固定在拉针仪上，拉针仪熔断温度(HEAT)、拉力(PULL)、负拉力(VEL)以及时间(TIME)依次设置为：507℃，60，80，130ms。在体视显微镜高倍镜下，将拉好的显微注射针均匀变细前端切断，使切口成斜面状。

斑马鱼繁殖的准备：显微注射前天晚上，将野生斑马鱼放入繁殖盒内，雌、雄鱼用透明PVC塑料板隔开，雌、雄比例为2：3。第二天，有光照后，抽开PVC塑料隔板，让雌、雄斑马鱼自由交配30min。

样品的准备及导入：参照Dan等人的方法，利用SP6 mMessage mMachine kit(Ambion)在体外合成了Tol2转座子mRNA(Dan et al 2018，A novel PDZ domain-containing gene is essential for male sex differentiation and maintenance inyellow catfish(Pelteobagrus fulvidraco))。将制备好的显微注射针放置在显微镜下进行破针，调节好显微注射仪的参数后将线性化的pTol2-CypA-EGFP质粒(50ng/L)和转座子mRNA(20ng/L)吸入针管内。

注射：收集刚受精的斑马鱼胚胎，放在制备好的琼脂糖凹槽中固定，调整好显微注射仪的参数，在显微镜下将样品注射到胚胎的细胞中，注射时间控制在胚胎受精后40-50min(胚胎1-细胞期之前)完成，注射量控制在1nL左右。注射后的斑马鱼受精卵放入90mm一次性培养皿，并加入配置好的亚甲基蓝溶液，28.5℃环境下培养并及时观察胚胎发育情况，清除死卵。

(3)转基因斑马鱼系的筛选

将显微注射后的斑马鱼胚胎，在荧光显微镜下筛选EGFP表达较好的作为F0代，并在循环***中将F0代培养至性成熟。

将性成熟的F0代嵌合体与野生型斑马鱼交配，在荧光显微镜下筛选了能够表达EGFP阳性F1代的转基因株系，并在循环***中将F1代培养至性成熟。

根据是否产生显著的绿色荧光，将F1代性成熟个体分别雌雄交配产生F2代；并将培育至性成熟的F2代个体与野生型斑马鱼交配，在荧光显微镜下筛选出后代胚胎全部具有绿色荧光的F2代纯合转基因斑马鱼，雌雄分开，单独饲养。

将筛选后的F2代纯合转基因斑马鱼雌雄个体交配获得的F3代纯合子。本发明本实施例中所有实验所用到的转基因斑马鱼成鱼及胚胎均为F3代纯合子。最终筛选两种荧光信号不同的转基因斑马鱼(TG-CypA-1和TG-CypA-2)用于攻毒试验。

2、人工感染

预实验：为了确定正式实验中最佳的细菌浓度，用无菌的0.65％NaCl溶液将已测出浓度的鮰爱德华氏菌细菌悬液细菌稀释至1.0×10⁷，1.0×10⁶和1.0×10⁵CFU/mL。将暂养的野生斑马鱼随机分成4组(感染试验3组和对照试验1组)，每组16尾(每组3个重复)。感染组腹腔注10μL经0.65％NaCl溶液稀释后的不同浓度的细菌稀释液，对照组注射10μL0.65％NaCl溶液，养殖条件与暂养条件保持一致。攻毒后每3个小时观察其活动状态并记录死亡情况，并计算半数致死量(LD50)，以此来确定斑马鱼的正式攻毒实验的剂量。

正式实验：将暂养的野生斑马鱼和已筛选纯化的两种荧光信号不同的转基因斑马鱼(TG-CypA-1和TG-CypA-2)分别随机分成2组(对照组和实验组)，每组各设两个平行，每个平行40尾。其中实验组腹腔注射10μL 1.0×10⁶CFU/mL E.ictaluri的细菌稀释液，对照组注射10μL 0.65％NaCl溶液，感染后，连续24d，每3个小时观察其活动状态并记录死亡情况观察记录。

实验结果：

为了解转基因斑马鱼中EGFP基因的表达情况，本发明本实施例中以F3代转基因斑马鱼为研究对象，在荧光显微镜下检测胚胎发育各时期的EGFP信号。结果发现转基因斑马鱼从单细胞期到成体期均有EGFP的表达，TG-CypA-1的荧光亮度稍强于TG-CypA-2(图3A)，这说明TG-CypA-1中EGFP基因的表达量稍多于TG-CypA-2。而EGFP早在单细胞期就已表达，这表明该转基因表达为母系遗传。此外，为了检测外源性CypA-EGFP mRNA的表达情况，本申请本实施例中分别以TG-CypA-1，TG-CypA-2和WT斑马鱼7-dpf的幼鱼的cDNA为模板进行PCR扩增。通过观察PCR产物琼脂糖凝胶电泳图发现：CypA-EGFP的mRNA仅在两种转基因斑马鱼系中检测到，在WT斑马鱼中未检测到(图3B)，这说明CypA-EGFP融合蛋白在转基因斑马鱼系中得到表达。

CypA的检测引物

1)PCR扩增反应体系同上所述：

2)PCR扩增反应条件如下：

正式实验中，通过对实验组和对照组为期24d的观察和统计分析后发现，实验组中无论是转基因斑马鱼亦或WT斑马鱼均在感染4-5d后开始死亡，其中TG-CypA-1((42.5％)和TG-CypA-2(40％)的成活率明显高于WT斑马鱼(5.0％)，而对照组大部分鱼未感染(结果见图4)。攻毒实验的结果表明，转基因斑马鱼系表现出了对于鮰爱德华氏菌感染的抗性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记、筛选方法及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Cypa-SNP-F1)

<400> 1

ttgtacgcag cctcgcgt 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Cypa-SNP-R1)

<400> 2

ggtcaaggca agcctgagat g 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Cypa-SNP-F2)

<400> 3

tcaggtatta ggtatccacc ct 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Cypa-SNP-R2)

<400> 4

caacagcgat tcagagcc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Cypa-SNP-F3)

<400> 5

agggtttcgg ctacaagg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Cypa-SNP-R3)

<400> 6

gccacagtca gcgatggt 18

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Cypa-F1)

<400> 7

ccccccggga tggccaaacc cagagtgtt 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Cypa-R1)

<400> 8

tccccccggg caagttggcc acagtcagcg 30

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(CypA-EGFP-F)

<400> 9

caaacaccaa tggctcaca 19

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(CypA-EGFP-R)

<400> 10

tcctcgccct tgctcac 17

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(β-actin-F)

<400> 11

cgagcaggag atgggaacc 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(β-actin-R)

<400> 12

caacggaaac gctcattgc 19

Claims (10)

1.一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记，所述SNP标记为黄颡鱼CypA基因组序列的第528个核苷酸T或C。

2.如权利要求1所述的一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记在黄颡鱼选育中的应用。

3.如权利要求1所述的一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记在制备用于检测或治疗黄颡鱼红头病的试剂或试剂盒中的应用。

4.CypA基因在黄颡鱼选育中的应用。

5.CypA基因在制备用于检测或治疗黄颡鱼红头病的试剂或试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述红头病由感染鮰爱德华氏菌引起。

7.一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

将多个个体基因组DNA混池测序；

将目标基因序列与黄颡鱼的参考基因组序列进行比对，分析，初步预测出目标基因中的候选SNP位点；

设计引物扩增黄颡鱼基因组序列中的候选SNPs，并测序、分析候选位点的多态性；

对红头病抗病组和易感组黄颡鱼进行目标基因序列扩增，测序，分析候选位点的多态性，并与混池测序筛选的多态性位点进行关联分析，筛选出重合的多态性位点；

构建表达黄颡鱼目标基因的转基因鱼系，以野生斑马鱼为对照，在转基因鱼系组和野生斑马鱼组内分别设计病菌注射组和对照组，观察黄颡鱼的生命状态，验证目标基因与目标性状的关联性。

8.根据权利要求7所述的一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记筛选方法，其特征在于：所述目标基因为CypA基因。

9.根据权利要求8所述的一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记筛选方法，其特征在于：所述SNP标记为CypA基因组序列的第528个核苷酸T或C。

10.如权利要求7-9任一所述的一种黄颡鱼抗红头病性状相关的SNP标记筛选方法在黄颡鱼红头病性状相关的SNP标记筛选中的应用。

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