CN107475415A - 一种筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法及其相关的snp引物对 - Google Patents

一种筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法及其相关的snp引物对 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法及其相关的SNP引物对。通过486个个体的全基因组关联分析，鉴定出位于长牡蛎6号染色体上的67个与糖原含量显著相关的SNP信号。针对该区域scaffold1243_53489碱基处的1个SNP位点，开发了其相应的检测方法，结果表明利用该方法可以简单迅速检测该SNP位点。同时该位点CC基因型个体相比较于TT基因型个体。筛选CC基因型的亲贝，指导牡蛎育种。所述长牡蛎该位点上下游500kb的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明有益效果在于苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定，提高子代糖原含量。本研究结果获得SNP标记可信度更高，效果更稳定。

Description

一种筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法及其相关的SNP引 物对
技术领域
本发明属于基因工程与遗传育种领域，涉及到一种筛选长牡蛎糖原含量相关的SNP标记的引物对及其应用。
背景技术
牡蛎是一种重要的海洋水产资源，也是世界上最重要的海水养殖贝类之一。我国的牡蛎养殖规模和产量多年都稳居世界首位，但牡蛎出口的平均价格仅为其他国家牡蛎产品的1/3。这说明我国牡蛎大多只能自产自销，难以进入高端市场。提高我国养殖牡蛎的经济效益，实现产业由高产低效向高产高效模式的转型升级，提高牡蛎的产品品质是亟需解决的问题。而糖原等营养物质的含量高是牡蛎最主要的特色之一。糖原的含量不仅影响牡蛎肥满度和产量，同时作为鲜味主要呈味物质，影响着牡蛎消费口感，直接决定了牡蛎产品品质。进行糖原等营养品质性状的遗传改良是解决我国牡蛎产业高产低效现状的重要途径。
水产动物育种研究起步晚，目前主要集中于对生长性状的研究，方法大多采用传统的选择，杂交，周期长，见效慢。对长牡蛎的品质性状研究还不多见。近些年来，基因组学发展，分子标记辅助选育以及全基因组选择等育种技术也得到了迅猛发展，大大提高了牡蛎的遗传育种水平，不但使糖原等复杂品质性状的育种成为可能，同时也将显著的提升性状的选育效率和精度。同时利用分子标记辅助选择可以减少盲目性，缩短育种年限，提高育种的效率。而目前利用全基因组测序获得分子标记的方法主要包括QTL定位及全基因组关联分析的方法。虽然QTL定位方法能够快速定位与性状相关联的染色体区段，在性状解析方面具有准确度高的特点。但其基于有限减数***的连锁分析，定位的基因组大片段的区域都连锁在一起，很难精确定位。而全基因组关联分析方法则能够克服这一缺点，在全基因组范围内对遗传变异基因进行总体关联分析，将关联位点定位于很小的区间内，显著提高了定位的准确度和精度，尤其适用于复杂性状的遗传解析。近年来，随着非模式生物全基因组测序的完成，应用GWAS方法研究复杂数量性状基因定位已成流行趋势。
尽管GWAS在作物和畜禽的农业生物研究中发挥了重要作用，但在水产动物中还仅有少量报道。如在大西洋鲑品质研究中，利用5,650个SNP标记对鱼片脂肪含量进行了关联分析。而目前已报道的水产动物，尤其是双壳贝类关联分析研究主要集中在候选基因方面。但是这种方法是根据先验信息，在已知的功能基因上进行多态性位点的开发，标记相对数目不多，不一定能获得主效位点，且无法对表型的遗传调控机制有一个全面的认识。随着长牡蛎全基因组测序的完成以及高密度遗传连锁图谱的获取，使得进行GWAS分析成为可能。本发明基于长牡蛎基因组，通过二代测序技术进行全基因组重测序，并针对糖原含量进行全基因组关联分析，获得控制糖原含量的主效多态性位点及关键基因。本发明在全基因组重测序基础上，开发海量SNP标记，解析决定牡蛎糖原含量的遗传基础，筛选出与糖原含量极显著相关的一簇SNP标记，用于糖原表型的筛选。与以往开发的SNP位点相比，GWAS获得的SNP信号可信度更高，同时具有简便，可移植性强的特征。
发明内容：
本发明的目的是提供一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记，为长牡蛎的分子标记辅助选择提供参考。
具体的获取SNP方法如下：(1)实验材料的收集及同质化驯养：收集486个长牡蛎野生个体，进行同质化养殖。(2)表型数据的测定：利用蒽酮比色发对不同长牡蛎个体进行糖原含量测定。(3)基因分型：采用二代测序技术平台，对486个牡蛎进行全基因组重测序，筛查SNPs位点并进行个体分型，获得用于关联分析的有效SNPs位点，构建牡蛎的单倍型图谱。(4)关联分析：利用混合线性模型进行全基因组关联分析，获得与性状显著关联的67个SNP位点(P-value<10-6)，位于长牡蛎基因组scaffold 1243的16,015-67,096kb范围内。通过LDblock分析，67个SNP位点紧密连锁(LD＞0.7)。全基因组关联分析曼哈顿图见附图2。随后选取位于scaffold1243_53,489kb上的碱基，P-value为2.67×10-7，作为本项目候选SNP位点。该位点存在T和C两个碱基形式。位于scaffold 1243的16,015-67,096kb范围内的其它66个SNP位点都应用相同的鉴定方法。
本发明通过以下技术方案得以实现：
一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记：该标记位于长牡蛎基因组scaffold1243_53,489kb的碱基处，此碱基存在T和C两个碱基形式。所述该位点上下游500kb的序列如SEQID No.1所示。主要检测步骤如下：
1)提取长牡蛎基因组DNA，使用灭菌水或TE缓冲液稀释到10-20ng/uL；
2)取步骤1)中所述长牡蛎基因组DNA为模板，利用引物F和R配制反应体系：基因组DNA 1uL，通用PCR mix 5uL，引物F和R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL(若基因组DNA浓度≤5ng/uL，可加4.6uL基因组DNA而不加灭菌双蒸水。另反应体系可同比放大)；
3)PCR扩增的反应程序为：
用于上述PCR扩增的正反向引物序列为：
F：5’-TAGTATTAAGGCACATGCCG-3’；
R：5’-ATGATGTTTACTTGTTTGCTTG-3’。
4)步骤3)所述的PCR反应结束后，加入饱和荧光染料Lcgreen及内标(等量混合的高温内标和低温内标，即两条具有不同GC含量的双链寡核苷酸，高、低温内标终浓度分别为2.5uM)各1uL，经过95℃退火5-10min；
5)待步骤4)所述的退火后自然降温至室温，进行高分辨率熔解曲线分析，鉴定待测样本中所述长牡蛎SNP标记的基因型，具体方法为：
a)利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正；
b)对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群，若熔解曲线求导图为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃则SNP基因型为CC，若熔解曲线求图为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃则SNP基因型为TT，若熔解曲线求导后为双峰则SNP基因型为TC；
c)判断每个待测样本所述长牡蛎SNP标记基因型。
SNP基因型鉴定时所需的高、低内标序列，其中，高温内标序列为：
低温内标序列为：
获得内标的具体方法为：
1)委托公司合成四条寡核苷酸单链：
GWNB+：5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’
GWNB-：5’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-3’
DWNB+：5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’
DWNB-：5’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-3’
2)用灭菌双蒸水溶解四条单链核苷酸使终浓度为10uM；
3)等体积混合四条单链核苷酸，得到高、低温内标终浓度分别为2.5uM的内标。
与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记的潜在应用：到目前为止，除本专利外，在牡蛎中，尚未有基于全基因组关联分析开发SNP标记的报道。本研究结果相对于以往单个SNP标记的开发，可信度更高，适应群体的范围更广，效果更稳定。在苗种繁育前，通过非致死性取样提取牡蛎基因组DNA，利用如上述所述的SNP标记及其鉴定方法判断亲贝基因型，通过筛选CC基因型亲贝有效提高后代长牡蛎糖原含量。本发明提供根据PCR产物熔解曲线判定SNP基因型的方法，如图1所示，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃时SNP基因型为CC，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃时SNP基因型为TT，当熔解曲线求导后为双峰时SNP基因型为TC。
附图说明
1.图1是上述包含的scaffold1243_53,489位点的PCR产物熔解曲线求导图；2.图2是上述长牡蛎糖原含量全基因组关联分析的曼哈顿图。
具体实施方式：
以下结合实施例来进一步阐释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1：
a)样品的采集：采集胶南同时孵苗的野生群体288个个体，对其进行解剖，取闭壳肌和剩余组织，用液氮速冻后于-80℃保存备用。
b)DNA的提取：提取288个样本的基因组DNA并使用紫外吸光光度法测定浓度，根据测定浓度使用灭菌水将基因组DNA稀释至10ng/uL；
c)SNP位点基因型检测：取步骤1)中稀释的基因组DNA作为模板，使用引物F和R进行PCR扩增，反应体系如下：基因组DNA 1uL，引物F和R各0.2uL，PCR mix 5uL，灭菌双蒸水3.6uL；
PCR扩增的反应程序为：
所述的PCR反应结束后，加入饱和荧光染料Lcgreen及内标各1uL，经过95℃℃退火8min；
正向引物为F：5’-TAGTATTAAGGCACATGCCG-3’；
反向引物为R：5’-ATGATGTTTACTTGTTTGCTTG-3’；
反应结束后加入1μl内标(内标同上)和1μl LC-green染料，瞬时离心后95℃变性10min，冷却至室温。
退火后自然降温至室温，进行高分辨率熔解曲线分析，鉴定待测样
a)利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正；
b)对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃时SNP基因型为CC，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃时SNP基因型为TT，当熔解曲线求导后为双峰时SNP基因型为TC。
c)判断每个待测样本所述长牡蛎SNP标记基因型。
SNP基因型鉴定时所需的高、低内标序列，其中，
高温内标序列为：
低温内标序列为：
获得内标的具体方法为：
1)委托公司合成四条寡核苷酸单链：
GWNB+：5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’
GWNB-：5’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-3’
DWNB+：5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’
DWNB-：5’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-3’
2)用灭菌双蒸水溶解四条单链核苷酸使终浓度为10uM；
3)等体积混合四条单链核苷酸，得到高、低温内标终浓度分别为2.5uM的内标。
d)HRM分型:取出96孔PCR反应板放入LightScanner 96机器进行HRM检测，收集55℃-95℃之间的荧光信号，运行完毕根据熔解曲线进行结果分析，统计每个个体的基因型。
e)结果分析:检测后，仅有第102个个体基因型为C/C，136个个体基因型为T/C，49个个体基因型为T/T，1个个体基因型为NN。
f)糖原含量的检测及关联分析：利用蒽酮比色法检测288个野生个体的糖原含量。图中数据显示，不同基因型糖原含量的顺序为CC>TC>TT。CC基因型糖原含量相较于TT型，糖原含量显著提高8.6％。所以，该位点的分型与糖原含量是显著关联的。育种中通过筛选CC型个体，可以显著提高后代糖原含量。
表1：288个个体糖原含量和基因分型分析。
序列表(1)SEQ ID NO.1的信息序列特征长度：1001bp
类型：核酸
链型：单链
拓扑结构：线形
分子类型：DNA
来源：长牡蛎
序列描述：
AATATTCAAATACATGTATATGATGCAAGTTTTCTTCTTTATGCTACATCTTACATA
CAACACATGAACATACACTGCAGATAAATGCAGAATGAGTGATTTTCCCTGTTTTGTGAATTCTTTGACATGCAGAAATATTAGAGTTATTTCCCTTTTAACACAAGATATTCTTGTACAAAAGAGGACTCCGAATGTCTCCTTTGTGGTCTCTTTTTTGTGCATTCAAATTCTCTTTTTGATGGTATGGTCATATTATAAGTATAGATACCACTTAGGAAATGCATCAAAACATGATAAAGATATGGCAAAATTAAAATATTTCAAGACAAGATTAATTTATGACATGGAAAACATCTGTTCAGTTAAATAATATTTTAATTTGGTTTTTGATGCAACGTTCAAGTCTGAGATATTTATTAACAGGTATGGAACCACAATGGAAACACACATGAAGAATTTAGTATTAAGGCACATGCCGCCCAATTTACAAACTATGGACTTCAAGCAAACAAGTAAACATCATATCCTTAACCAGTTACTTTCAACTAAATGTTATCATTTGACTTTTATCCCAATTTTAAAGAGTCAGTTTGAAAATGAAAATTTTCAGTAATCTGCTTCTCTTCGTCAACAGCAATCCGCCCTAACTTGGACAGTTACGTGTTCCTGCGTGTGAACGAGGACACTGACGGAGTTCTAGTGGAGGAGGAAACGTTAGACACGGGGTGAGTTATCCTGATGACACACGTGTGTATGTAGCCGACTTACTGTACAGGAAATGTACACGTCAAGGATTTAATTTCCTGAAGTTTGTGTAGAGAAGTCTGATGAATACCGGTACATGATGAAGTCTGTTTCGTGGGAATTATATTTCATTGCCTGCACATTTATACAATTTGATTCTCTTGATTTATTCTGTTTTTTAAAATGGGGCCAATGTCATATAAATTATATGTATAACCCAACAATAACTTTAATATCATTGTTGTAAAATATTAACA。
通过486个个体的全基因组关联分析，鉴定出位于长牡蛎6号染色体上的67个与糖原含量显著相关的SNP信号。针对该区域scaffold1243_53489碱基处的1个SNP位点，开发了其相应的检测方法，结果表明利用该方法可以简单迅速检测该SNP位点。同时该位点CC基因型个体相比较于TT基因型个体，糖原含量显著提高8.6％。后续可以通过该方法，筛选CC基因型的亲贝，指导牡蛎育种。所述长牡蛎该位点上下游500kb的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供了一个与长牡蛎糖原含量显著相关的SNP标记及其潜在应用，其有益效果在于可以在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定，提高子代糖原含量。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法及其相关的SNP引物对
<141> 2017-09-20
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1001
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1001)
<400> 1
aatattcaaa tacatgtata tgatgcaagt tttcttcttt atgctacatc ttacatacaa 60
cacatgaaca tacactgcag ataaatgcag aatgagtgat tttccctgtt ttgtgaattc 120
tttgacatgc agaaatatta gagttatttc ccttttaaca caagatattc ttgtacaaaa 180
gaggactccg aatgtctcct ttgtggtctc ttttttgtgc attcaaattc tctttttgat 240
ggtatggtca tattataagt atagatacca cttaggaaat gcatcaaaac atgataaaga 300
tatggcaaaa ttaaaatatt tcaagacaag attaatttat gacatggaaa acatctgttc 360
agttaaataa tattttaatt tggtttttga tgcaacgttc aagtctgaga tatttattaa 420
caggtatgga accacaatgg aaacacacat gaagaattta gtattaaggc acatgccgcc 480
caatttacaa actatggact tcaagcaaac aagtaaacat catatcctta accagttact 540
ttcaactaaa tgttatcatt tgacttttat cccaatttta aagagtcagt ttgaaaatga 600
aaattttcag taatctgctt ctcttcgtca acagcaatcc gccctaactt ggacagttac 660
gtgttcctgc gtgtgaacga ggacactgac ggagttctag tggaggagga aacgttagac 720
acggggtgag ttatcctgat gacacacgtg tgtatgtagc cgacttactg tacaggaaat 780
gtacacgtca aggatttaat ttcctgaagt ttgtgtagag aagtctgatg aataccggta 840
catgatgaag tctgtttcgt gggaattata tttcattgcc tgcacattta tacaatttga 900
ttctcttgat ttattctgtt ttttaaaatg gggccaatgt catataaatt atatgtataa 960
cccaacaata actttaatat cattgttgta aaatattaac a 1001

Claims (5)

1.一种筛选高糖原含量长牡蛎亲贝相关的SNP引物对，其特征在于：
正向引物为F：5’-TAGTATTAAGGCACATGCCG-3’；
反向引物为R：5’-ATGATGTTTACTTGTTTGCTTG-3’。
2.一种如权利要求1所述的筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法，其特征在于：
通过全基因组关联分析获得一个SNP标记，其位于长牡蛎基因组scaffold1243_53,489kb碱基处；该位点存在T和C两个碱基形式，在苗种繁育前对亲贝进行该SNP标记位点基因型鉴定，不同基因型糖原含量的顺序为CC>TC>TT，通过筛选该位点CC基因型的亲贝，提高后代群体的糖原含量，
包括步骤如下：
(1)所述长牡蛎基因组的提取，具体为提取长牡蛎基因组DNA，使用灭菌水或TE缓冲液稀释到10-20ng/uL；
(2)所述长牡蛎基因组DNA为模板，配制反应体系：基因组DNA1uL，通用PCR mix 5uL，引物F和R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL；所述反应体系可同比放大；
(3)PCR扩增的反应程序为：
(4)所述的PCR反应结束后，加入饱和荧光染料Lcgreen及内标各1uL，经过95℃-98℃退火5-10min；
(5)退火后自然降温至室温，进行高分辨率熔解曲线分析，鉴定待测样
a)利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正；
b)对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃时SNP基因型为CC，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃时SNP基因型为TT，当熔解曲线求导后为双峰时SNP基因型为TC。
c)判断每个待测样本所述长牡蛎SNP标记基因型。
3.根据权利要求2所述的筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法，其特征在于：
所述步骤(5)中，内标为等量混合的高温内标和低温内标，即两条具有不同GC含量的双链寡核苷酸，高、低温内标终浓度分别为2.5μM。
4.根据权利要求3所述的筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法，其特征在于：
SNP基因型鉴定时所需的高、低内标序列，其中，
高温内标序列为：
低温内标序列为：
5.根据权利要求3所述的筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法，其特征在于：
获得内标的具体方法为：
1)委托公司合成四条寡核苷酸单链：
GWNB+：5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’GWNB-：5’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-3’DWNB+：5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’DWNB-：5’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-3’2)用灭菌双蒸水溶解四条单链核苷酸使终浓度为10uM；
3)等体积混合四条单链核苷酸，得到高、低温内标终浓度分别为2.5uM的内标。
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