CN104447978A - 重组鸡干扰素α及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组鸡干扰素α及其制备方法，所述鸡干扰素α目的基因为序列表400<1>所示序列，具体步奏如下：(1)获取鸡干扰素α基因；(2)重组质粒的构建；(3)基因工程菌株的构建；(4)重组蛋白的表达；(5)重组鸡干扰素α的发酵生产；(6)重组鸡干扰素α的生物学活性测定；其制备方法将基因工程菌株作用于发酵合成，获得的重组鸡干扰素α是无毒、无害、无残留的生物制品，具有明显的抗病毒活性，为我国禽类健康保驾护航，为食品安全提供绿色保障。

Description

重组鸡干扰素α及其制备方法

技术领域

本发明涉及禽畜药物生产技术领域，尤其是重组鸡干扰素α及其制备方法。

背景技术

干扰素(Interferon,IFN)是1957年，英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研究人员JeanLindenmann在利用鸡胚绒毛***研究流感干扰现象时发现的，被病毒感染的细胞产生一种能作用于其他细胞并干扰病毒复制的因子，故将其命名为干扰素。1963年Lampson等纯化了这种因子，证明其分子量为20～34KD的蛋白质。之后研究者对人类及哺乳类动物的干扰素进行了大量的研究，取得了突破性的进展。研究表明干扰素是一类能诱导人及动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的类激素蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学活性。1980年，国际干扰素命名委员会指出：干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒功能的活性蛋白，其活性的发挥又受细胞基因的调节和控制,涉及RNA和蛋白质的合成。干扰素在医学上更为详细的定义是由病毒和其他种类的干扰素诱导剂，刺激网状内皮***、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白。

哺乳动物干扰素分为Ⅰ型和Ⅱ型干扰素，Ⅰ型干扰素又主要包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω和IFN-τ，他们具有相似的结构并享用同一类受体。前三种主要是对病毒感染的应答产生的，能诱导机体产生抗病毒蛋白。Ⅱ型干扰素又称免疫干扰素，即IFN-γ，是由活化的T淋巴细胞在诱生剂的作用下产生的，与Ⅰ型干扰素不享用同一类受体，对免疫***有调节作用，是哺乳动物主要的巨噬细胞活化因子。IFN-α主要来源于B淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞；IFN-β主要来源于成纤维细胞和上皮细胞，部分来源于巨噬细胞；IFN-γ则主要由T淋巴细胞产生，在一定条件下也可由NK细胞产生。鸡及其他禽类干扰素***与哺乳动物干扰素***相类似，也分为Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素，现已发现鸡Ⅰ型干扰素包括IFN-α、IFN-β，Ⅱ型包括IFN-γ，目前在禽类中尚未发现IFN-ω和IFN-τ。

干扰素的相对分子质量小，鸡干扰素分子量为20～34KD的蛋白质，具有蛋白质通性，对热稳定，2-8℃可保存很长时间，20℃可长期保存其活性，56℃则被破坏，pH2～10范围内干扰素不被破坏，易被核酸酶中和，可被蛋白酶灭活。自然干扰素为一种糖蛋白，经除去糖分后，并不影响干扰素的抗病活性。干扰素作用广谱，对多种病毒甚至细菌均有抑制作用，但抑制力表现不同；抑制作用通常表现种属特异性，即某一种属细胞产生的IFN只能作用于相同种属的其它细胞，使其获得免疫力，而对异种细胞没有保护作用，但个别种属之间存在着交叉活性。

鸡干扰素α全基因为582个碱基，编码193个氨基酸，其中前31个氨基酸为信号肽，后162个氨基酸为成熟蛋白，蛋白分子量约为19kDa。Sekellick等于1994年首次成功克隆和表达了ChIFN2α基因，并进行了结构分析。国内学者汪明等2000年克隆表达了肉鸡IFNα基因；同年，夏春等克隆了惠阳胡须鸡和丝羽乌骨鸡IFNα基因。

干扰素自1957年被发现以来，陆续证实它具有抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫感染、免疫调节、免疫佐剂、影响细胞凋亡等作用。Ⅰ型干扰素主要表现为抑制病毒复制，抑制细胞增殖，加强NK细胞杀伤病毒感染细胞的能力，增强MHCⅠ类分子的表达而抑制MHCⅡ类分子的表达。Ⅱ型干扰素又称免疫干扰素，抗病毒活性较Ⅰ型低，但它的免疫调节和抗细胞增殖的作用较强，它是一种强的巨噬细胞、NK细胞、血管内皮细胞活化剂，能激活巨噬细胞并促进其活性；能直接作用于T和B淋巴细胞，促进分化；能增强MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子的表达。1999年Marcus等采用饮水给药的方法进行了重组ChIFN-α抗新城疫病毒(NDV)的研究，表明IFN抗病毒的显著效果。另外的研究结果表明，重组ChlFN-α对马立克氏病、传染性法氏囊病、传染性支气管炎、禽流感等病毒性疾病也具有良好效果，展现出广阔的应用前景。2004年，李风华等报道鸡基因工程IFN对新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎、马立克氏病等病毒病均有显著疗效。1999年Plachy等进行了鸡重组IFN防治RSV肿瘤的研究，结果表明高剂量的rGGIFN-α不仅可以抑制肿瘤，还可以使一些鸡的RSV肉瘤完全消失。1996年，Weining等研究表明，重组IFN在通过调控MHC类抗原表达发挥免疫调节功能方面表现出与哺乳动物的一致性。重组鸡α-干扰素(rChIFN-α)静脉注射4～6周龄SPF鸡，24h后采血分离淋巴细胞，通过流式细胞术测定不同时间外周血中CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞的百分率，结果显示，rChIFN-α可以在48～72h内明显提高CD4+T淋巴细胞的百分率，证明rChIFN-α具有显著的免疫调节作用。

临床应用上，干扰素有着抗生素无法替代的作用。目前我国已经有商品化的人用基因工程干扰素上市，但是动物用的干扰素研究相对比较滞后，目前还没有商品化的产品上市。众所周知，我国是禽类养殖大国，也是禽类产品的消费大国，禽类养殖业的兴衰直接影响我国的国民经济。目前，高密度集约化大型笼养肉鸡或蛋鸡是目前主要的养鸡模式，由于密度过大，导致养殖环境质量下降，从而给多种病原特别是病毒的入侵制造了契机。病毒打开鸡机体的防御大门后，各种继发的细菌性疾病随之出现，造成了鸡群大规模死亡。为了提高存活率，增加养殖效益，养殖户开始使用大量的抗生素作为饲料添加剂，从而达到降低鸡群的死亡率的目的。但是，随着抗生素的滥用日益严重，导致禽类产品的药物残留严重超标，各种耐药细菌不断出现，对人类及动物的健康和贸易出口带来严重的危害。于是，寻找一种安全有效的、无污染无残留的“绿色动物药品”显得迫在眉睫。

而基因工程鸡干扰素α是无毒、无害、无残留的生物制品，具有明显的抗病毒活性，因此，有望将其应用在禽类养殖业上，以期解决目前我国养殖业中存在的部分问题，为我国禽类健康保驾护航，为食品安全提供绿色保障。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种重组鸡干扰素α。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述重组鸡干扰素α的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种重组鸡干扰素α，其cDNA为序列表400<1>所示序列，其蛋白活性的多肽氨基酸为序列表400<2>所示序列。

上述重组鸡干扰素α的制备方法，具体构建步骤如下：

(1)获取鸡干扰素α基因：参照Gene Bank中已发表的鸡干扰素α成熟肽基因编码序列，合成了鸡干扰素α的cDNA序列，该序列通过重新优化，替换稀有密码子，调节AT含量，可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达，优化后的鸡干扰素α成熟肽的基因序列为序列表400<1>所示序列；

(2)重组质粒的构建：用酶切连接的方法分别将上述鸡干扰素α基因与载体pET-21a(+)相连，得到携带鸡干扰素α基因的重组表达载体pET-21a(+)/ChIFNα，并进行双酶切验证；

(3)基因工程菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的基因工程菌株；

(4)重组蛋白的表达：发酵条件下使工程菌株在IPTG的诱导下合成鸡干扰素α蛋白；

(5)重组鸡干扰素α的发酵生产：制备发酵种子液，将种子液接入发酵罐中，通过补加碳源和诱导剂使其大量生产鸡干扰素α，获得的重组鸡干扰素α经提取、纯化后制成鸡干扰素α产品；

(6)重组鸡干扰素α的生物学活性测定：根据微量细胞病变(CPE)抑制法，采用细胞系是鸡成纤维细胞作为试验细胞系，检测重组干扰素的抗病毒活性。

优选的，上述重组鸡干扰素α的制备方法，所述步骤(2)中所用的原核表达载体是大肠杆菌表达载体pET-21a，构建载体宿主细胞是大肠杆菌DH5α菌株，表达宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

优选的，上述重组鸡干扰素α的制备方法，所述步骤(3)中重组蛋白的表达：分别挑取与pET-21a表达载体连接的重组表达菌于含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中扩增，在培养温度为35～37℃，摇床转速为180～200r/min条件下，培养至菌液OD值为1左右时，取出1mL菌液作为对照，剩下的部分加入终浓度为0.5～2mM/mL的IPTG进行诱导，诱导时间为4～6小时，诱导结束后12000r/min离心2～5min收集菌体，并将诱导前后的菌体煮沸后进行SDS-PAGE电泳，检测重组鸡干扰素α蛋白的表达。

优选的，上述重组鸡干扰素α的制备方法，所述步骤(5)中重组鸡干扰素α的发酵生产包括：

a.种子活化：将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一单菌落至50mL LB液体培养基中，在30～37℃，180～220rpm，培养12～24小时；再将得到的种子液按体积比1％～5％的接种量接种至LB培养基中，在30～37℃，180～220rpm，培养6～12小时，得到发酵种子液；

b.接种：向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比5％～10％的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中；

c.发酵：向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为2～4m³/h，发酵温度30～37℃，搅拌转数300～900rpm，溶氧控制在20％～40％，pH控制在6.8～7.4，发酵时间11～24小时，当OD600nm＝2～4时开始补料，补料的流加速度是100～1000mL/h；

d.诱导：当OD600nm＝4～6时开始添加IPTG诱导鸡干扰素α的表达，诱导4～6小时停罐。

优选的，上述重组鸡干扰素α的制备方法，所述步骤(5)中重组鸡干扰素α的纯化、提取工艺包括：

a.提取包涵体蛋白：4℃、6000r pm/min、20min离心收集大肠杆菌菌体，菌体湿重为77g/L，并在功率400瓦、工作3秒、间歇7秒、工作时间20～30分钟条件下将10g湿菌体超声重悬于PBS缓冲液中破碎，4℃、9000rpm/min、15min高速冷冻离心，得到鸡α干扰素包涵体蛋白质；

b.纯化包涵体蛋白质：首先按质量体积比1∶30将包涵体重悬于第一洗涤液中高速冷冻离心；然后按质量体积比1∶30将包涵体重悬于第二洗涤液中高速冷冻离心；最后按质量体积比1∶40将包涵体重悬于第三洗涤液中高速冷冻离心，所述高速冷冻离心的条件均为4℃、10000rpm/min、15min，其中第一洗涤液的组分配比为NaCl 137mmol/L、KCl 2.7mmol/L、Na₂HPO₄10mmol/L、KH₂PO₄2mmol/L、1～2％的tritonX-100、pH 8～9；第二洗涤液为1～2mol/L尿素；第三洗涤液为0.5～1.5mol/L NaCl；

c.溶解与复性包涵体蛋白质：按质量体积比为1∶35将上一步离心后所得沉淀用变性剂重悬，室温放置至沉淀逐渐溶解后，4℃、8500rpm/min、15min高速冷冻离心，收集上清液；4℃条件下，使上清液逐滴加入到上述制备的复性液中，体积比为1∶80，同时搅拌12～16h，所述变性剂的组分配比为每4～6M盐酸胍中1～1.5mM EDTA、30～40mM Tris、6～8mM DTT、pH8～9；

d.收获复性重组鸡α干扰素蛋白，经过SDS-PAGE进行检测。

优选的，上述重组鸡干扰素α的制备方法，所述LB培养基的成分为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，通过常规方法制备而成。

优选的，上述重组鸡干扰素α的制备方法，所述所述发酵培养基的组成为：葡萄糖5g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、KH₂PO₄2g/L、K₂HPO₄4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 7g/L、(NH₄)₂SO₄1.2g/L、NH₄Cl 0.2g/L、MnSO₄·5H₂O0.001g/L、CoCl₂·6H₂O 0.004g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.002g/L、ZnCl₂0.002g/L、CuSO₄·5H₂O 0.001g/L、H₃BO40.005g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02g/L、CaCl·2H₂O0.02g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L、消泡剂0.2g/L，通过常规方法制备而成。

优选的，上述重组鸡干扰素α的制备方法，所述步骤(6)中重组鸡干扰素α的生物学活性测定方法：将供试品用测定培养液稀释成每1ml约含1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔。在无菌条件下操作。使鸡胚成纤维细胞在培养基中贴壁生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配制成每lml含2.5×10⁵～3.5×10⁵个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100ul。于37℃、5％二氧化碳条件下培养4～6小时。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种鸡胚成纤维细胞的培养板中，每孔加入100ul。于37℃、5％二氧化碳条件下培养18～24小时。弃去细胞培养板中的上清液。将保存的水泡性口炎病毒(VSV，-70℃保存)用攻毒培养液稀释至100CCID50，每孔100ul。于37℃、5％二氧化碳培养24小时。

然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加染色液50ul，室温放置30分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100ul，室温放置3～5分钟。混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果：

供试品生物学活性 $(\mathrm{IU}/\mathrm{ml})=\mathrm{Pr}\&times;\frac{\mathrm{Ds}\&times;\mathrm{Es}}{\mathrm{Dr}\&times;\mathrm{Er}}$

式中：Pr为标准品生物学活性，IU/ml；

Ds为供试品预稀释倍数；

Dr为标准品预稀释倍数；

Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

Er为标准品半效稀释倍数。

本发明的有益效果：

上述重组鸡干扰素α，具有生产成本低、纯度高、活性强的特点，可广泛应用于禽类养殖业领域，其制备方法以大肠杆菌为基础，运用基因工程重组技术构建基因工程菌株，通过基因合成获得相关蛋白基因，并应用微生物发酵技术，将基因工程菌株作用于发酵合成，获得的重组鸡干扰素α是无毒、无害、无残留的生物制品，对抑制病毒的复制和提高机体免疫力方面有一定的功效，因此，有望将其应用在禽类养殖业上，以期解决目前我国养殖业中存在的部分问题，为我国禽类健康保驾护航，为食品安全提供绿色保障。

附图说明

图1为本发明的载体构建示意图；

图2为本发明pET-21a(+)/ChIFNα重组表达质粒的酶切验证电泳图，其中：

M为DNA marker；1-2为pET-21a(+)-ChIFNα/EcoRⅠ/SalⅠ；

图3为本发明的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-21a(+)-ChIFNα的蛋白表达电泳图，其中：

泳道M为低分子量蛋白Marker；泳道1为诱导前全菌裂解液；泳道2-3为诱导后全菌裂解液；

图4为本发明的重组鸡干扰素α蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中：

泳道M为低分子量蛋白Marker；泳道1、2为包涵体纯化后的鸡干扰素α蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。

实施例1

一种重组鸡干扰素α的制备方法，利用基因合成技术直接获得鸡干扰素α的cDNA序列，应用大肠杆菌表达***，对鸡干扰素α的ChIFNα基因进行高效表达，构建包含目的基因ChIFNα的重组大肠杆菌，在IPTG的诱导下进行发酵合成，最后通过提取、纯化获得重组鸡干扰素α的方法。本发明所用的目的基因是参照NCBI公布的鸡干扰素α成熟肽基因编码序列(ACCESSIONNUMBER:DQ226094)合成的，本发明中重组载体的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。所构建的重组表达载体不仅包括编码酶的DNA序列，还具有表达该基因所需的控制元件。

具体构建方法的步骤如下：

1、重组鸡干扰素α基因的合成

参照鸡干扰素α成熟肽基因编码序列(ACCESSION NUMBER:DQ226094)，使用在线优化软件重新优化序列，替换稀有密码子，调节AT含量，使其可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达，然后将该优化的基因序列交给上海英潍捷基公司合成，合成后的序列克隆至pMD18-T载体。

2、重组质粒的构建

(1)将合成得到的含有鸡干扰素α的ChIFNα基因的菌株活化，利用质粒小提试剂盒提取DH5α/pMD18-T-ChIFNα的质粒，pMD18-T-ChIFNα和pET-21a(+)质粒分别用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切，然后电泳、切胶回收酶切后的质粒和目的基因，用DNA纯化试剂盒(TaKaBa公司)对上述酶切后的片段进行纯化。所获得的线性纯化的pET-21a(+)和目的基因ChIFNα即可用来构建重组质粒，载体构建示意图如图1所示。

(2)酶切后的载体pET-21a(+)和目的基因ChIFNα在16℃下连接15h，所得连接混合物采用DNA纯化试剂盒(TaKaRa公司)进行纯化，纯化后的产物用于电转化法转化大肠杆菌DH5α。

3、基因工程菌株的构建：

(1)制备大肠杆菌DH5α的感受态细胞。将上述纯化处理的连接产物化转入大肠杆菌DH5α感受态中，在含氨苄青霉素浓度为100μg/mL的LA平板上筛选转化子。从平板上挑取单一菌落，接种于含氨苄青霉素浓度为100μg/mL液体LB培养基中，于37℃培养14h，然后小量提取质粒DNA，用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切鉴定，重组质粒酶切鉴定结果见图2。

(2)制备大肠杆菌BL21的感受态细胞。将酶切验证正确的重组质粒pET-21a(+)-ChIFNα化转入大肠杆菌BL21，得到含有鸡干扰素α的重组工程菌E.coliBL21(DE3)/pET21a(+)-ChIFNα。

4、基因工程菌的诱导表达：

(1)从平板上挑取验证正确的单一菌落，接种于氨苄青霉素(100μg/mL)液体LB培养基中，于37℃培养14h。

(2)按1％的接种量接过夜培养物于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中。

(3)37℃振荡培养，当OD₆₀₀为1左右时加入IPTG，终浓度至0.5mM/mL。

(4)在37℃下诱导4h。诱导结束后12000r/min离心2min收集菌体，并将诱导前后的菌体煮沸后进行SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达。

(5)SDS-PAGE表达分析

①凝胶制备，见下表1。

表1

②样品处理

a)1mL培养液于小型离心管中，于4℃下12000r/min离心3min。

b)除上清，使沉淀的菌体尽可能“干燥”。

c)重悬菌体于100μL 1×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，并进行充分混合。

d)100℃下煮沸5min，离心取上清，样品保存于-20℃直到进行蛋白电泳分析。电泳结果见图3。

5、重组鸡干扰素α的发酵工艺：

(1)种子活化：将表达鸡α干扰素的工程菌株大肠杆菌在固体LB培养基上活化，然后挑取一单菌落至50mL LB液体培养基中，在37℃，180rpm，培养14小时；再将得到的种子液按体积比2％的接种量接种至LB培养基中，在37℃，180rpm，培养6小时，得到发酵种子液；

(2)接种：向发酵罐中填充发酵培养基，然后按体积比10％的接种量将上述活化好的种子液接种至液体发酵培养基中；

(3)发酵：向发酵罐中通入空气或者空气/氧气的混合气体，通气量为4m³/h，发酵温度37℃，搅拌转数500rpm，溶氧控制在20％，pH控制在6.8，发酵时间18小时，当OD600nm＝2时开始补料，补料的流加速度是600mL/h；

(4)诱导：当OD600nm＝4时开始添加IPTG诱导鸡干扰素α的表达，诱导6小时停罐。

6、重组鸡干扰素α的纯化、提取工艺：

(1)提取包涵体蛋白：4℃、6000rpm/min、20min离心收集大肠杆菌菌体，菌体湿重为77g/L，并在功率400瓦、工作3秒、间歇7秒、工作时间30分钟条件下将10g湿菌体超声重悬于PBS缓冲液中破碎，4℃、9000rpm/min、15min高速冷冻离心，得到鸡α干扰素包涵体蛋白质；

(2)纯化包涵体蛋白质：首先按质量体积比1∶30将包涵体重悬于第一洗涤液中高速冷冻离心；然后按质量体积比1∶30将包涵体重悬于第二洗涤液中高速冷冻离心；最后按质量体积比1∶40将包涵体重悬于第三洗涤液中高速冷冻离心，所述高速冷冻离心的条件均为4℃、10000r pm/min、15min，其中第一洗涤液的组分配比为NaCl 137mmol/L、KCl2.7mmol/L、Na₂HPO₄10mmol/L、KH₂PO₄2mmol/L、1.2％的tritonX-100、pH 8.2；第二洗涤液为2mol/L尿素；第三洗涤液为1.5mol/L NaCl；

(3)溶解与复性包涵体蛋白质：按质量体积比为1∶35将步骤(2)离心后所得沉淀用变性剂重悬，室温放置至沉淀逐渐溶解后，4℃、8500rpm/min、15min高速冷冻离心，收集上清液；4℃条件下，使上清液逐滴加入到上述制备的复性液中，体积比为1∶80，同时搅拌16h，所述变性剂的组分配比为每6M盐酸胍中1.5mM EDTA、30mM Tris、8mM DTT、pH8.5；

(4)收获复性重组鸡α干扰素蛋白，如图4所示，经过SDS-PAGE结果证明电泳为单一条带，纯度可达95％以上，其蛋白分子量大约为18KD，westernblot证实，具有天然鸡干扰素α的属性。

7、重组鸡干扰素α的生物学活性测定

检测重组干扰素的抗病毒活性，所用细胞系是鸡胚成纤维细胞(DF-1)，病毒用VSV(水泡性口炎病毒)。测定方法用以细胞病变(CPE)抑制为基础的抑制微量测定法。以每毫升干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50％)免受病毒攻击的稀释度的倒数为干扰素单位。

将供试品用测定培养液稀释成每1ml约含1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔。在无菌条件下操作。使鸡胚成纤维细胞在培养基中贴壁生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配制成每lml含2.5×10⁵～3.5×10⁵个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100ul。于37℃、5％二氧化碳条件下培养4小时。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种鸡胚成纤维细胞的培养板中，每孔加入100ul。于37℃、5％二氧化碳条件下培养18小时。弃去细胞培养板中的上清液。将保存的水泡性口炎病毒(VSV，-70℃保存)用攻毒培养液稀释至100CCID50，每孔100ul。于37℃、5％二氧化碳培养24小时。

然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加染色液50ul，室温放置30分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100ul，室温放置5分钟。混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果：

供试品生物学活性 $(\mathrm{IU}/\mathrm{ml})=\mathrm{Pr}\&times;\frac{\mathrm{Ds}\&times;\mathrm{Es}}{\mathrm{Dr}\&times;\mathrm{Er}}$

式中：Pr为标准品生物学活性，IU/ml；

Ds为供试品预稀释倍数；

Dr为标准品预稀释倍数；

Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

Er为标准品半效稀释倍数。

结果证明，细胞系是鸡成纤维细胞(DF-1)，病毒用VSV(水泡性口炎病毒)时，重组鸡干扰素α的抗病毒活性约为2×10⁸U/mg。

上述参照实施例对该重组鸡干扰素α及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种重组鸡干扰素α，其特征在于：所述鸡干扰素α目的基因的cDNA为序列表400<1>所示序列，其蛋白活性的多肽氨基酸为序列表400<2>所示序列。

2.权利要求1所述的重组鸡干扰素α的制备方法，其特征在于：具体构建步骤如下：

(1)获取鸡干扰素α基因：参照鸡干扰素α成熟肽基因编码序列，合成鸡干扰素α的cDNA序列，该序列通过重新优化，替换稀有密码子，调节AT含量，可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达，优化后的鸡干扰素α成熟肽的基因序列为序列表400<1>所示序列；

(2)重组质粒的构建：用酶切连接的方法分别将上述鸡干扰素α基因与载体pET-21a(+)相连，得到携带鸡干扰素α基因的重组表达载体pET-21a(+)/ChIFNα，并进行双酶切验证；

(3)基因工程菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的基因工程菌株；

(4)重组蛋白的表达：发酵条件下使工程菌株在IPTG的诱导下合成鸡干扰素α蛋白；

(5)重组鸡干扰素α的发酵生产：制备发酵种子液，将种子液接入发酵罐中，通过补加碳源和诱导剂使其大量生产鸡干扰素α，获得的重组鸡干扰素α经提取、纯化后制成鸡干扰素α产品。

3.根据权利要求2所述的重组鸡干扰素α的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中所用的原核表达载体是大肠杆菌表达载体pET-21a，构建载体宿主细胞是大肠杆菌DH5α菌株，表达宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

4.根据权利要求2所述的重组鸡干扰素α的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中重组蛋白的表达：分别挑取与pET-21a表达载体连接的重组表达菌于含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中扩增，在培养温度为35～37℃，摇床转速为180～200r/min条件下，培养至菌液OD值为1左右时，取出1mL菌液作为对照，剩下的部分加入终浓度为0.5～2mM/mL的IPTG进行诱导，诱导时间为4～6小时，诱导结束后12000r/min离心2～5min收集菌体，并将诱导前后的菌体煮沸后进行SDS-PAGE电泳，检测重组鸡干扰素α蛋白的表达。

5.根据权利要求2所述的重组鸡干扰素α的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中重组鸡干扰素α的发酵生产包括：a.重组表达工程菌E.coliBL21(DE3)/pET21a(+)/ChIFNα发酵种子液的制备；b.发酵菌体的培养阶段；c.碳源饲喂阶段；d.诱导表达阶段；e.重组鸡干扰素α的提取、纯化。

6.根据权利要求4所述的重组鸡干扰素α的制备方法，其特征在于：所述LB培养基的成分为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L。

7.根据权利要求5所述的重组鸡干扰素α的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成为：葡萄糖5g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、KH₂PO₄2g/L、K₂HPO₄4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 7g/L、(NH₄)₂SO₄1.2g/L、NH₄Cl 0.2g/L、MnSO₄·5H₂O 0.001g/L、CoCl₂·6H₂O 0.004g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.002g/L、ZnCl₂0.002g/L、CuSO₄·5H₂O 0.001g/L、H₃BO40.005g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02g/L、CaCl·2H₂O 0.02g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L、消泡剂0.2g/L。