CN107177614A

CN107177614A - 一种提高重组犬干扰素‑γ融合蛋白抗病毒活性的方法

Info

Publication number: CN107177614A
Application number: CN201710584165.1A
Authority: CN
Inventors: 朱升龙; 吴云舟; 朱明杰; 赵伟; 何国栋; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Harbin Zijin Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Harbin Zijin Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-07-18
Filing date: 2017-07-18
Publication date: 2017-09-19

Abstract

本发明公开了一种重组犬干扰素‑γ融合蛋白的制备方法。其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所编码的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明将犬干扰素‑γ基因与犬免疫球蛋白CH3片段融合表达，既利于增加蛋白的稳定性和活性又增加了蛋白的表达量，经实验证明，本发明所表达的重组犬干扰素‑γ与天然犬干扰素‑γ的生物活性相比具有显著提高。

Description

一种提高重组犬干扰素-γ融合蛋白抗病毒活性的方法

技术领域

本发明涉及一种重排的基因，尤其涉及重组犬干扰素-γ基因，本发明还涉及含有该基因的表达载体以及工程菌株，本发明进一步涉及它们在制备犬干扰素-γ中的用途，属于干扰素基因工程领域。

背景技术

犬类作为人的伴侣动物，在人类的生活中占据日益重要的地位，与之相伴的各种犬类病毒性疾病也在人们的生活中重复发生，有些成为人畜共患病的病原。但在兽医临床方面，目前还没有一种治疗病毒性疾病的特效药。随着科学技术的进步及现代兽医业的需要，免疫增强剂的防治作用越来越受到重视，特性确定、高效、稳定、无毒的理想免疫增强剂将是未来防治动物病毒性疾病的主要物质。其中，最主要的免疫增强剂就是干扰素。干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。由于干扰素具有无毒、无副作用和抗病毒范围广泛的优势，在发现之初就受到关注，经过多年的应用发展，干扰素已经成为一种广泛的免疫增强剂用于病毒病和肿瘤等疾病的防治领域。

随着国内工作犬、肉用犬以及宠物犬等犬类的大幅度增加，病毒性传染病成为威胁犬类生命的直接原因。人与犬的亲密接触大大增加了人被病毒感染的机会。如狂犬病毒病等。而干扰素已被证明是防止病毒性传染病的重要制剂。以往干扰素-γ以野生型的形式生产，虽然与天然结构相近，但半衰期较短，造成养殖户使用成本较高。因此，运用基因工程技术，对原始序列进行改造，获得效果更有益的重组犬干扰素-γ是当前的研究思路。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种重组犬干扰素-γ基因，该基因可以在原核表达***中稳定、高效的表达重组犬干扰素；

本发明目的之二是提供含有上述重组犬干扰素-γ基因的表达载体；

本发明目的之三是提供由上述重组犬干扰素-γ基因所转化的工程菌株；

本发明目的之四是提供一种制备重组犬干扰素-γ的方法；

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种重组犬干扰素-γ基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明的重组犬干扰素-γ基因是以犬干扰素-γ、犬免疫球蛋白CH3区域和6个His连接而成，其中核酸序列通过优化改造为最适合原核表达宿主生产的核酸序列。

本发明的重组犬干扰素-γ基因的结构由犬干扰素-γ、6个His和犬免疫球蛋白CH3区串联而成，该基因由807个核苷酸构成编码268个氨基酸。

本发明还构建了含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达质粒及用该重组表达质粒转化得到的工程菌株。

本发明的重组表达质粒可通过本领域的常规方法构建而成，即将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为一个参考的实施方案，例如，可以将重组犬干扰素-γ基因与大肠杆菌原核表达载体pET27b利用酶切位点BamHI和 HindIII相连，命名为pET-rCaIFN-γ。

本发明所构建的重组表达质粒可通过各种常规的方法转化宿主细胞。作为参考，可以将含有重组犬干扰素-γ基因的重组质粒pET-rCaIFN-γ转化大肠杆菌Rosetta （购自北京全式金生物技术有限公司，货号目录CD801）得到的菌株，命名为Escherichia coliRosetta/pET-rCaIFN-γ，简称Rosetta/pET-rCaIFN-γ。

利用大肠杆菌重组菌株Rosetta/pET-rCaIFN-γ生产重组蛋白的具体方法可以：

1、种子液的制备：将菌种划线培养后获得单菌落，挑取单菌落于10mL LB液体培养基中，同时加入100 mg/L氨苄青霉素，37℃培养12 h。

2、发酵：将获得的种子液按1：100接种于发酵培养基中，当培养至OD₆₀₀为0.4左右时，加入IPTG诱导，其终浓度为5 mM，37℃培养3h左右收菌。

本发明还提供一种制备重组犬干扰素-γ的方法，包括以下步骤：

构建含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组蛋白的表达，分离并纯化所表达的重组蛋白。

上述制备重组蛋白的方法中，所述的重组表达质粒优选是pET-rCaIFN-γ；所述的宿主细胞是大肠杆菌（Escherichia coli）Rosetta (DE3)，所述的重组菌株优选为Escherichia coli Rosetta/pET-rCaIFN-γ。

上述制备重组蛋白的方法中，优选的，所述的重组蛋白的分离和纯化包括以下步骤：

1、将收集的菌体悬于磷酸盐缓冲液，破碎后低温离心收集上清，利用Ni亲和柱和AKTA蛋白纯化***进行蛋白粗提纯；

2、将粗提纯的蛋白再利用AKTA***进行分子筛的纯化，最终得到纯度达到90%以上的蛋白。

以天然犬干扰素基因-γ（犬干扰素基因-γ的原始序列见附录一）代替重组犬干扰素-γ基因进行以上步骤，得到可用于后续实验的天然犬干扰素作为对照。

本发明将犬干扰素-γ与犬免疫球蛋白CH3区融合表达，增加了蛋白的稳定性和活性，同时本发明的蛋白表达和纯化方法具有生产时间短、表达效率高、表达量大、易于纯化的优点，并且经实验证明，本发明所表达的重组犬干扰素-γ不仅在半衰期上显著优于天然犬干扰素-γ，而且提高了其抗病毒活性。

附图说明

图1 重组犬干扰素-γ纯化后的 SDS-PAGE凝胶电泳结果。

其中，M为蛋白分子量标准Marker，1为目的带。

图2 重组犬干扰素-γ对MDCK细胞增殖的抑制作用。

图3重组犬干扰素-γ促小鼠脾淋巴细胞增殖的试验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

MDCK细胞：购自ATCC，CCL-34，由本实验室传代培养，培养基为含10%胎牛血清的DMEM。

实施例1 重组犬干扰素-γ基因质粒的构建

1、通过化学合成的方法合成所需的重组犬干扰素-γ基因。

2、表达重组犬干扰素-γ基因的重组质粒的构建。

将上述步骤1合成的重组犬干扰素-γ基因用限制性内切酶BamHI和HindIII进行酶切，并与被相同酶切割之后的pET27b载体相连接并转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选具有氨苄抗性的转化子，经质粒提取、酶切鉴定、测序后证明重组犬干扰素-γ基因已克隆至pET27b载体上，得到的重组质粒命名为pET-rCaIFN-γ。

实施例2 高效表达重组犬干扰素-γ基因的大肠杆菌菌株E.coli Rosetta/pET-rCaIFN-γ的构建

用化学转化方法将pET-rCaIFN-γ转化至E.coliRosetta，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒提取、酶切鉴定、测序分析证明获得的重组子E.coli Rosetta/pET-rCaIFN-γ和预期一致。

实施例3 利用大肠杆菌工程菌E.coli Rosetta/pET-rCaIFN-γ生产重组犬干扰素-γ

1、菌种的培养发酵

挑取大肠杆菌工程菌E.coli Rosetta/pET-rCaIFN-γ，按1%接种量将工程菌接种于LB液体培养基中，37℃恒温培养12-14 h，次日1：100扩大培养至OD值为0.4，加IPTG至终浓度0.5 mM，继续培养3h，4000 r/min ，离心30 min收集菌体。

2、重组犬干扰素-γ的纯化

将上述收集的菌体超声破碎离心后收集上清，将上清过滤后利用AKTA蛋白纯化***进行纯化，先后进行亲和层析和分子筛层析得到纯化后的重组犬干扰素-γ。

取少量纯化后的重组犬干扰素-γ蛋白加入1/5体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸10分钟后进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结果见图1。

实施例4 MTT法检测重组犬干扰素-γ蛋白对MDCK细胞增殖的抑制作用

将处于对数生长期的犬的MDCK细胞经胰蛋白酶消化后进行收集，制备成110⁴个/mL的细胞悬液，吹打均匀后接入96孔板，每孔200 µL细胞悬液，在37℃、5% CO₂培养箱中继续培养过夜，同时，取新鲜猪血10ml，加入等体积PBS，稀释血样。吸取等体积的淋巴细胞分离液置于50ml离心管中。将稀释后的血样按分离液2 倍体积的量缓慢加入到淋巴细胞分离液的上层。使分离液：血样：平衡盐溶液的体积比为1：1：1，2200r 离心22min。快速吸取白膜至离心管中，添加至少3 倍体积的PBS至离心管中，混匀，2200r 离心8-10min，弃上清,用10ml无血清培养基悬起来（大瓶），进行计数。台盼蓝染色统计活细胞>95%时，在96孔培养板中每孔加入200 μL细胞悬液，置37℃，5%CO₂培养箱中培养。

去掉培养基，用PBS洗一次，分为6组，每组实验孔各加入2、10、50、250、1250、6250ng的CaIFN-γ蛋白100μL，对照孔加100 μL DMEM。分别于48 h、72 h，每孔加入20 μL MTT溶液（5mg/mL），4 h后，弃去培养液，每孔加入150μL的DMSO，震荡10min后，用酶联免疫分析仪于测定波长为570nm测定OD值。生长抑制率由下式计算：

抑制率%=（对照组OD均值-治疗组OD值）/对照组OD均值×100%

结果见图2。从图2中可以看出，与蛋白缓冲液对照组和天然犬干扰素-γ蛋白对照组相比，纯化后的重组犬干扰素-γ对MDCK细胞生长有明显的抑制作用，随着浓度的增加，对MDCK细胞抑制率逐渐增加(**p<0.01)。

实施例5 脾淋巴细胞增殖试验

1、取新鲜狗血10ml，加入等体积PBS，稀释血样。吸取等体积的淋巴细胞分离液置于50ml离心管中。

2、将稀释后的血样按分离液2 倍体积的量缓慢加入到淋巴细胞分离液的上层。使分离液：血样：平衡盐溶液的体积比为1：1：1，2200r 离心22min。

3、快速吸取白膜至离心管中，添加至少3 倍体积的PBS至离心管中，混匀，2200r离心8-10min，弃上清,用10ml无血清培养基悬起来（大瓶），进行计数。台盼蓝染色统计活细胞>95%时，在96孔培养板中每孔加入200 μL细胞悬液，置37℃，5%CO₂培养箱中培养。

4、培养1h后在细胞中分别加入重组犬rIFN-γ蛋白和天然犬IFN-γ蛋白，并设细胞对照组。

5、培养72h后，再在每孔中加入MTT使其终浓度为5mg/mL，继续培养4h，取出培养板，轻轻翻转控干孔内液体，每孔加入150 μL DMSO振荡20min后，用酶标仪测样品孔OD₅₇₀值。结果采用SPSS统计软件，对所测数据进行统计学处理，应用单因子方差分析方法进行显著性检验。

结果见图3。从图3中可以看出，加入重组rCaIFN-γ蛋白比加入天然CaIFN-γ蛋白对淋巴细胞有较高的增殖作用，而未加入CaIFN-γ蛋白的细胞没有增殖作用。

附录一

1 ATGGATGTAT CGGACGGTGG GTCTCTTTTC GTAGATATTT TGAAGAAATG

51 GAGAGAGGAG AGTGACAAAA CAATCATTCA GAGCCAAATT GTCTCTTTCT

101 ACTTGAAACT GTTTGACAAC TTTAAAGATA ACCAGATCAT TCAAAGGAGC

151 ATGGATACCA TCAAGGAAGA CATGCTTGGC AAGTTCTTAA ATAGCAGCAC

201 CAGTAAGAGG GAGGACTTCC TTAAGCTGAT TCAAATTCCT GTGAACGATC

251 TGCAGGTCCA GCGCAAGGCG ATAAATGAAC TCATCAAAGT GATGAATGAT

301 CTCTCACCAA GATCCAACCT AAGGAAGCGG AAAAGGAGTC AGAATCTGTT

351 TCGAGGCCGC AGAGCATCGA AAGGTGGTGG TGGTAGCGGT GGTGGTGGTA

401 GCGGTGGTGG TGGTAGCCTC CCGTCCCCCA TCGAGAGGAC TATCTCCAAA

451 GCCAGAGGGC AAGCCCATCA GCCCAGTGTG TATGTCCTGC CACCATCCCC

501 AAAGGAGTTG TCATCCAGTG ACACGGTCAC CCTGACCTGC CTGATCAAAG

551 ACTTCTTCCC ACCTGAGATT GATGTGGAGT GGCAGAGCAA TGGACAGCCG

601 GAGCCCGAGA GCAAGTACCA CACGACTGCG CCCCAGCTGG ACGAGGACGG

651 GTCCTACTTC CTGTACAGCA AGCTCTCTGT GGACAAGAGC CGCTGGCAGC

701 AGGGAGACAC CTTCACATGT GCGGTGATGC ATGAAGCTCT ACAGAACCAC

751 TACACAGATC TATCCCTCTC CCATTCTCCG GGTAAACATC ATCATCATCA

801 TCATTAA

序列表

<110> 哈尔滨紫霞生物科技有限公司

<120> 一种提高重组犬干扰素-γ融合蛋白抗病毒活性的方法

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> SEQ ID NO: 1

1 ATGGACGTTT CTGACGGTGG TTCTCTGTTC GTTGACATCC TGAAAAAATG GCGTGAAGAA

61 TCTGACAAAA CCATCATCCA GTCTCAGATC GTTTCTTTCT ACCTGAAACT GTTCGACAAC

121 TTCAAAGACA ACCAGATCAT CCAGCGTTCT ATGGACACCA TCAAAGAAGA CATGCTGGGT

181 AAATTCCTGA ACTCTTCTAC CTCTAAACGT GAAGACTTCC TGAAACTGAT CCAGATCCCG

241 GTTAACGACC TGCAGGTTCA GCGTAAAGCT ATCAACGAAC TGATCAAAGT TATGAACGAC

301 CTGTCTCCGC GTTCTAACCT GCGTAAACGT AAACGTTCTC AGAACCTGTT CCGTGGTCGT

361 CGTGCTTCTA AAGGTGGTGG TGGTTCTGGT GGTGGTGGTT CTGGTGGTGG TGGTTCTCTG

421 CCGTCTCCGA TCGAACGTAC CATCTCTAAA GCTCGTGGTC AGGCTCACCA GCCGTCTGTT

481 TACGTTCTGC CGCCGTCTCC GAAAGAACTG TCTTCTTCTG ACACCGTTAC CCTGACCTGC

541 CTGATCAAAG ACTTCTTCCC GCCGGAAATC GACGTTGAAT GGCAGTCTAA CGGTCAGCCG

601 GAACCGGAAT CTAAATACCA CACCACCGCT CCGCAGCTGG ACGAAGACGG TTCTTACTTC

661 CTGTACTCTA AACTGTCTGT TGACAAATCT CGTTGGCAGC AGGGTGACAC CTTCACCTGC

721 GCTGTTATGC ACGAAGCTCT GCAGAACCAC TACACCGACC TGTCTCTGTC TCACTCTCCG

781 GGTAAACACC ACCACCACCA CCACTAA

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 268

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> SEQ ID NO: 2

1 MET Asp Val Ser Asp Gly Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu

21 Ser Asp Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe Asp Asn

41 Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser MET Asp Thr Ile Lys Glu Asp MET Leu Gly

61 Lys Phe Leu Asn Ser Ser Thr Ser Lys Arg Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro

81 Val Asn Asp Leu Gln Val Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val MET Asn Asp

101 Leu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg Gly Arg

121 Arg Ala Ser Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu

141 Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val

161 Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys

181 Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro

201 Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe

221 Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys

241 Ala Val MET His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro

261 Gly Lys His His His His His His

Claims

1.一种重组犬干扰素-γ基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1的重组犬干扰素-γ基因所编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述重组犬干扰素-γ基因的重组表达载体。

4.按照权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：其为原核表达载体。

5.由权利要求3或4的重组表达载体所转化得到的重组菌株。

6.一种制备重组犬干扰素-γ的方法，包括以下步骤：

构建含有权利要求1所述重组犬干扰素-γ基因的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组蛋白的表达，分离并纯化所表达的重组蛋白。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的重组蛋白的分离和纯化包括以下步骤：

（1）将收集的菌体用磷酸盐缓冲液悬浮，破碎后0-4℃低温离心收集上清，利用Ni亲和柱和AKTA蛋白纯化***进行蛋白粗提纯；

（2）将粗提纯的蛋白再利用AKTA***进行分子筛的纯化，即得。