CN102286490A - 一种鸡干扰素γ的制备复性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸡干扰素γ的制备复性方法，包括以下步骤：(1)对鸡干扰素γ基因进行PCR扩增；(2)将步骤(1)的产物亚克隆到带有6His标记的pET32a表达载体上；(3)将步骤(2)的产物转化到大肠杆菌M15细胞内；(4)将步骤(3)的产物进行诱导与表达，然后进行裂解获得表达产物；(5)将步骤(4)的表达产物纯化；(6)将纯化后的重组蛋白进行复性处理后得到成品。本发明使用pET32a和大肠杆菌M15，使鸡干扰素γ基因高效表达的产物纯化后的纯度为95％，高于传统方法的85％，复性后蛋白得率可以达到95ug/ml，高于传统方法的30ug/ml，复性成功率高达38～39％，高于传统方法的20％，制成的总蛋白中有效成分增加，提高了治疗效果，降低了成本。
Description
技术领域
本发明属于畜禽药物技术领域，尤其是一种鸡干扰素γ的制备复性方法。
背景技术
在禽类养殖业中，由病毒引起的传染病约占病害总量的70％，防治这些病害常采用疫苗和抗生素，但疫苗无法抵挡病原的变异和新型病害的出现，抗生素存在药物残留、药效较低的缺点。人们通过研究，开发出可干扰病毒在感染和非感染组织中复制的干扰素，其中的干扰素γ(II型干扰素)具有很强的免疫调节能力，是体内最重要的免疫调节因子，主要表现在对宿主免疫细胞活性的影响，可使巨噬细胞表面MHCII类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。适宜条件下，IFNγ可促进B细胞和CD8+T细胞的分化。此外，IFNγ还具有刺激中性粒细胞、活化NK细胞等作用，具有广谱的抗病毒抗肿瘤效用。
如申请号为200510012701.8，公开号为CN1752210，专利名称为鸡干扰素γ及其制备方法和用途的中国专利公开的技术方案：
1.根据cIFN γ基因序列(Genbank accession number：AY705909)，设计含Sph I和HindIII限制性酶切位点的引物，对经聚肌胞PolyI:C感染的依莎褐鸡脾脏cDNA进行扩增，获得cIFN γ成熟肽基因的编码序列，将该序列亚克隆到N端带有6His标记的pQE30表达载体上，并转化到大肠杆菌感受态细胞中。
2.将经酶切测序鉴定的阳性克隆经LB培养基培养并用IPTG诱导表达cIFNγ。
3.表达产物以包涵体形式存在，在高浓度变性剂(含有8M尿素的磷酸缓冲液)溶液中溶解表达产物，加入Ni-NTA(Qiagen)亲和层析树脂，用缓冲液(pH 6.3)彻底洗掉不带有6His标记的杂蛋白，重组蛋白分别用pH 5.9和pH4.3的缓冲液洗脱得到纯化产物。
4.检测确定纯化产物为目标蛋白后，通过透析将变性剂浓度缓慢降至3.5M以下，然后利用GSH-GSSG复性缓冲液(4mM GSH，0.4mM GSSG，20％甘油)复性。
干扰素属于小分子蛋白，其本身具有构象不稳定和在表达过程中易过量表达而聚集成包涵体等缺点，采用上述方法时，表达产物容易出现紧密的包涵体的形式，不利于纯化和复性，不利于干扰素的空间构象。
表达产物纯化过程中需要引入高浓度的变性剂，纯化后产物纯度不高(约85％)，复性过程繁琐，批次间复性成功率小，而且复性产物生物学活性低导致最终成药的成本极高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供产率高、蛋白活性高的一种鸡干扰素γ的制备复性方法。
本发明采用的技术方案是：
一种鸡干扰素γ的制备复性方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)对鸡干扰素γ基因进行PCR扩增；
(2)将步骤(1)的产物亚克隆到带有6His标记的pET32a表达载体上；
(3)将步骤(2)的产物转化到大肠杆菌M15细胞内；
(4)将步骤(3)的产物进行诱导与表达，然后进行裂解获得表达产物；
(5)将步骤(4)的表达产物纯化；
(6)将纯化后的重组蛋白进行复性处理后得到成品。
而且，所述步骤(1)中的PCR扩增过程是：
(1)根据获得的cIFNγ基因序列，设计含Nco I和Hind III限制性酶切位点的引物cIFN-rF和cIFN-rR；
(2)用Trizol法提取经聚肌胞PolyI:C感染的依莎褐鸡脾脏的RNA并反转录成cDNA作为扩增模板；
(3)PCR扩增
cDNA模板： 2μl
10XPCR反应缓冲液：5μl
25mM MgCl2：： 3μl
2.5mM dNTP： 2μl
10nM上游引物： 1μl
10nM下游引物： 1μl
Taq酶(Takara)： 1.25U
HPLC水： 32.75μl
反应体系总体积：50μl；
94℃变性5min；30个循环：94℃变性1min，54℃退火45s，72℃延伸45s；72℃延伸10min；10℃保温。
而且，所述步骤(2)中的亚克隆过程是：
(1)将PCR扩增后的产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，用Takara胶回收试剂盒回收目标基因；
(2)进行T克隆：
10X连接Buffer，含T4连接酶：5μl
pMD-18T载体：0.5μl
PCR回收产物：4.5μl
连接体系总体积：10μl
混匀反应体系，置于16℃孵育过夜；
(3)PCR产物的验证：
①将T克隆的产物转化至DH5α感受态细胞，挑取过夜培养的单个细菌克隆接种于5mlLB液体培养集中，220rpm/min于37℃振荡培养过夜；
②用Takara质粒小提试剂盒提取培养产物的质粒；
③提取的质粒进行Nco I和Hind III双酶切验证，将验证为阳性的质粒进行测序，测序结果与cIFNγ基因序列比对，完全匹配的质粒判为阳性质粒；
(4)进行亚克隆：
①将阳性质粒和pET32a表达载体分别进行Nco I和Hind III双酶切，用Takara胶回收试剂盒回收酶切产物；
②回收产物连接：
10X连接Buffer，含T4连接酶： 5μl
阳性质粒酶切回收产物： 0.5μl
pET32a表达载体酶切回收产物：4.5μl
连接体系总体积：10μl
混匀反应体系，置于16℃孵育过夜；
③将上述连接产物转化至M15感受态细胞，挑取过夜培养的单个细菌克隆接种于5mlLB液体培养集中，220rpm/min于37℃振荡培养过夜。用Takara质粒小提试剂盒提取培养产物的质粒并进行Nco I和Hind III双酶切，将酶切验证为阳性的质粒的来源菌株定义为阳性株，用于鸡干扰素γ的表达。
而且，所述步骤(3)中的转化过程是：
(1)取出冻存的M15感受态细胞(购自Takara)，冰浴5-10min待其溶解，加入10μl连接产物，轻微振荡混匀，立即静置冰浴30min；
(2)将此混合物置于42℃水浴90s，迅速将反应物置于冰上2min，加入800μl SOC培养基于37℃摇床上140rpm/min振荡培养45min；
(3)取出培养物，将培养液涂布于含100μg/ml AMP的平板上，待反应液被平板吸干后，倒置平板于37℃恒温摇床培养过夜；
(4)6h后，取出平板检查，并进行克隆筛选；
而且，所述步骤(4)中的诱导与表达及裂解的过程是：
(1)将筛选所得的阳性克隆接种于10ml含AMP及Kana的LB培养基中220rpm/min于37℃振荡培养过夜；
(2)按5％的接种量转接过夜培养产物于新鲜的LB培养基中，220rpm/min于37℃振荡培养至OD600约为0.6，加入0.6mM的IPTG诱导表达培养4h；
(3)6000g离心5min收集诱导表达产物。用20倍体积的含有4M尿素的磷酸盐缓冲液(pH值为8.0)溶解表达产物，期间600W，间隔6s超声6s超声150次裂解表达产物。
而且，所述步骤(5)中的纯化的过程是：在裂解完成的表达产物中，加入Ni-NTA亲和层析 树脂，间隔30s翻转摇动吸附目标蛋白30min，分别用pH值为6.3和5.9的含有4M尿素的磷酸缓冲液洗去不带有6His标记的杂蛋白，用pH值为4.3的含有4M尿素磷酸缓冲液洗脱得到重组蛋白。
而且，所述步骤(6)中的复性处理的过程是：
(1)纯化后得到的是溶解有重组蛋白的pH值为4.3且含有4M尿素的磷酸缓冲液，首先将该磷酸缓冲液中目标蛋白的含量调至100μg/ml，然后将其转移至透析袋内；
(2)将透析袋依次放入pH值为5.9、6.3和7.2的含有3M尿素的磷酸缓冲液内透析，三种pH值的磷酸缓冲液中均透析2小时；
(3)在三次透析完毕后，将透析袋中的样品取出并置于烧杯内，向其中加入1％的TritonX-100，于放置在4℃的磁力搅拌器上60rpm/min搅拌30min，再加入终浓度为400mM的β-环糊精中，于放置在4℃的磁力搅拌器上60rpm/min搅拌60min；
(4)将步骤(3)的产物再次放入透析袋内进行两次透析，
第一次透析：透析液由40mM的磷酸二氢钠、2.5M的尿素、150mM的氯化钠、0.4M的L-Arg、20％的甘油、4mM的GSH、0.4mM的GSSG、0.1％的Triton-X100和40mM的β-环糊精构成，透析时间为12小时；
第二次透析：透析液由40mM的磷酸二氢钠、1.5M的尿素、150mM的氯化钠、0.4M的L-Arg、20％的甘油、4mM的GSH、0.4mM的GSSG、0.1％的Triton-X100和10mM的β-环糊精构成，透析时间为12小时；
(5)两次透析后的透析袋继续放入以下透析液内透析16小时，透析液由40mM的磷酸二氢钠、150mM的氯化钠、0.4M的L-Arg和20％的甘油构成；
(6)转移步骤(5)得到的产物于烧杯中，向其中加入2IU/ml的重组牛肠激酶，37℃条件下作用16小时后即完成复性处理。
本发明的优点和积极效果是：
1.本方法使用pET32a表达载体，该表达载体中在起始密码子后添加一小分子凝血酶序列和和肠激酶酶切序列以及20多个氨基酸的辅助序列，在表达式上述序列与目标基因共同表达，使得表达产物的分子量达到40kDa，导致产物不再以紧密的包涵体形式存在，易于后续 的纯化和复性工作，并有利于保证干扰素的空间构象。
2.本方法使用大肠杆菌M15细胞作为宿主细胞，带有鸡干扰素γ基因的pET32a表达载体可以高效表达，最后表达产物虽然以包涵体形式存在，但可以在较低浓度的4M的尿素变性剂中溶解，降低了生产成本，有利于提高重组蛋白的纯度和复性处理的成功率。
3.本方法中使用的L-Arg属于小分子添加剂，可增加复性过程中折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性成功率，TritonX-100属于去污剂，能剔出干扰素分子中夹杂的杂蛋白分子，有利于复性过程中干扰素分子间的碰撞和正确折叠，β-CD具有疏水性空腔，能与变性蛋白质多肽链的疏水性位点结合，抑制其相互聚集失活，从而促进肽链正确折叠为活性蛋白质，GSH/GSSG属于氧化交换***，能促进干扰素分子中不正确形成的二硫键快速交换，提高正确配对的二硫键的配对产率。
4.本发明使用pET32a表达载体和大肠杆菌M15宿主细胞，使鸡干扰素γ基因高效表达的产物纯化后的纯度为95％，大大高于传统方法的85％，而且复性后蛋白得率可以达到95ug/ml，大大高于传统方法的30ug/ml，复性成功率高达38～39％，远远高于传统方法的20％，制成的总蛋白中有效成分增加，提高了治疗效果，降低了成本。
附图说明
图1为CEF细胞内，添加NDV和现有方法制备的干扰素的吸光度图；
图2为CEF细胞内，添加NDV和本发明制备的干扰素的吸光度图；
图3为现有方法制备的干扰素和本发明制备的干扰素对比的吸光度图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
一种鸡干扰素γ的制备复性方法包括以下步骤：
1.对鸡干扰素γ基因进行PCR扩增；
PCR扩增过程是：
1)引物设计并合成：根据获得的cIFNγ基因序列(Genbank accession number：AY705909)，用primer5软件设计含Nco I和Hind III限制性酶切位点的引物c IFN-rF(5’CACCATGGCTAAATCTTGTTCAACTTC-3’)和cIFN-rR(5’-CCAAGCTTAGCAATTGCATCTCCTCT-3’)(带有下划线的黑体分别代表Nco I和Hind III限制性酶切位点)，提交上海英俊生物技术有限公司合成。
2)获取模板：用Trizol法提取经聚肌胞PolyI:C感染的依莎褐鸡脾脏的RNA并反转录成cDNA作为扩增模板。
3)PCR扩增反应体系：
cDNA模板： 2μl
10XPCR反应缓冲液：5μl
25mM MgCl2：： 3μl
2.5mM dNTP： 2μl
10nM上游引物： 1μl
10nM下游引物： 1μl
Taq酶(Takara)： 1.25U
HPLC水： 32.75μl
反应体系总体积： 50μl
94℃变性5min；30个循环：94℃变性1min，54℃退火45s，72℃延伸45s；72℃延伸10min；10℃保温。
2.将步骤1的产物亚克隆到带有6His标记的pET32a表达载体上；
1)将所述步骤2中的PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，用Takara胶回收试剂盒回收目标基因。
2)参照下述方法进行T克隆：
10X连接Buffer(含T4连接酶，购自Takara)：5μl
pMD-18T载体：0.5μl
PCR回收产物：4.5μl
连接体系总体积：10μl
混匀反应体系，置于16℃孵育过夜。
3)PCR产物的验证：
A.将上述连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取过夜培养的单个细菌克隆接种于5mlLB液体培养集中，220rpm/min于37℃振荡培养过夜。
B用Takara质粒小提试剂盒提取培养产物的质粒。
C将质粒进行Nco I和Hind III双酶切验证，将验证为阳性的质粒送至上海英俊生物技术有限公司测序，测序结果与cIFNγ基因序列(Genbank accession number：AY705909)比对，完全匹配的质粒判为阳性。
4)参照下述方法进行亚克隆：
A将阳性质粒和pET32a表达载体分别进行Nco I和Hind III双酶切，用Takara胶回收试剂盒回收酶切产物。
B回收产物连接：
10X连接Buffer(含T4连接酶，购自Takara)：5μl
阳性质粒酶切回收产物：0.5μl
pET32a表达载体酶切回收产物：4.5μl
连接体系总体积：10μl
混匀反应体系，置于16℃孵育过夜。
C将上述连接产物转化至M15感受态细胞，挑取过夜培养的单个细菌克隆接种于5mlLB液体培养集中，220rpm/min于37℃振荡培养过夜。用Takara质粒小提试剂盒提取培养产物的质粒并进行Nco I和Hind III双酶切，将酶切验证为阳性的质粒的来源菌株定义为阳性株，用于鸡干扰素γ的表达。
3.将步骤2的产物转化到大肠杆菌M15细胞内；
1)取出冻存的M15感受态细胞(购自Takara)，冰浴5-10min待其溶解，加入10μl连接产物，轻微振荡混匀，立即静置冰浴30min。
2)将此混合物置于42℃水浴90s，迅速将反应物置于冰上2min，加入800μl SOC培养基于37℃摇床上140rpm/min振荡培养45min。
3)取出培养物，将培养液涂布于含100μg/ml AMP的平板上，待反应液被平板吸干后，倒置平板于37℃恒温摇床培养过夜。
4)16h后，取出平板检查，并进行克隆筛选。
4.将步骤3的产物进行诱导与表达，然后进行裂解获得表达产物；
1)将筛选所得的阳性克隆接种于10ml含AMP及Kana的LB培养基中220rpm/min于37℃振荡培养过夜。
2)按5％的接种量转接过夜培养产物于新鲜的LB培养基中，220rpm/min于37℃振荡培养至OD600约为0.6，加入0.6mM的IPTG诱导表达培养4h。
3)6000g离心5min收集诱导表达产物。用20倍体积的含有4M尿素的磷酸盐缓冲液(pH值为8.0)溶解表达产物，期间600W，间隔6s超声6s超声150次裂解表达产物。
5.将步骤4的表达产物纯化；
纯化的过程是：
在裂解完成的表达产物中，加入Ni-NTA亲和层析树脂，间隔30s翻转摇动吸附目标蛋白30min，分别用pH值为6.3和5.9的含有4M尿素的磷酸缓冲液洗去不带有6His标记的杂蛋白，用pH值为4.3的含有4M尿素磷酸缓冲液洗脱得到重组蛋白。
6.将纯化后的重组蛋白进行复性处理后得到成品。
复性处理的过程是：
(1)纯化后得到的是溶解有重组蛋白的pH值为4.3且含有4M尿素的磷酸缓冲液，首先将该磷酸缓冲液中目标蛋白的含量调至100μg/ml，然后将其转移至透析袋内；
(2)将透析袋依次放入pH值为5.9、6.3和7.2的含有3M尿素的磷酸缓冲液内透析，三种pH值的磷酸缓冲液中均透析2小时；
(3)在三次透析完毕后，将透析袋中的样品取出并置于烧杯内，向其中加入1％的TritonX-100，于放置在4℃的磁力搅拌器上60rpm/min搅拌30min，再加入终浓度为400mM的β-环糊精中，于放置在4℃的磁力搅拌器上60rpm/min搅拌60min；
(4)将步骤(3)的产物再次放入透析袋内进行两次透析，
第一次透析：透析液由40mM的磷酸二氢钠、2.5M的尿素、150mM的氯化钠、0.4M的L-Arg、20％的甘油、4mM的GSH、0.4mM的GSSG、0.1％的Triton-X100和40mM的β-环糊精构成，透析时间为12小时；
第二次透析：透析液由40mM的磷酸二氢钠、1.5M的尿素、150mM的氯化钠、0.4M的L-Arg、20％的甘油、4mM的GSH、0.4mM的GSSG、0.1％的Triton-X100和10mM的β-环糊精构成，透析时间为12小时；
(5)两次透析后的透析袋继续放入以下透析液内透析16小时，透析液由40mM的磷酸二氢钠、150mM的氯化钠、0.4M的L-Arg和20％的甘油构成；
(6)转移步骤(5)得到的产物于烧杯中，向其中加入2IU/ml的重组牛肠激酶，37℃条件下作用16小时后即完成复性处理。
复性后的重组蛋白的活性试验
1.在进行透析复性前，蛋白质的浓度均为100ug/ml，在复性过程中，传统方法在变性剂尿素浓度降至3M左右时，蛋白质开始大量聚集形成沉淀，而本发明中没有沉淀的产生，复性工艺完成后，传统方法中蛋白质存量仅为30ug/ml左右，损失约为7成，现工艺的蛋白得率可达95％，复性后通过定量检测其蛋白浓度约为95ug/ml。
2.通过细胞学试验验证得知，本发明得到的总蛋白质浓度为10ng/ml时，其中干扰素有效成分的含量相当于传统方法总蛋白质浓度为30ng/ml，可见，使用本发明的方法，干扰素有效成分大大提高。
3.传统方法与本发明得到的重组蛋白的活性试验见图1、图2和图3，试验细胞为CEF细胞，病毒为NDV。图中的纵坐标表示OD值(吸光度)，数值越大表示细胞存活率越高；横坐标中，Blank表示不添加病毒和干扰素的数据；IFN30表示添加干扰素不添加病毒的数据；NDV表示不添加干扰素只添加病毒；其它的数值表示添加的干扰素的浓度。
由图3的数据可知，本发明制得的干扰素对CEF细胞的保护明显好于传统方法。
本发明使用pET32a表达载体和大肠杆菌M15宿主细胞，使鸡干扰素γ基因高效表达的产物纯化后的纯度为95％，大大高于传统方法的85％，而且复性后蛋白得率可以达到95ug/ml，大大高于传统方法的30ug/ml，复性成功率高达38～39％，远远高于传统方法的20％，制成的总蛋白中有效成分增加，提高了治疗效果，降低了成本。
Claims (7)
1.一种鸡干扰素γ的制备复性方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)对鸡干扰素γ基因进行PCR扩增；
(2)将步骤(1)的产物亚克隆到带有6His标记的pET32a表达载体上；
(3)将步骤(2)的产物转化到大肠杆菌M15细胞内；
(4)将步骤(3)的产物进行诱导与表达，然后进行裂解获得表达产物；
(5)将步骤(4)的表达产物纯化；
(6)将纯化后的重组蛋白进行复性处理后得到成品。
2.根据权利要求1所述的一种鸡干扰素γ的制备复性方法，其特征在于：所述步骤(1)中的PCR扩增过程是：
(1)根据获得的cIFNγ基因序列，设计含Nco I和Hind III限制性酶切位点的引物cIFN-rF和cIFN-rR；
(2)用Trizol法提取经聚肌胞PolyI:C感染的依莎褐鸡脾脏的RNA并反转录成cDNA作为扩增模板；
(3)PCR扩增
cDNA模板： 2μl
10XPCR反应缓冲液：5μl
25mM MgCl2：： 3μl
2.5mM dNTP： 2μl
10nM上游引物： 1μl
10nM下游引物： 1μl
Taq酶(Takara)： 1.25U
HPLC水： 32.75μl
反应体系总体积： 50μl；
94℃变性5min；30个循环：94℃变性1min，54℃退火45s，72℃延伸45s；72℃延伸10min；10℃保温。
3.根据权利要求1所述的一种鸡干扰素γ的制备复性方法，其特征在于：所述步骤(2)中的亚克隆过程是：
(1)将PCR扩增后的产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，用Takara胶回收试剂盒回收目标基因；
(2)进行T克隆：
10X连接Buffer，含T4连接酶：5μl
pMD-18T载体： 0.5μl
PCR回收产物： 4.5μl
连接体系总体积： 10μl
混匀反应体系，置于16℃孵育过夜；
(3)PCR产物的验证：
①将T克隆的产物转化至DH5α感受态细胞，挑取过夜培养的单个细菌克隆接种于5mlLB液体培养集中，220rpm/min于37℃振荡培养过夜；
②用Takara质粒小提试剂盒提取培养产物的质粒；
③提取的质粒进行Nco I和Hind III双酶切验证，将验证为阳性的质粒进行测序，测序结果与cIFNγ基因序列比对，完全匹配的质粒判为阳性质粒；
(4)进行亚克隆：
①将阳性质粒和pET32a表达载体分别进行Nco I和Hind III双酶切，用Takara胶回收试剂盒回收酶切产物；
②回收产物连接：
10X连接Buffer，含T4连接酶： 5μl
阳性质粒酶切回收产物： 0.5μl
pET32a表达载体酶切回收产物：4.5μl
连接体系总体积：10μl
混匀反应体系，置于16℃孵育过夜；
③将上述连接产物转化至M15感受态细胞，挑取过夜培养的单个细菌克隆接种于5mlLB液体培养集中，220rpm/min于37℃振荡培养过夜。用Takara质粒小提试剂盒提取培养产物的质粒并进行Nco I和Hind III双酶切，将酶切验证为阳性的质粒的来源菌株定义为阳性株，用于鸡干扰素γ的表达。
4.根据权利要求1所述的一种鸡干扰素γ的制备复性方法，其特征在于：所述步骤(3)中的转化过程是：
(1)取出冻存的M15感受态细胞(购自Takara)，冰浴5-10min待其溶解，加入10μl连接产物，轻微振荡混匀，立即静置冰浴30min；
(2)将此混合物置于42℃水浴90s，迅速将反应物置于冰上2min，加入800μl SOC培养基于37℃摇床上140rpm/min振荡培养45min；
(3)取出培养物，将培养液涂布于含100μg/ml AMP的平板上，待反应液被平板吸干后，倒置平板于37℃恒温摇床培养过夜；
(4)6h后，取出平板检查，并进行克隆筛选；
5.根据权利要求1所述的一种鸡干扰素γ的制备复性方法，其特征在于：所述步骤(4)中的诱导与表达及裂解的过程是：
(1)将筛选所得的阳性克隆接种于10ml含AMP及Kana的LB培养基中220rpm/min于37℃振荡培养过夜；
(2)按5％的接种量转接过夜培养产物于新鲜的LB培养基中，220rpm/min于37℃振荡培养至OD600约为0.6，加入0.6mM的IPTG诱导表达培养4h；
(3)6000g离心5min收集诱导表达产物。用20倍体积的含有4M尿素的磷酸盐缓冲液(pH值为8.0)溶解表达产物，期间600W，间隔6s超声6s超声150次裂解表达产物。
6.根据权利要求1所述的一种鸡干扰素γ的制备复性方法，其特征在于：所述步骤(5)中的纯化的过程是：在裂解完成的表达产物中，加入Ni-NTA亲和层析树脂，间隔30s翻转摇动吸附目标蛋白30min，分别用pH值为6.3和5.9的含有4M尿素的磷酸缓冲液洗去不带有6His标记的杂蛋白，用pH值为4.3的含有4M尿素磷酸缓冲液洗脱得到重组蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种鸡干扰素γ的制备复性方法，其特征在于：所述步骤(6)中的复性处理的过程是：
(1)纯化后得到的是溶解有重组蛋白的pH值为4.3且含有4M尿素的磷酸缓冲液，首先将该磷酸缓冲液中目标蛋白的含量调至100μg/ml，然后将其转移至透析袋内；
(2)将透析袋依次放入pH值为5.9、6.3和7.2的含有3M尿素的磷酸缓冲液内透析，三种pH值的磷酸缓冲液中均透析2小时；
(3)在三次透析完毕后，将透析袋中的样品取出并置于烧杯内，向其中加入1％的TritonX-100，于放置在4℃的磁力搅拌器上60rpm/min搅拌30min，再加入终浓度为400mM的β-环糊精中，于放置在4℃的磁力搅拌器上60rpm/min搅拌60min；
(4)将步骤(3)的产物再次放入透析袋内进行两次透析，
第一次透析：透析液由40mM的磷酸二氢钠、2.5M的尿素、150mM的氯化钠、0.4M的L-Arg、20％的甘油、4mM的GSH、0.4mM的GSSG、0.1％的Triton-X100和40mM的β-环糊精构成，透析时间为12小时；
第二次透析：透析液由40mM的磷酸二氢钠、1.5M的尿素、150mM的氯化钠、0.4M的L-Arg、20％的甘油、4mM的GSH、0.4mM的GSSG、0.1％的Triton-X100和10mM的β-环糊精构成，透析时间为12小时；
(5)两次透析后的透析袋继续放入以下透析液内透析16小时，透析液由40mM的磷酸二氢钠、150mM的氯化钠、0.4M的L-Arg和20％的甘油构成；
(6)转移步骤(5)得到的产物于烧杯中，向其中加入2IU/ml的重组牛肠激酶，37℃条件下作用16小时后即完成复性处理。
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Denomination of invention: Preparation and renaturation method of chicken interferon gamma Effective date of registration: 20140721 Granted publication date: 20130320 Pledgee: Pudong Shanghai Development Bank Limited by Share Ltd Tianjin branch Pledgor: Dingzheng Animal Pharmaceutical (Tianjin) Co., Ltd. Registration number: 2014120000041 |
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