CN104447956A - 聚氨酯界面特异性亲和多肽及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

聚氨酯界面特异性亲和多肽及其筛选方法，它涉及生物材料技术领域，它包含VHWDFRQWWQPS特异性氨基酸序列的亲和肽；它的筛选方法为：分别以水基聚氨酯和溶剂基聚氨酯涂层材料为靶界面，利用噬菌体展示技术筛选与靶界面特异亲和的肽，包括噬菌体12肽库的亲和筛选，噬菌体克隆的ELISA鉴定，最后噬菌体阳性克隆DNA的制备及序列测定。它不仅能通过直接浸润接触使短肽分子快速稳定高效地结合在聚氨酯涂层材料表面，而且也能稳定地结合在溶剂基聚氨酯材料表面，为进一步融合活性酶蛋白分子以及开发酶蛋白在聚氨酯表面的快速固定化工艺奠定基础，也为开发具有生物活性的聚氨酯材料提供了良好的方法。

Description

聚氨酯界面特异性亲和多肽及其筛选方法

技术领域：

    本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种聚氨酯材料界面特异结合的短肽及其筛选方法。

背景技术：

噬菌体随机肽库展示技术是将编码外源肽的DNA序列***噬菌体表面编码外壳蛋白的基因中，使大量的随机肽段以融合形式表达在噬菌体表面。在该技术基础上通过反复的结合-洗脱-单克隆扩增可定向筛选与目标蛋白质、细胞、组织、材料等具有特异性亲和作用的多肽。

聚氨酯全称为聚氨基甲酸酯，是主链上含有重复氨基甲酸酯基团的大分子化合物的统称，它是由有机二异氰酸酯或多异氰酸酯与二羟基或多羟基化合物加聚而成。聚氨酯涂层一般具有高强度、高耐磨和耐溶剂等特点，可以直接牢固地附着在各种有机物或金属材料表面。因此，目前已经广泛用于家具涂料、建材涂料、汽车涂料和纺织品等领域。

上世纪90 年代以来，以聚氨酯材料为载体的固定化酶报道逐渐增多，根据形状差异可以将其分为聚氨酯膜、微球、纤维和泡沫状固定化酶，主要应用在生物合成催化剂和生物降解有毒化合物等领域。聚氨酯前体材料中由于其自身包含能与酶分子直接反应的活性异氰酸根基团，在其聚合过程中也能以共价结合和包埋的形式固定酶分子，因而具有热稳定性高、不易泄漏的优点。然而，由于酶蛋白分子主要分布在聚氨酯涂层骨架的内部，仅靠涂层表面的酶分子与底物接触催化其反应，无法最大程度发挥其催化效率；且随着使用时间的延长，表面活性酶分子一般会逐渐变性失活，聚氨酯涂层固定化酶就会失去其生物催化活性。因此，开发一种能将活性酶蛋白分子快速、高效、稳定结合在聚氨酯材料表面的技术，对开发聚氨酯基生物活性材料具有重要意义。目前常见的聚氨酯材料表面固定化酶分子主要通过对聚氨酯涂层表面进行等离子体处理，或利用二异氰酸酯在涂层表面嫁接，使聚氨酯涂层表面带有氨基、羧基和异氰基等活性反应基团，再通过共价键连接酶蛋白分子。聚氨酯涂层表面共价固定化酶蛋白的问题在于，制备工艺复杂对环境和设备要求很高，不适合大规模工业化应用。

发明内容：

本发明的目的是提供一种聚氨酯界面特异性亲和多肽及其筛选方法，它不仅能通过直接浸润接触使短肽分子快速稳定高效地结合在聚氨酯涂层材料表面，而且也能稳定地结合在溶剂基聚氨酯材料表面，为进一步融合活性酶蛋白分子以及开发酶蛋白在聚氨酯表面的快速固定化工艺奠定基础，也为开发具有生物活性的聚氨酯材料提供了良好的方法。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：它包含VHWDFRQWWQPS特异性氨基酸序列的亲和肽；它的筛选方法为：分别以水基聚氨酯和溶剂基聚氨酯涂层材料为靶界面，利用噬菌体展示技术筛选与靶界面特异亲和的肽，包括噬菌体12肽库的亲和筛选，噬菌体克隆的ELISA鉴定，最后噬菌体阳性克隆DNA的制备及序列测定。

本发明的具体筛选方法为：

一、噬菌体12肽库的亲和筛选

（1）水基聚氨酯涂层的制备：将3 mL脂肪族水基聚氨酯PU-116加入细胞培养皿，水平静置室温24小时固化，之后置于70 ^oC烘箱内进一步固化4小时取出待用。溶剂基聚氨酯涂层的制备：聚丙烯酸树脂 Desmophen A870和聚异氰酸树脂Desmodur N3600，称取2.1 g 聚丙烯酸树脂Desmophen A870于20 mL 玻璃瓶中，再加入0.5 mL 乙酸正丁酯，强力搅拌 1500 rpm、1分钟，加入0.8 g聚异氰酸树脂Desmodur N3600，继续搅拌1分钟，将混合物转移加入至水平放置的细胞培养皿中，将涂层静置于通风处内10 分钟后放入70 ^oC 烘箱，在该温度下放置4 小时使涂层聚合完全取出待用；

（2）亲和筛选：加入含体积比0.1% Tween-20的TBST 1 mL洗涤6次，于洁净面巾纸上扣干；以1 mL TBST 稀释10 uL原始文库液至4×10 ¹⁰ pfu/mL，加入到清洗晾干后的含聚氨酯涂层的细胞培养皿内，室温温和摇动60 min，倾倒出培养皿内液体，扣干残余溶液，并用4 mL TBST清洗10次，每次清洗后倾倒去缓冲溶液并在洁净的面巾纸上扣干；向培养皿中加入1 mL 浓度为0.2 M的pH 2.2的甘氨酸·盐酸Glycine-HCl 缓冲液，于室温温和摇动10 min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，然后再用150 uL pH 9.1的Tris-HCl中和上述洗脱液，测定少量洗脱液的滴度，剩余洗脱物根据常规M13 方法进行第一轮噬菌体洗脱物的扩增，加入到20 ml 处于对数前期的ER2738 菌体培养物中，37 ^oC剧烈摇动培养4.5小时，对扩增后的噬菌体进行分离纯化并测定滴度；将第一轮筛选后的噬菌体扩增液以1 mL TBST 稀释至10 ¹¹ pfu/mL，并加入到预先制备聚氨酯的细胞培养皿中进行第二轮到第五轮筛选，操作同上述第一轮筛选，用含体积比0.5% Tween-20 的TBST 溶液清洗10 次，同上进行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测定；第三轮，第四轮和第五轮洗脱物滴度测定过程中对含有少于100个蓝色噬菌斑的平板中单克隆的噬菌体进行DNA测序；

二、噬菌体克隆的ELISA鉴定

ELISA 检测噬菌体展示短肽对靶分子的的结合活性：用20 uL水基聚氨酯包被ELISA 板的每个孔，经固化和0.1% Tween-20 的TBST 溶液清洗后，将经过3轮和5轮筛选后的单克隆噬菌体进行再次扩增，取100 ul稀释至10 ¹¹ pfu/mL的噬菌体在密封的湿盒中室温温和摇动吸附1 h， TBST 洗涤后，加入稀释至工作浓度的抗M13-HRP 结合物，室温反应1 h， TBST 充分洗涤，加入TMB 底物显色溶液，室温30 min ，后加50 uL浓度为12 M 的H₂S0₄ 终止反应，测定OD450；

三、噬菌体阳性克隆DNA的制备及序列测定

将噬菌体阳性克隆提取其单链DNA后，用-96 gIII 测序引物交由上海生物工程有限公司测序，以推测其相应的水基聚氨酯特异性吸附肽序列为VHWDFRQWWQPS，溶剂基聚氨酯特异性吸附肽序列为VHWDFRQWWQPS。

四、聚氨酯特异性亲和肽的吸附效率和稳定性测定

按照测序结果固相合成亲和肽VHWDFRQWWQPS后，用FITC-NCO修饰亲和肽末端氨基，透析除去未反应的FITC分子，多肽溶液100uL加入聚氨酯包被的96孔板湿盒中4 ^oC 吸附1 h，剩余溶液，加入100 uL PBST洗涤后合并，测定荧光强度；稳定性测定为反复洗涤测定洗涤液荧光强度，作图洗涤次数-吸附多肽百分率，或通过AFM跟踪吸附多肽的分布形态。

本发明提供的聚氨酯特异性亲和肽，能与水基和溶剂基聚氨酯材料快速高效稳定结合，因此本短肽序列与氨基甲酸酯基团具有显著的结合力，同时理论上而言可以与各种酶分子进行化学交联或融合表达，为进一步开发在聚氨酯涂层表面固定化生物活性分子（酶，抗菌肽，抗体等）技术奠定坚实基础。同时本发明的聚氨酯特异性结合肽筛选方法，也为其他在各种材料界面特异性结合的小肽分子筛选结合提供切实可行的技术方案。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式及实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本具体实施方式采用以下技术方案：它包含VHWDFRQWWQPS特异性氨基酸序列的亲和肽；它的筛选方法如下：

一、噬菌体12肽库的亲和筛选

（1）水基聚氨酯涂层的制备：将3 mL脂肪族水基聚氨酯PU-116（购自安徽安科精细化工）加入细胞培养皿（35 mm X 12 mm购自Fisher Scientific），水平静置室温24小时固化，之后置于70 ^oC烘箱内进一步固化4小时取出待用。溶剂基聚氨酯涂层的制备：聚丙烯酸树脂 (Hydroxyl-bearing polyacrylate， Desmophen A870)和聚异氰酸树脂(Hexamethylene diisocyanate， Desmodur N3600) 购自Bayer。称取2.1 g 聚丙烯酸树脂Desmophen A870于20 mL 玻璃瓶中，再加入0.5 mL 乙酸正丁酯，强力搅拌 (1500 rpm) 1 分钟，加入0.8 g聚异氰酸树脂Desmodur N3600，继续搅拌1分钟。将混合物转移加入至水平放置的细胞培养皿中，将涂层静置于通风处内10 分钟后放入70 ^oC 烘箱，在该温度下放置4 小时使涂层聚合完全取出待用。

（2）亲和筛选：加入含体积比0.1% Tween-20的TBST 1 mL洗涤6次，于洁净面巾纸上扣干。以1 mL TBST 稀释10 uL原始文库液至4×10 ¹⁰ pfu/mL，加入到清洗晾干后的含聚氨酯涂层的细胞培养皿内，室温温和摇动60 min，倾倒出培养皿内液体，扣干残余溶液，并用4 mL TBST清洗10次，每次清洗后倾倒去缓冲溶液并在洁净的面巾纸上扣干。向培养皿中加入1 mL 浓度为0.2 M的pH 2.2的甘氨酸·盐酸Glycine-HCl 缓冲液，于室温温和摇动10 min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，然后再用150 uL pH 9.1的Tris-HCl中和上述洗脱液，测定少量洗脱液的滴度。剩余洗脱物根据常规M13 方法进行第一轮噬菌体洗脱物的扩增，加入到20 ml 处于对数前期的ER2738 菌体培养物中，37 ^oC剧烈摇动培养4.5小时，对扩增后的噬菌体进行分离纯化并测定滴度。将第一轮筛选后的噬菌体扩增液以1 mL TBST 稀释至10 ¹¹ pfu/mL，并加入到预先制备聚氨酯的细胞培养皿中进行第二轮到第五轮筛选（操作同上述第一轮筛选），用含体积比0.5% Tween-20 的TBST 溶液清洗10 次，同上进行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测定。第三轮，第四轮和第五轮洗脱物滴度测定过程中对含有少于100个蓝色噬菌斑的平板中单克隆的噬菌体进行DNA测序。

二、噬菌体克隆的ELISA鉴定

ELISA 检测噬菌体展示短肽对靶分子的的结合活性：用20 uL水基聚氨酯包被ELISA 板的每个孔，经固化和0.1% Tween-20 的TBST 溶液清洗后，将经过3轮和5轮筛选后的单克隆噬菌体进行再次扩增，取100 ul稀释至10 ¹¹ pfu/mL的噬菌体在密封的湿盒中室温温和摇动吸附1 h， TBST 洗涤后，加入稀释至工作浓度的抗M13-HRP 结合物，室温反应1 h， TBST 充分洗涤，加入TMB 底物显色溶液，室温30 min ，后加50 uL浓度为12 M 的H₂S0₄ 终止反应，测定OD450；

三、噬菌体阳性克隆DNA的制备及序列测定

将噬菌体阳性克隆提取其单链DNA后，用-96 gIII 测序引物交由上海生物工程有限公司测序，以推测其相应的水基聚氨酯特异性吸附肽序列为VHWDFRQWWQPS，溶剂基聚氨酯特异性吸附肽序列为VHWDFRQWWQPS。

四、聚氨酯特异性亲和肽的吸附效率和稳定性测定

按照测序结果固相合成亲和肽VHWDFRQWWQPS后，用FITC-NCO修饰亲和肽末端氨基，透析除去未反应的FITC分子，多肽溶液100uL加入聚氨酯包被的96孔板湿盒中4 ^oC 吸附1 h，剩余溶液，加入100 uL PBST洗涤后合并，测定荧光强度；稳定性测定为反复洗涤测定洗涤液荧光强度，作图洗涤次数-吸附多肽百分率，或通过AFM跟踪吸附多肽的分布形态。

实施例：

一、实验材料

1） 随机十二肽噬菌体展示文库 100 μl， 1.5×1013 pfu/ml。贮存于含50 %甘油的TBS溶液中。复杂度 ~2.7×10⁹个转化子。

2）-28 gIII测序引物 5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’， 100 pmol， 1 pmol/μl  

3） -96 gIII测序引物 5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’， 100 pmol/μl， 1 pmol/μl

4）E.coli ER2738宿主菌 F’ lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk – m k– McrBC–)。该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70 ℃。  

5）链霉亲和素Streptavidin， 冻干粉 1.5 mg。

6）生物素，10 mM 100 μl Ph.D.TM是New England Biolabs， Inc. 的注册商标。

7）抗体。

8）水基脂肪族聚氨酯PU-116购自安徽安科精细化工

9）溶剂基双组分聚氨酯分别为聚丙烯酸树脂 (Hydroxyl-bearing polyacrylate， Desmophen A870)和聚异氰酸树脂(Hexamethylene diisocyanate， Desmodur N3600) 购自Bayer。

10）人工合成多肽由上海强耀生物科技有限公司合成，纯度90%以上。

二、实验步骤：

1）水基聚氨酯涂层的制备

将3 mL脂肪族水基聚氨酯PU-116（购自安徽安科精细化工）加入细胞培养皿（35 mm X 12 mm购自Fisher Scientific），水平静置室温24小时固化，之后置于70 ^oC烘箱内进一步固化4小时取出待用。溶剂基聚氨酯涂层的制备：聚丙烯酸树脂 (Hydroxyl-bearing polyacrylate， Desmophen A870)和聚异氰酸树脂(Hexamethylene diisocyanate， Desmodur N3600) 购自Bayer。称取2.1 g 聚丙烯酸树脂Desmophen A870于20 mL 玻璃瓶中，再加入0.5 mL 乙酸正丁酯，强力搅拌 (1500 rpm) 1 分钟，加入0.8 g聚异氰酸树脂Desmodur N3600，继续搅拌1分钟。将混合物转移加入至水平放置的细胞培养皿中，将涂层静置于通风处内10 分钟后放入70 ^oC 烘箱，在该温度下放置4 小时使涂层聚合完全取出待用。

2）噬菌体12肽库的亲和筛选

加入含体积比0.1% Tween-20的TBST 1 mL洗涤6次，于洁净面巾纸上扣干。以1 mL TBST 稀释10 uL原始文库液至4×10 ¹⁰ pfu/mL，加入到清洗晾干后的含聚氨酯涂层的细胞培养皿内，室温温和摇动60 min，倾倒出培养皿内液体，扣干残余溶液，并用4 mL TBST清洗10次，每次清洗后倾倒去缓冲溶液并在洁净的面巾纸上扣干。向培养皿中加入1 mL 浓度为0.2 M的pH 2.2的甘氨酸·盐酸Glycine-HCl 缓冲液，于室温温和摇动10 min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，然后再用150 uL pH 9.1的Tris-HCl中和上述洗脱液，测定少量洗脱液的滴度。剩余洗脱物根据常规M13 方法进行第一轮噬菌体洗脱物的扩增，加入到20 ml 处于对数前期的ER2738 菌体培养物中，37 ^oC剧烈摇动培养4.5小时，对扩增后的噬菌体进行分离纯化并测定滴度。将第一轮筛选后的噬菌体扩增液以1 mL TBST 稀释至10 ¹¹ pfu/mL，并加入到预先制备聚氨酯的细胞培养皿中进行第二轮到第五轮筛选（操作同上述第一轮筛选），用含体积比0.5% Tween-20 的TBST 溶液清洗10 次，同上进行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测定。第三轮，第四轮和第五轮洗脱物滴度测定过程中对含有少于100个蓝色噬菌斑的平板中单克隆的噬菌体进行DNA测序。

3） 噬菌体克隆的ELISA鉴定

ELISA 检测噬菌体展示短肽对靶分子的的结合活性：用20 uL水基聚氨酯包被ELISA 板的每个孔，经固化和0.1% Tween-20 的TBST 溶液清洗后，将经过3轮和5轮筛选后的单克隆噬菌体进行再次扩增，取100 ul稀释至10 ¹¹ pfu/mL的噬菌体在密封的湿盒中室温温和摇动吸附1 h， TBST 洗涤后，加入稀释至工作浓度的抗M13-HRP 结合物，室温反应1 h， TBST 充分洗涤，加入TMB 底物显色溶液，室温30 min ，后加50 uL浓度为12 M 的H₂S0₄ 终止反应，测定OD450；

4） 噬菌体阳性克隆DNA的制备及序列测定

将噬菌体阳性克隆提取其单链DNA后，用-96 gIII 测序引物交由上海生物工程有限公司测序，以推测其相应的水基聚氨酯特异性吸附肽序列为VHWDFRQWWQPS，溶剂基聚氨酯特异性吸附肽序列为VHWDFRQWWQPS。

5）化学合成多肽

采用固相合成法合成上述多肽有上海强耀生物科技有限公司合成，纯度90%以上。

6）聚氨酯特异性亲和肽的吸附效率和稳定性测定

按照测序结果固相合成亲和肽VHWDFRQWWQPS后，用FITC-NCO修饰亲和肽末端氨基，透析除去未反应的FITC分子，多肽溶液100uL加入聚氨酯包被的96孔板湿盒中4 ^oC 吸附1 h，剩余溶液，加入100 uL PBST洗涤后合并，测定荧光强度；稳定性测定为反复洗涤测定洗涤液荧光强度，作图洗涤次数-吸附多肽百分率，或通过AFM跟踪吸附多肽的分布形态。

以上所述仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.聚氨酯界面特异性亲和多肽，其特征在于它包含VHWDFRQWWQPS特异性氨基酸序列的亲和肽。

2.聚氨酯界面特异性亲和多肽的筛选方法，其特征在于它的筛选方法为：分别以水基聚氨酯和溶剂基聚氨酯涂层材料为靶界面，利用噬菌体展示技术筛选与靶界面特异亲和的肽，包括噬菌体12肽库的亲和筛选，噬菌体克隆的ELISA鉴定，最后噬菌体阳性克隆DNA的制备及序列测定。

3.根据权利要求2所述的聚氨酯界面特异性亲和多肽的筛选方法，其特征在于它的具体筛选方法为：

(一)、噬菌体12肽库的亲和筛选

（1）水基聚氨酯涂层的制备：将3 mL脂肪族水基聚氨酯PU-116加入细胞培养皿，水平静置室温24小时固化，之后置于70 ^oC烘箱内进一步固化4小时取出待用。

4.溶剂基聚氨酯涂层的制备：聚丙烯酸树脂 Desmophen A870和聚异氰酸树脂Desmodur N3600，称取2.1 g 聚丙烯酸树脂Desmophen A870于20 mL 玻璃瓶中，再加入0.5 mL 乙酸正丁酯，强力搅拌 1500 rpm、1分钟，加入0.8 g聚异氰酸树脂Desmodur N3600，继续搅拌1分钟，将混合物转移加入至水平放置的细胞培养皿中，将涂层静置于通风处内10 分钟后放入70 ^oC 烘箱，在该温度下放置4 小时使涂层聚合完全取出待用；

（2）亲和筛选：加入含体积比0.1% Tween-20的TBST 1 mL洗涤6次，于洁净面巾纸上扣干；以1 mL TBST 稀释10 uL原始文库液至4×10 ¹⁰ pfu/mL，加入到清洗晾干后的含聚氨酯涂层的细胞培养皿内，室温温和摇动60 min，倾倒出培养皿内液体，扣干残余溶液，并用4 mL TBST清洗10次，每次清洗后倾倒去缓冲溶液并在洁净的面巾纸上扣干；向培养皿中加入1 mL 浓度为0.2 M的pH 2.2的甘氨酸·盐酸Glycine-HCl 缓冲液，于室温温和摇动10 min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，然后再用150 uL pH 9.1的Tris-HCl中和上述洗脱液，测定少量洗脱液的滴度，剩余洗脱物根据常规M13 方法进行第一轮噬菌体洗脱物的扩增，加入到20 ml 处于对数前期的ER2738 菌体培养物中，37 ^oC剧烈摇动培养4.5小时，对扩增后的噬菌体进行分离纯化并测定滴度；将第一轮筛选后的噬菌体扩增液以1 mL TBST 稀释至10 ¹¹ pfu/mL，并加入到预先制备聚氨酯的细胞培养皿中进行第二轮到第五轮筛选，操作同上述第一轮筛选，用含体积比0.5% Tween-20 的TBST 溶液清洗10 次，同上进行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测定；第三轮，第四轮和第五轮洗脱物滴度测定过程中对含有少于100个蓝色噬菌斑的平板中单克隆的噬菌体进行DNA测序；

(二)、噬菌体克隆的ELISA鉴定

ELISA 检测噬菌体展示短肽对靶分子的的结合活性：用20 uL水基聚氨酯包被ELISA 板的每个孔，经固化和0.1% Tween-20 的TBST 溶液清洗后，将经过3轮和5轮筛选后的单克隆噬菌体进行再次扩增，取100 ul稀释至10 ¹¹ pfu/mL的噬菌体在密封的湿盒中室温温和摇动吸附1 h， TBST 洗涤后，加入稀释至工作浓度的抗M13-HRP 结合物，室温反应1 h， TBST 充分洗涤，加入TMB 底物显色溶液，室温30 min ，后加50 uL浓度为12 M 的H₂S0₄ 终止反应，测定OD450；

(三)、噬菌体阳性克隆DNA的制备及序列测定

将噬菌体阳性克隆提取其单链DNA后，用-96 gIII 测序引物交由上海生物工程有限公司测序，以推测其相应的水基聚氨酯特异性吸附肽序列为VHWDFRQWWQPS，溶剂基聚氨酯特异性吸附肽序列为VHWDFRQWWQPS；

(四)、聚氨酯特异性亲和肽的吸附效率和稳定性测定

按照测序结果固相合成亲和肽VHWDFRQWWQPS后，用FITC-NCO修饰亲和肽末端氨基，透析除去未反应的FITC分子，多肽溶液100uL加入聚氨酯包被的96孔板湿盒中4 ^oC 吸附1 h，剩余溶液，加入100 uL PBST洗涤后合并，测定荧光强度；稳定性测定为反复洗涤测定洗涤液荧光强度，作图洗涤次数-吸附多肽百分率，或通过AFM跟踪吸附多肽的分布形态。