CN110684079B - 一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，及其筛选方法以及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，及其筛选方法以及应用，其中，该特异性结合肽的筛选方法包括以下步骤：1)在孔板内制备聚己内酯涂层；2)采用噬菌体展示技术利用步骤1)制备的具有聚己内酯涂层的孔板筛选出两条特异性结合肽；以及3)采用聚己内酯纳米颗粒对步骤2)获得的两条特异性结合肽进行验证。本发明通过筛选获得聚己内酯纳米颗粒的两条特异性结合肽，该特异性结合肽的多肽序列分别为：DGSMLNRMRGFS，YALGRPSLQGPN，该特异性结合肽可与多肽、蛋白等生物分子进行偶联，有望为复杂环境中智能纳米传感器的构建提供新思路。

Description

一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，及其筛选方法以及 应用
技术领域
本发明涉及荧光纳米光极领域，更具体地涉及一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，及其筛选方法以及应用。
背景技术
荧光纳米光极是基于电化学传感理论发展而来的一类光学传感器，此前已实现对钾、钠、钙等一系列离子进行浓度检测，成功用于环境监测等领域。传统的离子选择性纳米光极通常以增塑剂(如癸二酸二异辛酯，DOS)和塑化的聚氯乙烯(PVC)作为膜基质材料，以离子交换剂、离子载体和亲脂性pH指示剂(生色离子载体)作为传感组分，利用离子载体特异性识别待检测离子，根据pH指示剂的质子化程度反映待检测离子的浓度。通过改变其传感组件的种类及配比，纳米光极不仅可以对特定离子进行专一精确的测定，而且可以根据生理环境的离子浓度范围进行相应调整。这一优势为监测影响单细胞内信号通路的离子时空动态，深入了解它们的生物学功能提供了重要的研究手段。研究报道发现，使用PVC制备的钾离子选择性光极可成功测定正常心肌细胞发生动作电位时膜外钾离子浓度的变化。江德臣等研究者利用制备的钙选择性纳米光极传感器实现了对HeLa细胞内钙离子浓度波动的连续监测；之后通过在纳米光极表面修饰线粒体靶向的化学小分子三苯基膦(TPP)，利用荧光寿命分辨技术实现了对活细胞内线粒体以及溶酶体中游离钙离子水平的成功监测。然而由于传统的膜基质材料聚氯乙烯(PVC)和增塑剂存在潜在的致癌风险，并且生物相容性差，限制了光极传感技术在活细胞中亚细胞尺度离子通道的研究。此外，纳米光极界面修饰的细胞器定位的化学小分子也容易造成细胞器膜形态的损伤，增加对细胞的毒性。而细胞器靶向肽是对特定的细胞器具有靶向效果的一类生物小分子，相对于化学分子而言，其生物相容性更高，种类更多，并可和多种纳米粒子进行结合从而将其定位到目的细胞器中。除此之外还可以与其他生物功能分子，如多肽、蛋白进行偶联，赋予其更多的生物学功能。因此，开发生物相容性高、可生物降解的荧光纳米光极有望实现单细胞内活性离子的高时空分辨监测，具有重要的研究意义。
聚己内酯(Polycaprolactone)，简称PCL，是一种半结晶型疏水性脂肪族聚酯。该聚合物易被水解，产物可以通过三羧酸循环被代谢或是通过肾脏分泌物而被直接消除，由于其具有良好的生物相容性和生物可降解性，目前已经被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于医疗及药物控释体系中，可用作细胞生长支持材料、骨组织生长支架以及完全可降解塑料手术缝合线。除此之外，该聚合物的玻璃转化温度为-60℃，熔点为60℃，具有极大的伸展性，可在低温下成型。有研究发现，由PCL制成的纳米颗粒在缓冲体系中稳定长达140天，在脂肪酶的存在下可被快速降解。Clark的研究团队已报道成功发展了一种以PCL为基质，以柠檬酸酯为增塑剂的钠离子纳米光极，可替代传统的基于PVC的纳米光极传感器，为荧光纳米光极在活细胞中的应用提供了进一步的实验支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，及其筛选方法以及应用，从而解决现有技术中荧光纳米光极毒性高、存在潜在致癌风险、生物相容性差的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽的筛选方法，包括以下步骤：1)制备一种具有聚己内酯涂层的孔板；2)采用噬菌体展示技术利用步骤1)制备的具有聚己内酯涂层的孔板筛选出两条特异性结合肽；以及3)采用聚己内酯纳米颗粒对步骤2)获得的两条特异性结合肽进行验证。
步骤1)具体包括：将聚己内酯与F127溶解于四氢呋喃中制备成溶液，再将该溶液转移到细胞培养板中，干燥，即得一种具有聚己内酯涂层的孔板。
步骤3)具体包括：将聚己内酯与F127溶解于四氢呋喃中，再使用注射器将其注入匀速搅拌的水中，得到聚己内酯纳米颗粒悬浮液，通过酶联免疫吸附实验验证所述特异性结合肽对聚己内酯纳米颗粒的结合力。
优选地，所述步骤1)和步骤3)中聚己内酯与F127的质量比为(5:1)～(3:1)。最优选地，聚己内酯与F127的质量比为4:1。
根据本发明的一个优选方案，所述步骤3)中聚己内酯纳米颗粒的制备包括：以质量比4:1分别称取聚己内酯和F127，溶解于四氢呋喃中，采用注射器将其逐滴滴入以800～1200r/min的转速不断搅拌的超纯水中，即得一种均一的聚己内酯纳米颗粒。
现有文献报道以PCL为基质做成的纳米颗粒都需要加入柠檬酸酯等增塑剂，而本发明首次成功制备了无需增塑剂的基于PCL的纳米颗粒，关键因素是加入了F127这样一种表面活性剂。PCL和F127的质量比最优选为4：1。由于转速与纳米颗粒的粒径相关，改变条件则必然会影响纳米颗粒的粒径等物理性质，上述方案即为发明人进行优化后获得本发明中展示的纳米颗粒的其中一种优选条件。
所述步骤3)通过酶联免疫吸附实验验证所述特异性结合肽对聚己内酯纳米颗粒的结合力包括：将所述聚己内酯纳米颗粒对孔板进行包被，加入封阻液，后用TBST缓冲液快速洗板；将混有筛选得到的噬菌体的TBST缓冲液加入孔板中，温和摇动后弃去液体，每孔加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体，室温反应后洗板加入显色底物ABTS，室温反应；用酶标仪测定孔板405nm处每孔的吸光值，计算每条特异性结合肽对应的结合力。
根据本发明的第二方面，提供一种根据上述筛选与鉴定方法获得的聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，所述特异性结合肽包括两条，其多肽序列分别为：DGSMLNRMRGFS，YALGRPSLQGPN。
本发明通过酶联免疫吸附实验(ELISA)验证了这两条多肽对基于PCL纳米颗粒的结合力，结果如下：DGSMLNRMRGFS>YALGRPSLQGPN，其中DGSMLNRMRGFS的相对结合力(相对于原始噬菌体肽库而言)大于3，表明其是一条强有力的特异性结合肽。此外，两条序列中的DGSMLNRMRGFS的亲水性更强，等电点更高。该特异性结合肽可与多肽、蛋白等生物分子进行偶联，从而实现生物分子对基于PCL纳米颗粒的定向、高效自组装，避免了复杂的化学修饰改性产生的毒副作用，为构建单细胞内高空间分辨率的智能纳米传感器提供了新方法。
根据本发明的第三方面，提供一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽在与聚己内酯材料结合中的应用。
所述聚己内酯材料包括：聚己内酯纳米颗粒、聚己内酯纤维以及聚己内酯薄膜等等。
根据本发明的第四方面，提供一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽在基于聚己内酯的荧光纳米光极中的应用。
应当知晓的是，本发明中使用的噬菌体肽库购自NEB噬菌体展示十二肽库。该肽库是将随机的十二肽融合到M13噬菌体衣壳蛋白上，构成一个组合文库。其中包含大量的随机多肽，包括可能结合和不结合的多肽序列，通过洗板过程可以洗去未结合的多肽，保留结合多肽。
荧光纳米光极是一类以离子选择性电化学传感器理论为基础的光学传感器，可在生理环境下实现对多种活性离子的检测。然而现有的用于细胞和亚细胞水平离子检测的荧光纳米光极通常是由增塑剂或塑化的聚氯乙烯作为传感膜基质，存在致癌的潜在风险；此外，在用于细胞器内离子检测时，在纳米光极表面进行化学分子修饰实现细胞器靶向的方法，不仅毒性高，而且生物相容性差，限制其在细胞器离子通道中的进一步研究。聚己内酯(PCL)是一种具有生物可降解性能的聚合物，可替代PVC发展为生物相容性更佳的传感膜基质。
虽然噬菌体展示技术是已经公开的一种技术，但是本发明在该技术应用的过程中进行了改进，具体如下：本发明预先采用聚合物涂膜进行筛选获得特异性的结合肽，然后用聚合物做成的纳米颗粒验证多肽的特异性。本发明的主要目的是筛选一种PCL纳米颗粒的特异性结合肽，如果整个流程(筛选加验证)都使用PCL纳米颗粒，在筛选时容易引入非特异性结合肽(杂质)，而如果筛选时采用涂膜，验证时采用纳米颗粒的形式，则可以简化实验流程，减少实验误差。本发明的关键发明点即在于在筛选前期使用聚己内酯的涂层形式进行筛选和鉴定，获得两条特异性多肽的氨基酸序列，后期采用纳米颗粒的形式对这两条多肽的结合能力进行了验证。
专利CN106518968A中公开了尝试使用纳米颗粒包裹在二氧化硅表面进行筛选以稳定纳米颗粒，后续采用涂膜的方法进行验证，但是由于要引入二氧化硅颗粒作为母核，比较复杂。现有技术中还公开了一种基于聚己内酯的荧光纳米光极的“潜水艇”式的包埋结构，然而其缺点在于无法在其表面进行分子修饰。而本发明恰好解决了上述两种技术难题，既避免了引入二氧化硅颗粒作为母核，又为其提供了一种温和、高效的生物偶联法，即通过特异性结合肽的筛选与鉴定，可以实现小分子定向、高效的自组装于荧光纳米光极的界面。本发明使用聚己内酯成功制得了纳米颗粒，并采用噬菌体筛选技术对PCL涂膜进行筛选，获得该材料的两条条特异性结合肽，还通过酶联免疫吸附实验(ELISA)验证了这两条多肽对基于PCL纳米颗粒的结合力。
综上所述，本发明提供了一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，及其筛选方法以及应用，并且该特异性结合肽可以和其他的多肽、蛋白等生物分子任意组合，有望为复杂环境中智能纳米传感器的构建提供新思路。
附图说明
图1示出了基于聚己内酯的纳米颗粒的荧光成像图(λex＝561nm)；
图2示出了三轮筛选过程中结合聚己内酯的噬菌体的回收率；
图3示出了聚己内酯的特异性结合肽序列中出现的多种氨基酸的频率；
图4示出了两种表达特异性结合肽PCL-1和PCL-2的噬菌体以及噬菌体肽库的ELISA吸附曲线；
图5示出了7.5×1011pfu时，两种表达特异性结合肽PCL-1和PCL-2的噬菌体以及噬菌体肽库分别对聚己内酯的结合力比较；
图6示出了聚己内酯的两条特异性结合肽中的氨基酸残基的亲疏水性比较；
图7示出了聚己内酯的两条特异性结合肽的等电点和亲疏水性比较。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
1.实验试剂
聚己内酯(PCL)、表面活性剂(Pluronic F127)以及四氢呋喃(THF)均购自Sigma-Aldrich(德国)。
噬菌体筛选过程使用的噬菌体十二肽试剂盒购自NEB有限公司(美国)，M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒购自昊鑫生物科技有限公司(杭州)，牛血清白蛋白(BSA)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)、四环素均购自翊圣生物科技有限公司(上海)，柠檬酸钠、三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、聚乙二醇8000、氯化钠、氯化钾、30％过氧化氢、盐酸、甘氨酸均购自凌峰化学试剂有限公司(上海)，吐温-20(Tween-20)购自生工生物工程有限公司(上海)。
2.实验仪器
使用尼康Ti-E全自动倒置荧光显微镜(日本)对所制备的PCL纳米颗粒的形态进行观察，酶联免疫吸附(ELISA)过程使用Synergy 2多功能酶标仪(美国Biotek)测定96孔板的吸光值。
3.实验步骤
3.1PCL纳米颗粒的制备与荧光成像
为验证PCL形成纳米颗粒的可行性，将8mg PCL，2mg F127，0.1mg生色离子载体完全溶解于200μL四氢呋喃中，使用1mL注射器将其在1000r/min的转速下注入20mL去离子水中，最后使用N2鼓吹20min除去多余的四氢呋喃，得到均一的纳米颗粒悬浮液。然后将纳米颗粒溶液制成玻片样本，使用倒置荧光显微镜的561nm激光器激发，观察纳米颗粒的荧光图像。
由于PCL纳米颗粒形式容易在筛选过程中引入非特异性结合噬菌体，为筛选过程带来实验误差，对此我们在筛选过程中使用PCL涂膜，并在验证过程中使用制备的PCL纳米颗粒对得到的具体序列进行验证，该方法可简化筛选流程，便于快速获得目的多肽序列。
3.2PCL涂层的制备
于5mL的玻璃瓶称取20mg聚己内酯及5mg F127，溶解于1mL四氢呋喃中备用。然后用移液枪移取250μL上述溶液于25mm的24孔细胞培养板中，置于通风处干燥过夜至溶剂完全挥发。在该步骤中应当注意250μL溶液需要将底面全部覆盖住，过程中注意干燥，不要引入水分。
3.3PCL的特异性结合肽的筛选
1)在PCL的孔板中加满封阻液，于4℃冰箱中封阻2h，后用TBST缓冲液(含0.1％吐温-20)快速洗板6次；
2)取10μL的原始噬菌体肽库，稀释到500μL的上述浓度的TBST缓冲液中，再加到封阻后的孔板中，30℃温和摇动60min后弃去未结合的噬菌体，再次用相同浓度的TBST缓冲液快速洗板10次；
3)采用非特异性缓冲液Gly-HCl(0.2M,pH 2.2,1mg/mL BSA)分离孔板上已结合的噬菌体，30℃温和摇动20min后收集洗脱液，加入60μL 1M的Tris-HCl中和缓冲液(pH 9.1)进行中和。
4)测定噬菌体滴度
取10μL的洗脱下来的噬菌体加入到200μL对数中期的ER2738菌液中混匀静置2min，然后再加到3mL预热的上层琼脂中，每个噬菌体稀释度对应一管，10倍梯度稀释4管(10-1-10-4)。然后将上层琼脂加入37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上均匀铺开，倒置于37℃培养箱中培养过夜。18小时内取出平板，对约有100个噬菌斑的平板上的蓝斑计数，此数目乘以稀释因子得到10μL噬菌体对应的噬菌体滴度(pfu)。
5)洗脱噬菌体的扩增
取洗脱下来的噬菌体10μL加入对数前期的ER2738菌液中，继续培养5h，然后将培养物离心两次取上清的80％加入1/6体积的20％PEG/NaCl混匀，4℃过夜后再次离心，将沉淀用TBS重悬后加入20％PEG/NaCl进行再沉淀，冰上作用60min后，沉淀重悬于200μL TBS中，测定扩增后的噬菌体滴度(稀释梯度10-8-10-11)。
该步骤基于蓝白斑筛选原理，肽库噬菌体含有Lac Z基因，当铺在含有IPTG和Xgal的平板上时，噬菌体将呈现蓝色。通过计数蓝斑个数计算结合噬菌体的数量。所以测滴度的过程采用LB/IPTG/Xgal培养基平板。
6)第二、三轮筛选
用第一轮扩增得到的噬菌体计算1.5×1011pfu的扩增噬菌体加入量重复步骤(1)-(5)，第二轮和第三轮筛选过程中分别将TBST中的Tween浓度调整到0.3％和0.5％(w/v)。
7)噬菌斑的扩增
挑取第三轮洗脱下来测定滴度的平板上的蓝色噬菌斑于1mL的生长前期的含菌培养液中，培养5h后，4℃，14000rpm离心30s，取上清的80％转至无菌EP管中，置于4℃冰箱中备用。
8)按照M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒的说明书方法提取筛选得到的噬菌斑的DNA，然后送至上海擎科生物技术有限公司测序。
3.4结合噬菌体的DNA序列分析
采用-96通用引物委托测序公司进行自动测序；
按照NEB噬菌体肽库的说明书对测序结果进行分析，找到随机12肽的基因编码区，并转化为相应的氨基酸序列。
3.5特异性多肽结合能力的ELISA验证
1)按照步骤3.3.5)的方法取待验证的噬菌体10μL加入对数前期的ER2738培养液中进行扩增并纯化(即加入PEG/NaCl的过程)，最后重悬于50μL TBS中测其滴度，之后进行ELISA鉴定。
2)为验证特异性结合多肽对PCL纳米颗粒的结合能力，按照4:1的比例分别称取20mg PCL和5mg F127于1mL的四氢呋喃中，待溶解完全后用1mL注射器将其逐滴滴入不断搅拌的超纯水(20mL)中，转速1000r/min。
3)将制备好的纳米颗粒对96孔板包被过夜，体积200μL。然后用封阻液进行封阻2h后，洗板6次(0.5％TBST)后加入待鉴定的噬菌体贮液并进行3倍系列稀释(共12孔)，室温震荡作用2h后再次洗板6次，每孔加入200μL辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体，室温作用1h后洗板6次加入显色底物ABTS 200μL/孔，室温作用0-60min。用酶标仪测定96孔板405nm处每孔的吸光值。计算每条序列对应的结合力。
4.结果与讨论
4.1基于PCL的纳米颗粒的荧光图像
为便于在荧光倒置显微镜下观察PCL是否可以形成纳米颗粒，加入生色离子载体观察其荧光场和明场下的图像。如图1可见，由于拍摄延迟和颗粒游动的影响，叠加场(Merge)下的图像位置有所偏差，但是明场(Bright)及荧光场(Red)拍摄图片中可见均一的白色及红色球状颗粒，证实了PCL用于制备荧光纳米光极的可行性。
4.2PCL特异性结合多肽的筛选结果分析
该筛选过程使用噬菌体十二肽库，共进行三轮，每轮加入相同量的噬菌体：1.5×1011pfu，TBST缓冲液中Tween-20的浓度逐渐由0.1％提高到0.5％，回收的洗脱噬菌体滴度由第一轮的5.1×10-7逐渐提高到8.0×10-5。筛选过程表明，随着筛选压力不断增加，结合噬菌体在PCL表面得到了大量的富集，回收率也得到明显提高(图2)。
三轮筛选后，挑取第三轮平板上的蓝色噬菌斑扩增后测序发现，得到两条特异性结合PCL的多肽序列，分别为DGSMLNRMRGFS(PCL-1)，YALGRPSLQGPN(PCL-2)。
对得到的两条特异性多肽中含有的氨基酸残基的数量进行分析可见，如图3所示，通过分析两条特异性结合肽中含有的氨基酸残基，可以看出甘氨酸(G)出现的频次最高，丝氨酸(S)与精氨酸(R)次之，表明这三种氨基酸在与PCL的结合时发挥较大的作用。由于PCL本身并不带有电荷，这两条多肽主要是通过羰基、羧基以及氨基等氢键供体和PCL表面的羰基形成氢键，从而相互结合在一起。这与之前报道的氢键能够影响多肽与蛋白之间的相互作用一致。除此之外，由于F127的加入，PCL表面更加疏水，多肽中的疏水性氨基酸残基苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)，丙氨酸(A)和亮氨酸(L)会和聚合物界面间产生疏水性相互作用，作为辅助作用力增加多肽与聚合物之间的结合能力。
4.3酶联免疫吸附实验(ELISA)验证结合力
酶联免疫吸附(ELISA)是用来测定多肽分子和靶分子之间结合力的常用方法。首先将待检验的M13噬菌体与靶分子表面进行相互作用后，洗去未结合的多余噬菌体，然后经辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗M13抗体与表达结合多肽的M13噬菌体相互作用后除去未结合的抗体，通过加入显色底物测定其在405nm处的吸光值，同时以原始肽库作为对照，从而表征噬菌体所表达的多肽的结合力大小。测定过程中使用PCL制备的纳米颗粒作为靶分子。由图4可见，随着加入的噬菌体浓度不断增加，显色底物反应后在405nm处的吸光度也不断提高，表明PCL纳米颗粒结合的噬菌体数量也在不断增多并逐渐达到稳定。取稳定后的吸光值，并以原始肽库的吸光值为基准(设为1)，计算筛选得到的噬菌体表达序列对PCL纳米颗粒的相对结合力。如图5所示，在两条多肽中，序列PCL-1对PCL纳米颗粒的相对结合力大于3，远优于PCL-2，表明其是一条强有力的结合多肽。图6为经过强耀生物多肽计算器分析得到的两条特异性结合肽中各氨基酸残基的亲疏水性，并得到了各条多肽的平均亲水性和等电点(图7)，平均亲水性数值越大，表示亲水性越强，从计算结果中可见，两条序列的亲水能力的强弱顺序及等电点高低顺序均为：PCL-1>PCL-2。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (5)

1.一种聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽，其特征在于，所述特异性结合肽的氨基酸序列选自：DGSMLNRMRGFS，YALGRPSLQGPN。
2.一种根据权利要求1所述的聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将聚己内酯与 Pluronic F127溶解于四氢呋喃中制备成溶液，再将该溶液滴涂到细胞培养板中，待溶剂挥发完后，即得一种具有聚己内酯涂层的孔板；
2）采用噬菌体展示技术利用步骤1）制备的具有聚己内酯涂层的孔板筛选出两条特异性结合肽；以及
3）将聚己内酯与Pluronic F127溶解于四氢呋喃中，再使用注射器将其注入匀速搅拌的水中，得到聚己内酯纳米颗粒悬浮液，通过酶联免疫吸附实验验证所述特异性结合肽对聚己内酯纳米颗粒的结合力；
其中，所述步骤1）和步骤3）中聚己内酯与Pluronic F127的质量比为（5:1）~（3:1）。
3.一种根据权利要求1所述的聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽在与聚己内酯材料结合中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述聚己内酯材料包括：聚己内酯纳米颗粒、聚己内酯纤维以及聚己内酯薄膜。
5.一种根据权利要求1所述的聚己内酯纳米颗粒的特异性结合肽在基于聚己内酯的荧光纳米光极中的应用。
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