CN117925758A - 一种连接酶催化的多肽环化方法及在噬菌体展示肽库中的应用 - Google Patents

一种连接酶催化的多肽环化方法及在噬菌体展示肽库中的应用 Download PDF

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CN117925758A CN202410093169.XA CN202410093169A CN117925758A CN 117925758 A CN117925758 A CN 117925758A CN 202410093169 A CN202410093169 A CN 202410093169A CN 117925758 A CN117925758 A CN 117925758A
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方葛敏
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Abstract

本发明提供一种连接酶催化的多肽环化方法及在噬菌体展示肽库中的应用，涉及基因编码的多肽库修饰和环化技术领域。所述多肽环化方法首次实现了SortaseA酶催化体系制备侧链到侧链环化多肽，通过应用于噬菌体展示多肽文库的环化获得大规模基因编码的环肽文库，并用于针对靶蛋白的环肽配体筛选。本发明克服了现有技术的不足，所述的酶催化多肽环化方法具有反应条件温和、反应效率高和特异性高，其产生的噬菌体环肽文库能够用于筛选新结构框架的功能性环肽配体，为生物医药和生物材料领域提供了强大的平台技术。

Description

一种连接酶催化的多肽环化方法及在噬菌体展示肽库中的 应用
技术领域
本发明涉及基因编码的多肽库修饰和侧链环化技术领域，具体涉及一种连接酶催化的多肽环化方法及在噬菌体展示肽库中的应用。
背景技术
多肽分子是药物研发的重要来源，已经产生了多种重磅型药物，例如司美鲁肽、胰岛素和特立帕肽等。然而，短链线性多肽在溶液一般无固定的构象，与靶标的结合力相对弱，且易于被蛋白水解酶降解，限制了其在现代多肽药物设计和发现中的应用。环状支架的多肽具有相对刚性的结构，在靶标蛋白结合能力、蛋白水解酶稳定性以及细胞膜通透性等方面已经被证明显著优于线性多肽，代表性例子如环孢素和齐考诺肽。自然界存在一类富含半胱氨酸的环肽活性分子，它们通过多对半胱氨酸的侧链氧化形成二硫键框架的环状，例如芋螺毒素肽。但是，二硫键在还原环境中十分不稳定，与自由巯基会发生硫醇交换，进而导致二硫键框架的错误重排。
利用有机小分子偶联多肽序列中的两个或多个氨基酸残基是构建稳定环肽的重要策略。硫醚键能够克服二硫键不稳定的缺点，是替代二硫键进行多肽环化的常用方法。为了确保高效的反应效率，基于硫醚键的多肽环化法需使用高反应活性的亲电体，例如溴甲基苯或者碘甲基苯、溴乙酰基或者碘乙酰基等，来偶联两个或多个半胱氨酸残基。Heinis等(参见Nat ChemBiol 2009,5,502-507)通过三溴甲基苯与三个半胱氨酸侧链反应构建含硫醚键的双环肽，但溴甲基基团在弱碱性条件能与多肽中的其它亲核性基团如氨基发生反应(参见SciAdv 2019,5,eaaw2851)。
多肽环化的一个重要应用是构建大规模的环肽库用于发现靶标蛋白的环肽配体，特别是用于由基因编码的多肽文库的大环化，例如噬菌体展示的多肽文库。在噬菌体表面多肽环化时，三溴甲基苯会与pIII蛋白质的半胱氨酸反应，带来噬菌体侵染性降低的潜在问题。低反应性亲电体例如丙烯酰基或氯乙酰基，能够解决溴乙酰基的副反应问题，但是其引入噬菌体或者mRNA展示的多肽文库通常使用了繁琐的密码子拓展(参见Angew Chem IntEd Engl 2019,58,15904-15909)或者Flexizyme技术(参见Annu Rev Biochem 2022,91,221-243)或者结构复杂的双功能反应性试剂(参见JAm Chem Soc 2020,142,5097-5103)。
除了基于半胱氨酸侧链多肽环化方法外，还发展了基于赖氨酸、酪氨酸或色氨酸等的环化修饰方法(参见Chem Rev 2020,120,10079-10144)。其中，用于赖氨酸侧链环化的策略采用了琥珀酰亚胺活化酯，其存在不稳定、易水解和副反应严重的缺陷(参见JAm ChemSoc2005,127,14142-14143)。此外，还可以引入正交性非天然氨基酸对来进行多肽的环化，例如叠氮和炔烃修饰的氨基酸，但是这些非天然氨基酸引入噬菌体、大肠杆菌或者mRNA展示的多肽文库需要繁琐的密码子拓展技术，且受到专利保护限制。此外，点击化学通常需要使用金属催化剂(参见Angew Chem Int Ed Engl 2009,48,6974-6998)，会带来噬菌体或大肠杆菌的毒性问题，且易于带来环肽的金属离子残留问题。
随着人们对环肽药物发现的日益重视，发展与基因编码文库技术兼容的多肽环化方法成为当前基础和应用科学研究的重要趋势。基因编码文库技术，包括噬菌体展示、大肠杆菌展示、酵母展示和mRNA展示技术，通过构建大规模随机多肽文库针对靶标进行迭代筛选，已经加速了环肽配体的发现进程。基因编码多肽文库技术一般是在接近中性的水溶液中进行，要求多肽环化方法具有较好的生物相容性。而且，基因编码多肽文库技术的底物浓度极低，要求环化反应具有极高的反应效率和高度的选择性。这些苛刻的条件使得常用的化学环化方法要么不适用于基因编码的多肽文库技术，要么达不到预期的效果。
SortaseA酶是从革兰氏阳性菌中分离出来的一种转肽酶，能够诱导两个多肽以序列特异性方式酰胺键共价连接。具体来说，在SortaseA酶存在下，含Leu-Pro-Xxx-Thr-Gly(其中Xxx为任何一种天然氨基酸)的一个多肽与另一个N端含甘氨酸的多肽会以肽键连接(参见Angew Chem Int Ed Engl 2011,50,5024-5032)。与常用化学法修饰多肽相比，基于SortaseA酶的反应具备反应条件更加温和特异性更高的优点。然而，报道的基于SortaseA酶的修饰反应均用于实现多肽主链的酰胺键连接(Commun Chem 2023,6,48)，尚未实现多肽侧链的环化。虽然SortaseA酶连反应在蛋白质修饰和半合成领域得到广泛使用，但尚未用于基因编码环肽文库的构建，例如噬菌体展示环肽库。综上所述，深入探索SortaseA酶催化连接体系，开发基于SortaseA酶催化的多肽侧链环化新体系，并应用于基因编码多肽文库的环化，将有助于大环肽配体的发现。
发明内容
针对基于二硫键的多肽环化法存在环肽产物在还原条件下不稳定以及易于发生二硫键错误重排的缺点，同时针对大多数化学环化法存在反应条件苛刻和生物兼容性差且不适合修饰基因编码的多肽文库例如噬菌体展示文库，本发明提供了一种反应条件温和、反应效率和特异性高的SortaseA催化的多肽侧链环化方法。
为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
一种连接酶催化的多肽环化方法，所述连接酶催化的多肽环化方法包括以下步骤：
S1、制备侧链含低反应性基团的SortaseA酶识别的多肽类化合物，且该化合物具有以下结构通式：
其中，Xa为氢、乙酰基、由除半胱氨酸外天然或者非天然氨基酸组成的寡肽基中的任意一种；Xb为亲电体基团、含亲电体基团的由天然或者非天然氨基酸组成的寡肽基中的任意一种，其中亲电体基团包括氯乙酰基、3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基；Xc为氧(氧酯键)、氮氢(酰胺键)、硫(硫酯键)中的任意一种，Xd为氨基、由除半胱氨酸外天然或者非天然氨基酸组成的寡肽序列中的任意一种；n为1～5之间任何一个数目；
S2、利用以上多肽类化合物在SortaseA酶存在条件下与N-末端为甘氨酸且序列中含半胱氨酸的多肽模板在缓冲盐溶液中发生多肽连接和多肽侧链环化，产生环肽分子；
S3、选取S2中的N-末端为甘氨酸且序列中含半胱氨酸的多肽模板，通过基因编码融合表达在噬菌体pIII蛋白质的N末端，再经过S2步骤操作来构建噬菌体展示的环肽库，并针对靶标蛋白筛选环肽配体。
优选的，所述S2中多肽模板为以下两种：
模板a：G-(X)m-C；模板b：G-(X)m-C-(X)y-C；
其中，模板a用于构建单环肽，模板b用于构建双环肽，G代表甘氨酸，X代表任意一种天然L-氨基酸，C代表L-半胱氨酸且位置可以根据要求改变，m和y代表3～20之间的氨基酸数目。
优选的，所述SortaseA酶是其野生型或者突变体。
优选的，所述S2中多肽类化合物的浓度范围为0.1μM～10.0mM，SortaseA酶的浓度范围为0.1μM～10.0mM。
优选的，所述S2中的缓冲盐溶液为除磷酸盐外的常用缓冲液，包括HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、NaOAc(乙酸钠)和Tris(三羟甲基氨基甲烷)中的任意一种，其中含CaCl20.1 mM～10mM，和TCEP(三(2-羧乙基)膦)0.1μM～10.0mM，pH范围为6.0～9.0。
优选的，所述S2中多肽连接和多肽侧链环化反应的时间为15分钟～6小时，反应温度为20～45℃。
优选的，所述S3中的噬菌体包括由pCANTAB 5E噬菌粒和辅助噬菌体M13KO7组成的噬菌体***或M13KE噬菌体***。
优选的，所述S3中针对靶标蛋白筛选环肽配体包括以下步骤：
S3-1、利用所述的连接酶催化的多肽环化方法构建噬菌体展示的单环肽或双环肽文库；
S3-2、靶标蛋白被生物素化，固定在磁珠上，所述S3-1中噬菌体展示的单环肽或双环肽文库与固定化的靶标蛋白共孵育，经过2～4轮生物淘选，对生物淘选后的噬菌体颗粒进行测序；
S3-3、根据测序结果合成富集的目标环肽，评价与靶标蛋白的结合力和生物活性。
上述多肽环化应用于基因编码环肽文库的构建，包括对噬菌体展示的多肽文库进行多肽连接和侧链环化，构建噬菌体展示的单环和双环肽库。
优选的，所述连接酶催化的多肽环化方法得到的环肽配体应用于药物、检测试剂盒或其它生物医学和生物材料的开发。
本发明提供一种连接酶催化的多肽环化方法及在噬菌体环肽文库中的应用，与现有技术相比优点在于：
(1)本发明与现有的SortaseA酶催化的多肽连接技术相比，首次利用SortaseA酶介导生成了侧链到侧链的环肽，本发明中多肽侧链环化是多肽连接产生的中间体结构中的亲电体基团与半胱氨酸残基之间的环化反应，从而构建环肽分子，并且本发明也是首次用于构建噬菌体展示的环肽库。
(2)本发明与传统的化学法构建环肽文库技术相比，不需要高反应活性的亲电体，不会产生噬菌体毒性，更加有利于噬菌体编码的多肽文库的环化修饰。
(3)本发明与已有的基于密码子拓展或者Flexizyme的环肽文库技术相比，不涉及复杂的密码子改造，不需要制备非天然氨基酸修饰的tRNA，大大减少环肽文库构建的成本。
(4)本发明的酶催化多肽侧链环化方法整体反应条件温和、反应效率高和特异性高，其产生的噬菌体环肽文库能够用于筛选新结构框架的功能性环肽配体，为生物医药和生物材料领域提供了强大的平台技术。
附图说明：
图1为含氯乙酰基多肽3在SortaseA酶催化下进行多肽侧链单环化及产生噬菌体单环肽文库的示意图；
图2为含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7在SortaseA酶催化下进行多肽侧链双环化及产生噬菌体双环肽文库示意图；
图3为多肽1和2的色谱与质谱；
图4为实施例1-4分别制备的含氯乙酰基多肽3、含氯乙酰基多肽氧酯4、含氯乙酰基多肽硫酯5、含氯乙酰基修饰的二氨基丙酸的多肽6的色谱和质谱；
图5为实施例5-7分别制备的含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7、含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯8、含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰二氨基丙酸的多肽9以及实施例10中Biotin-1的色谱和质谱；
图6为实施例1中含氯乙酰基多肽3的合成示意图；
图7为实施例2中含氯乙酰基多肽氧酯4的合成示意图；
图8为实施例3中含氯乙酰基多肽硫酯5的合成示意图；
图9为实施例4中含氯乙酰基修饰二氨基丙酸的多肽6的合成示意图；
图10为实施例5中含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7的合成示意图；
图11为实施例6中含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯8的合成示意图；
图12为实施例7中含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰二氨基丙酸的多肽9的合成示意图；
图13为SortaseA酶催化多肽1与含氯乙酰基多肽3发生侧链单环化及产物10质谱；
图14为SortaseA酶催化多肽1与含氯乙酰基多肽氧酯4发生侧链单环化及产物10质谱；
图15为SortaseA酶催化多肽1与含氯乙酰基多肽硫酯5发生侧链单环化及产物10质谱；
图16为SortaseA酶催化多肽1与含氯乙酰基修饰二氨基丙酸的多肽6发生侧链单环化及产物11质谱；
图17为SortaseA酶催化多肽2与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7的侧链双环化及产物12质谱；
图18为SortaseA酶催化多肽2与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯8的侧链双环化及产物12质谱；
图19为SortaseA酶催化多肽2与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰二氨基丙酸的多肽9的侧链双环化及产物13质谱；
图20为噬菌体侵染性测试结果柱状图；
图21为功能性单环肽14与靶标蛋白TEAD4结合力测试结果展示图；
图22为功能性双环肽15与靶标蛋白TEAD4结合力测试结果展示图。
具体实施方式
为了更加清晰地说明本发明，以下将通过实施案例和附图进一步说明。
本发明包括的步骤如下：
(1)两种具有以下特征的N末端为甘氨酸的多肽骨架模板：
模板a：G-(X)m-C
模板b：G-(X)m-C-(X)y-C
其中，模板a用于构建单环肽，模板b用于构建双环肽，G代表甘氨酸，X代表任意一个天然L-氨基酸，C代表L-半胱氨酸，m和y代表3～20之间的氨基酸数目。
根据上述模板特征，我们合成了两条N末端为甘氨酸的多肽如下：
H-GRYDPANIHPKGWCGGSG-NH2(模板多肽1)
H-GRYDPANCIHPKGWCGGSG-NH2(模板多肽2)
所述多肽中的氨基酸均为天然的L-型氨基酸，N末端是甘氨酸的氨基，C端是甘氨酸的酰胺，其C端添加的GGSG短序列肽作为柔性连接臂模拟与噬菌体pIII蛋白质的连接。所合成的两条多肽只是为了阐明本发明技术的设计和实施方案，而不应该视为本专利的全部内容。
为了构建我们希望得到的环肽框架，多肽中的半胱氨酸位置可以随意改变，多肽中的氨基酸数目可以根据要求进行增加或者减少，改变后的多肽仍然适用于本专利提出的SortaseA酶催化的多肽侧链环化概念。因此，所有在本专利基础上做出的多肽骨架类型改变以及修饰，均被认为是本专利所保护的范围之内。
(2)一种具有以下特征的化学合成的多肽类化合物：
其中，Xa为氢、乙酰基、由除半胱氨酸外天然或者非天然氨基酸组成的寡肽基中的任意一种；Xb为亲电体基团、含亲电体基团的由天然或者非天然氨基酸组成的寡肽基中的任意一种，其中亲电体基团包括氯乙酰基、3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基；Xc为氧(氧酯键)、氮氢(酰胺键)、硫(硫酯键)中的任意一种，Xd为氨基、由除半胱氨酸外天然或者非天然氨基酸组成的寡肽序列中的任意一种；n为1～5之间任何一个数目；所有在本专利基础上做出的对该多肽类化合物的简单改变和修饰仍然是本专利所保护的范围之内。
(3)在SortaseA酶催化下，上述化学合成的多肽类化合物与上述N-末端为甘氨酸且序列中含半胱氨酸的多肽模板在缓冲盐溶液中发生多肽连接和多肽侧链环化；
其中，SortaseA酶是其野生型或者突变体，SortaseA酶浓度为0.1μM～10.0mM，化学合成的多肽类化合物浓度范围为0.1μM～10.0mM，缓冲盐溶液为除磷酸盐外的常用缓冲溶液如HEPES、NaOAc和Tris等，缓冲盐溶液中含有CaCl2(0.1mM～10.0mM)和TCEP(三(2-羧乙基)膦)(0.1μM～10.0mM)，缓冲盐溶液pH范围为6.0～9.0，多肽连接和多肽侧链环化反应的时间为15分钟～6小时，温度为20～45℃，所有在本专利基础上做出的对该多肽类化合物的简单改变和修饰仍然是本专利所保护的范围之内。
(4)噬菌体展示环肽文库的构建及应用：
在噬菌体表面展示的双环多肽文库序列特征：
GXXXXXXCXXXXXXCGGSGGSGG(由N到C端，X是天然氨基酸的任意一种，通过NNK方式编码，在序列12个位置进行随机性氨基酸突变，其中GGSGGSGG是作为双环肽文库与噬菌体表面pIII蛋白间的柔性氨基酸连接臂)。
根据该多肽序列特征设计合成DNA序列：
5’-GCT ggcccagccggcc ATG GCC GGC NNK NNK NNK NNK NNKNNK TGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGC GGC GGC TCT GGC GGC TCT GGC GGC gcggccgc TAAACTAT-3’(K：G/T，N：A/T/C/G；序列中的SfiI和NotI内切酶识别序列用小写字母标识)
上述多肽模板DNA通过SfiI和NotI双酶切后的产物与pCANTAB 5E噬菌粒载体以10：1的摩尔比例在T4 DNA连接酶下进行连接反应，然后电转化到感受态TG1大肠杆菌中，滴度测定文库多样性为2.0×108，再通过与辅助噬菌体M13KO7包装成展示了多肽库的噬菌体。
构建的噬菌体展示多肽文库与所述的含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基的多肽类化合物共孵育，在SortaseA酶的催化下产生双环肽噬菌体文库，然后针对固定化的TEAD4靶标蛋白进行3～4轮筛选，随机挑选噬菌体克隆进行测序。
根据测序结果得到富集多肽的序列，合成富集度高的多肽对应的双环肽，进行结合TEAD4的偏正荧光，确定筛选的实际效果。
(5)本发明中涉及的一系列不同的多肽模板通过SortaseA酶催化的多肽侧链环化产生的环肽都可应用于基因编码的多肽文库技术，构建大规模环肽文库，用于功能性大环肽配体的筛选。噬菌体表面展示的N端为甘氨酸且序列中含一个半胱氨酸的多肽模板与含氯乙酰基的多肽类化合物共孵育，在SortaseA酶的催化下产生单环肽噬菌体文库，用于筛选功能性单环肽配体。噬菌体表面展示的N端为甘氨酸且序列中含有两个半胱氨酸的多肽模板与3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基的多肽类化合物共孵育，在SortaseA酶的催化下，产生双环肽噬菌体文库，用于筛选功能性双环肽配体。
选取G-(X)12-C多肽模板融合到噬菌体表面，经Sortase A酶催化与一个含氯乙酰基的多肽类化合物发生多肽连接和侧链环化，构建噬菌体单环肽文库(库容量4×108，X为随机氨基酸)。选取固定化的TEAD4为靶点进行3～4筛选，随机选取噬菌体克隆测序，发现一个高度富集的多肽序列。化学合成富集度最大的多肽对应的单环肽，并通过TEAD4的偏振荧光实验和偏振荧光竞争实验，得到了亲和力为2.1μM的单环肽配体，证实了本专利的方法在构建噬菌体单环肽文库和筛选功能性单环肽配体的成功。
选取G-(X)6-C-(X)6-C多肽模板融合到噬菌体表面，经SortaseA酶催化与一个含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基的多肽类化合物发生多肽连接和侧链环化，构建噬菌体双环肽文库(库容量2×108，X为随机氨基酸)。选取固定的TEAD4为靶点进行3～4筛选，随机选取噬菌体克隆测序，发现一个高度富集的多肽序列。化学合成富集度最大的多肽对应的双环肽，并通过TEAD4的偏振荧光实验和偏振荧光竞争实验，得到了亲和力为63.9nM的双环肽配体，证实了本专利的方法在构建噬菌体双环肽文库和筛选功能性双环肽配体的成功。
实施例1：
根据上述内容
含氯乙酰基多肽3的合成：
称取200.0μmol的Rinkamide树脂(360.0mg，0.56mmol/g)，加入5.0mL规格的带滤芯筛板的固相合成反应器中，然后加入3.0mL的DMF，于室温溶胀15分钟。
然后加入2.0mL 20％哌啶的DMF溶液，于室温震荡6分钟，以脱去树脂表面氨基的Fmoc保护基团，重复一次Fmoc保护基团的脱除过程。然后用DMF洗涤树脂4次，加入溶解在2.0mL DMF的氨基酸缩合试剂，其中含有4.5当量Fmoc-Gly-OH(267.0mg)、4.5当量oxyma(127.0mg)和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(139.0μL)，放到55℃震荡反应器中反应40分钟。然后用DMF洗涤树脂4次，按照上述相同的流程依次进行Thr、Lys、Pro和Leu的固相多肽缩合。
DMF洗涤树脂4次，加入2.0mL 20％哌啶的DMF溶液脱除Leu的氨基的Fmoc保护基团。DMF洗涤树脂4次后，加入2.0mL的乙酸酐封闭试剂，其中DMF、乙酸酐和2，6-二甲基吡啶的体积比为89：5：6。常温震荡树脂2分钟后，DMF洗涤树脂4。二氯甲烷充分洗涤树脂后，常温晾干树脂，加入现配的三氟乙酸裂解液，其中TFA、间甲酚、水和三异丙基硅烷的体积比为88：5：5：2。常温震荡树脂2小时后，收集含有多肽的三氟乙酸裂解液，并加入9倍体积的预先冰冷却的***。经过离心得到白色粉末状粗肽(序列为AcNH-Leu-Pro-Lys-Thr-Gly-NH2)；
称取氯乙酸(1.2mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(2.8mg)溶解在0.2mL DMF中，加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(3.7μL)，常温震荡60分钟，再加入5.5mg粗肽(序列为AcNH-Leu-Pro-Lys-Thr-Gly-NH2，溶解于在0.2mL DMF)，再加入2.0μL的N,N-二异丙基乙胺。常温反应震荡60分钟后，加入3.0mL含有0.1％三氟乙酸的水淬灭反应体系。使用反相高效液相色谱仪纯化目标多肽产物，冷冻干燥后得到目的含氯乙酰基多肽3(4.0mg，序列为AcNH-Leu-Pro-ClAcLys-Thr-Gly-NH2，ClAcLys：Lys的侧链氨基被氯乙酰基修饰)，制备流程如图6所示。
且对于含氯乙酰基多肽3的检测为：ESI-MS(m/z)：calculated for C27H46ClN7O8:631.3；found:631.1。
合成的含氯乙酰基多肽3用于多肽的酶催化侧链环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化侧链环化及筛选功能性单环肽配体。
实施例2：
含氯乙酰基多肽氧酯4的合成：
称取100.0μmol的Rinkamide树脂(180.0mg，0.56mmol/g)，加入5.0mL规格的带滤芯筛板的固相合成反应器中，然后加入3.0mL的DMF，于室温溶胀15分钟。然后加入2.0mL20％哌啶的DMF溶液，于室温震荡6分钟，以脱去树脂表面氨基的Fmoc保护基团，重复一次Fmoc保护基团的脱除过程。然后用DMF洗涤树脂4次，加入溶解在3.0mL DMF的羟基乙酸缩合试剂，其中含有10.0当量羟基乙酸(76.0mg)、10.0当量oxyma(142.1mg)和10.0当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(154.8μL)，放到55℃震荡反应器中反应40分钟。用DMF洗涤树脂4次后，10％水合肼的DMF溶液常温处理树脂30分钟。DMF洗涤树脂后，向树脂中加入氨基酸缩合试剂，其中含有Fmoc-Thr(tBu)-OH(0.39g),HOBt(135.0mg)和DMAP(2.44mg)溶解在6mL的DMF/DCM溶液(1：9，体积比)，然后加入DIC(154.8μL)。常温过夜反应后，洗涤树脂。然后，依次进行Lys、Pro和Leu的固相多肽缩合。DMF洗涤树脂4次，加入2.0mL 20％哌啶的DMF溶液脱除Leu的氨基的Fmoc保护基团。DMF洗涤树脂4次后，加入2.0mL的乙酸酐封闭试剂，其中DMF、乙酸酐和2，6-二甲基吡啶的体积比为89：5：6。常温震荡树脂2分钟后，DMF洗涤树脂4次。二氯甲烷充分洗涤树脂后，常温晾干树脂，加入现配的三氟乙酸裂解液，其中TFA、间甲酚、水和三异丙基硅烷的体积比为88：5：5：2。常温震荡树脂2小时后，收集含有多肽的三氟乙酸裂解液，并加入9倍体积的预先冰冷却的***。经过离心得到的白色粉末状粗肽。
称取氯乙酸(1.2mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(2.8mg)溶解在0.2mL DMF中，加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(3.7μL)，常温震荡60分钟，再加入6.3mg氧酯粗肽，再加入2.0μL的N,N-二异丙基乙胺。常温反应震荡60分钟后，加入3.0mL含有0.1％三氟乙酸的水淬灭反应体系。使用反相高效液相色谱仪纯化目标多肽产物，冷冻干燥后得到目的含氯乙酰基多肽氧酯4(4.1mg，序列为AcNH-Leu-Pro-ClAcLys-Thr-Ogly-NH2，Ogly代表羟基乙酸结构)，且含氯乙酰基多肽氧酯4的合成如图7所示；
且含氯乙酰基多肽氧酯4的检测为：ESI-MS(m/z)：calculated for C27H45ClN6O9:632.2；found:632.7。
合成的含氯乙酰基多肽氧酯4将用于多肽的酶催化侧链环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化侧链环化及筛选功能性单环肽配体。
实施例3：
含氯乙酰基多肽硫酯5的合成：
称取100.0μmol的2-Cl肼树脂(180.0mg，0.56mmol/g)，加入5.0mL规格的带滤芯筛板的固相合成反应器中，然后加入3.0mL的DMF，于室温溶胀15分钟。然后，依次进行Thr、Lys、Pro和Leu的固相多肽缩合。DMF洗涤树脂4次，加入2.0mL 20％哌啶的DMF溶液脱除Leu的氨基的Fmoc保护基团。DMF洗涤树脂4～5次后，加入2.0mL的乙酸酐封闭试剂，其中DMF、乙酸酐和2，6-二甲基吡啶的体积比为89：5：6。常温震荡树脂2分钟后，DMF洗涤树脂4次。二氯甲烷充分洗涤树脂后，常温晾干树脂，加入现配的三氟乙酸裂解液，其中TFA、间甲酚、水和三异丙基硅烷的体积比为88：5：5：2。常温震荡树脂2小时后，收集含有多肽的三氟乙酸裂解液，并加入9倍体积的预先冰冷却的***。经过离心得到的白色粉末状粗酰肼肽。
10.0mg的酰肼粗肽溶解在1.0mL的PBS缓冲液中(6.0M盐酸胍，0.2M PBS，pH3)。在-15℃冰盐浴下，新配置的NaNO2(13.5mg，溶于50μL水中)加入酰肼肽中。20分钟后，加入175.0μL巯基乙酸甲酯(MTG)。常温反应30分钟后，用***萃取去除过量的MTG，经过HPLC纯化和冷冻干燥获得白色粉末状的硫酯肽。称取氯乙酸(1.2mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(2.8mg)溶解在0.4mL DMF中，加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(3.8μL)。常温震荡60分钟后，加入5.8mg硫酯肽，并加入2.0μL的N,N-二异丙基乙胺。常温反应60分钟后，加入3.0mL含有0.1％三氟乙酸的水淬灭反应体系。使用反相高效液相色谱仪纯化目标多肽产物，冷冻干燥后得到目的含氯乙酰基多肽硫酯5(3.2mg，序列为AcNH-Leu-Pro-ClAcLys-Thr-MTG，MTG代表巯基乙酸甲酯结构)；且含氯乙酰基多肽硫酯5的制备流程如图8所示；
且含氯乙酰基多肽硫酯5的检测为：ESI-MS(m/z)：calculated for C28H46ClN5O9S:663.2；found:663.4。
合成的含氯乙酰基多肽硫酯5将用于多肽的酶催化侧链环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化侧链环化及筛选功能性单环肽配体。
实施例4：
含氯乙酰基修饰二氨基丙酸的多肽6合成：
称取100.0μmol的Rinkamide树脂(180.0mg，0.56mmol/g)，加入5.0mL规格的带滤芯筛板的固相合成反应器中，然后加入3.0mL的DMF，于室温溶胀15分钟。然后加入2.0mL20％哌啶的DMF溶液，于室温震荡6分钟，以脱去树脂表面氨基的Fmoc保护基团，重复一次Fmoc保护基团的脱除过程。然后用DMF洗涤树脂4～5次，加入溶解在2.0mL DMF的氨基酸缩合试剂，其中含有4.5当量Fmoc-Gly-OH(267.0mg)、4.5当量oxyma(127.0mg)和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(139.0μL)，放到55℃震荡反应器中反应40分钟。然后用DMF洗涤树脂4次，按照上述相同的流程依次进行Thr、Dap((S)-2,3-二氨基丙酸)、Pro和Leu的固相多肽缩合。DMF洗涤树脂4～5次，加入2.0mL 20％哌啶的DMF溶液脱除Leu的氨基的Fmoc保护基团。DMF洗涤树脂4次后，加入2.0mL的乙酸酐封闭试剂，其中DMF、乙酸酐和2，6-二甲基吡啶的体积比为89：5：6。常温震荡树脂2分钟后，DMF洗涤树脂4次。二氯甲烷充分洗涤树脂后，常温晾干树脂，加入现配的三氟乙酸裂解液，其中TFA、间甲酚、水和三异丙基硅烷的体积比为88：5：5：2。常温震荡树脂2小时后，收集含有多肽的三氟乙酸裂解液，并加入9倍体积的预先冰冷却的***。经过离心得到白色粉末状粗肽(序列为AcNH-Leu-Pro-Dap-Thr-Gly-NH2)。
称取氯乙酸(1.2mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(2.8mg)溶解在0.4mL DMF中，加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(3.7μL)，常温震荡60分钟，得到N-羟基琥珀酰亚胺酯。称取5.0mg粗肽(序列为AcNH-Leu-Pro-Dap-Thr-Gly-NH2)溶解在0.9mL DMF中，然后加入2.0μL的N,N-二异丙基乙胺。常温反应60分钟后，冰浴下淬灭反应体系。使用反相高效液相色谱仪纯化目标多肽产物，冷冻干燥后得到目的含氯乙酰基修饰的二氨基丙酸的多肽6(3.9mg，序列为AcNH-Leu-Pro-ClAcDap-Thr-Gly-NH2，ClAcDap：Dap的侧链氨基被氯乙酰基修饰)，且含氯乙酰基修饰二氨基丙酸的多肽6的制备流程如图9所示；其检测为：ESI-MS(m/z)：calculated forC24H40ClN7O8:589.2；found:589.3。
合成的含氯乙酰基修饰二氨基丙酸的多肽6将用于多肽的酶催化侧链环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化侧链环化及筛选功能性单环肽配体。
实施例5：
含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7合成：
称取200.0μmol的Rinkamide树脂(360.0mg，0.56mmol/g)，加入5.0mL规格的带滤芯筛板的固相合成反应器中，然后加入3.0mL的DMF，于室温溶胀15分钟。然后加入2.0mL20％哌啶的DMF溶液，于室温震荡6分钟，以脱去树脂表面氨基的Fmoc保护基团，重复一次Fmoc保护基团的脱除过程。然后用DMF洗涤树脂4次，加入溶解在2.0mL DMF的氨基酸缩合试剂，其中含有4.5当量Fmoc-Gly-OH(267.0mg)、4.5当量oxyma(127.0mg)和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(139.0μL)，放到55℃震荡反应器中反应40分钟。然后用DMF洗涤树脂4次，按照上述相同的流程依次进行Thr、Lys、Pro和Leu的固相多肽缩合。DMF洗涤树脂4次，加入2.0mL 20％哌啶的DMF溶液脱除Leu的氨基的Fmoc保护基团。DMF洗涤树脂4次后，加入2.0mL的乙酸酐封闭试剂，其中DMF、乙酸酐和2，6-二甲基吡啶的体积比为89：5：6。常温震荡树脂2分钟后，DMF洗涤树脂4次。二氯甲烷充分洗涤树脂后，常温晾干树脂，加入现配的三氟乙酸裂解液，其中TFA、间甲酚、水和三异丙基硅烷的体积比为88：5：5：2。常温震荡树脂2小时后，收集含有多肽的三氟乙酸裂解液，并加入9倍体积的预先冰冷却的***。经过离心得到白色粉末状粗肽(序列为AcNH-Leu-Pro-Lys-Thr-Gly-NH2)。
称取3.0g的3,5-二氨基苯甲酸于装有磁子的100.0mL的圆底烧瓶，完全溶解在25.0mL的N-甲基吡咯烷酮。圆底烧瓶于-15～-20℃的冰盐浴预冷30分钟，然后加入6.8g的氯乙酰氯，继续在该温度下搅拌30分钟。撤去冰盐浴，0℃继续反应9小时后，然后于室温反应1小时。反应液倒入200.0mL盐酸水溶液中，盐酸水溶液由10mL浓盐酸和190mL水组成。目标产物以沉淀析出，过滤收集沉淀，干燥粗品。粗品重新溶解在10.0mL的N-甲基吡咯烷酮，并用100.0mL的乙醇/水(1：10，体积比)沉淀产物。沉淀物过滤收集，并用水充分洗涤，在70℃的真空干燥箱中过夜干燥得到粉末状目标产物，3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸(4.4g)。
称取3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸(6.0mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(9.2mg)溶解在0.2mL DMF中，加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(12.6μL)，常温震荡60分钟，再加入5.5mg粗肽(序列为AcNH-Leu-Pro-Lys-Thr-Gly-NH2，溶解于在0.2mL DMF)，再加入3.0μL的N,N-二异丙基乙胺。常温反应震荡60分钟后，加入3.0mL含有0.1％三氟乙酸的水淬灭反应体系。使用高效液相色谱仪纯化目标多肽产物，冷冻干燥后得到目的含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7(4.5mg，序列为AcNH-Leu-Pro-CabLys-Thr-Gly-NH2，CabLys：Lys的侧链氨基被3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰)，且含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7的合成如图10所示，其检测为ESI-MS(m/z)：calculated for C36H53Cl2N9O10:841.3；found:841.2。
合成的3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7用于多肽的酶催化侧链环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化侧链环化及筛选功能性双环肽配体。
实施例6：
含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯8的合成：
称取100.0μmol的Rinkamide树脂(180.0mg，0.56mmol/g)，加入5.0mL规格的带滤芯筛板的固相合成反应器中，然后加入3.0mL的DMF，于室温溶胀15分钟。然后加入2.0mL20％哌啶的DMF溶液，于室温震荡6分钟，以脱去树脂表面氨基的Fmoc保护基团，重复一次Fmoc保护基团的脱除过程。然后用DMF洗涤树脂4次，加入溶解在3.0mL DMF的羟基乙酸缩合试剂，其中含有10.0当量羟基乙酸(76.0mg)、10.0当量oxyma(142.1mg)和10.0当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(154.8μL)，放到55℃震荡反应器中反应40分钟。用DMF洗涤树脂4次后，10％水合肼的DMF溶液常温处理树脂30分钟。DMF洗涤树脂后，向树脂中加入氨基酸缩合试剂，其中含有Fmoc-Thr(tBu)-OH(0.39g),HOBt(135.0mg)和DMAP(2.44mg)溶解在6mL的DMF/DCM溶液(1：9，体积比)，然后加入DIC(154.8μL)。常温过夜反应后，洗涤树脂。然后，依次进行Lys、Pro和Leu的固相多肽缩合。DMF洗涤树脂4次，加入2.0mL 20％哌啶的DMF溶液脱除Leu的氨基的Fmoc保护基团。DMF洗涤树脂4次后，加入2.0mL的乙酸酐封闭试剂，其中DMF、乙酸酐和2，6-二甲基吡啶的体积比为89：5：6。常温震荡树脂2分钟后，DMF洗涤树脂4次。二氯甲烷充分洗涤树脂后，常温晾干树脂，加入现配的三氟乙酸裂解液，其中TFA、间甲酚、水和三异丙基硅烷的体积比为88：5：5：2。常温震荡树脂2小时后，收集含有多肽的三氟乙酸裂解液，并加入9倍体积的预先冰冷却的***。经过离心得到的白色粉末状粗肽。
称取3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸(6.0mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(9.2mg)溶解在0.2mL DMF中，加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(12.6μL)，常温震荡60分钟，再加入6.3mg粗肽(序列为AcNH-Leu-Pro-Lys-Thr-Ogly-NH2，溶解于在0.2mL DMF)，再加入3.0μL的N,N-二异丙基乙胺。常温反应震荡60分钟后，加入3.0mL含有0.1％三氟乙酸的水淬灭反应体系。使用高效液相色谱仪纯化目标多肽产物，冷冻干燥后得到目的含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯8(5.0mg，序列为AcNH-Leu-Pro-CabLys-Thr-Ogly-NH2，CabLys：Lys的侧链氨基被3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰；Ogly：羟基乙酸)，含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯8的制备过程如图11所示，且其检测为ESI-MS(m/z)：calculated for C36H52Cl2N8O11:842.3；found:842.7。
合成的3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基的多肽氧酯8用于多肽的酶催化侧链环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化侧链环化及筛选功能性双环肽配体。
实施例7：
含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰二氨基丙酸的多肽9的合成：
称取100.0μmol的Rinkamide树脂(180.0mg，0.56mmol/g)，加入5.0mL规格的带滤芯筛板的固相合成反应器中，然后加入3.0mL的DMF，于室温溶胀15分钟。然后加入2.0mL20％哌啶的DMF溶液，于室温震荡6分钟，以脱去树脂表面氨基的Fmoc保护基团，重复一次Fmoc保护基团的脱除过程。然后用DMF洗涤树脂4次，加入溶解在2.0mL DMF的氨基酸缩合试剂，其中含有4.5当量Fmoc-Gly-OH(267.0mg)、4.5当量oxyma(127.0mg)和4.5当量N,N'-二异丙基碳二亚胺(139.0μL)，放到55℃震荡反应器中反应40分钟。然后用DMF洗涤树脂4次，按照上述相同的流程依次进行Thr、Dap、Pro和Leu的固相多肽缩合。DMF洗涤树脂4次，加入2.0mL 20％哌啶的DMF溶液脱除Leu的氨基的Fmoc保护基团。DMF洗涤树脂4次后，加入2.0mL的乙酸酐封闭试剂，其中DMF、乙酸酐和2，6-二甲基吡啶的体积比为89：5：6。常温震荡树脂2分钟后，DMF洗涤树脂4次。二氯甲烷充分洗涤树脂后，常温晾干树脂，加入现配的三氟乙酸裂解液，其中TFA、间甲酚、水和三异丙基硅烷的体积比为88：5：5：2。常温震荡树脂2小时后，收集含有多肽的三氟乙酸裂解液，并加入8～10倍体积的预先冰冷却的***。经过离心得到白色粉末状粗肽(序列为AcNH-Leu-Pro-Dap-Thr-Gly-NH2)。
称取3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酸(6.0mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(9.2mg)溶解在0.2mL DMF中，加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(12.6μL)，常温震荡60分钟，再加入5.1mg粗肽(序列为AcNH-Leu-Pro-Dap-Thr-Ogly-NH2，溶解于在0.2mL DMF)，再加入3.0μL的N,N-二异丙基乙胺。常温反应震荡60分钟后，加入3.0mL含有0.1％三氟乙酸的水淬灭反应体系。使用高效液相色谱仪纯化目标多肽产物，冷冻干燥后得到目的含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰二氨基丙酸的多肽9(3.8mg，序列为AcNH-Leu-Pro-CabDap-Thr-Gly-NH2，CabDap：Dap的侧链氨基被3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰)，3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰二氨基丙酸的多肽9的合成路线如图12所示，其检测为ESI-MS(m/z)：calculated for C33H47Cl2N9O10:799.2；found:799.2。
合成的3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基修饰二氨基丙酸的多肽9将用于多肽的酶催化侧链环化、噬菌体展示多肽文库的酶催化侧链环化及筛选功能性双环肽配体。
实施例8：
SortaseA酶催化下制备侧链环化的单环肽：
将SortaseA酶质粒载体(一种SortaseA酶的突变体，具有更高的酶连效率，来自Addgene，Plasmid#75144)转化到DH5α感受态细胞，划板于含有卡那霉素的LB平板上过夜生长。挑取几个生长良好的单克隆并分别接种于3.0mL的含卡那霉素的LB培养基中过夜培养。使用商业试剂盒提取质粒，并送公司测序确定其正确性，定量后分装保存至-20℃，以便于以后实验。
将正确的SortaseA酶的质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，划板于含有卡那霉素的LB平板上过夜生长，挑取几个状态较好的单克隆分别接种到10.0mL的含卡那霉素的LB培养基中37℃过夜培养。取500.0mL的LB培养基，加入250μL卡那霉素母液(100.0mg/mL),加入过夜培养的菌株5.0mL，37℃培养3小时，至OD600达到0.8附近，加入150.0μL的IPTG母液(1mmol/L)，16℃及180rpm培养20小时。离心收集菌株，用裂解缓冲液(20.0mM HEPES,500.0mM NaCl,5％甘油，pH 7.5)离心洗涤菌株，然后加入50.0mL裂解缓冲液，超声破碎菌株，离心去除沉淀物，得到含有目标SortaseA酶的上清溶液，经过镍柱纯化得到纯度在90％左右的目的蛋白质，通过超滤浓缩和置换为裂解缓冲液得到SortaseA酶(9mg/mL)，分装保存在-80℃，每支含SortaseA酶225.0μg(25.0μL)，用于酶催化的多肽连接和侧链环化反应。
配10.0mL的HEPES缓冲液(pH 8.0)，其中含有50.0mM HEPES、100.0mM NaCl、2.0mMCaCl2和1.0mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)。取1.0mL的HEPES缓冲液(pH 8.0)，加入4.0μL多肽1(序列为H-GRYDPANIHPKGWCGGSG-NH2，94.0μg，终浓度为50.0μM)，然后加入10.0μL的SortaseA酶(90.0μg，终浓度为5μM)，接着加入4.0μL含氯乙酰基多肽3(32.0μg，终浓度为50.0μM)。混合反应溶液后于37℃摇床中，使用高效液相色谱检测反应。且多肽1和含氯乙酰基多肽3预先溶解在含1％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液中。
如图13所示，根据高效液相色谱的跟踪结果，在SortaseA酶的存在下，多肽1与含氯乙酰基多肽3发生了多肽连接和侧链环化反应，生成了目的单环肽产物10(ESI-MS(m/z)：calculated for C106H157N31O31S:2393.1；found:2393.2)。在没有SortaseA酶的存在下，多肽1与含氯乙酰基多肽3没有发生反应。这些实验结果表明，多肽1和含氯乙酰基多肽3的连接和侧链环化反应是在酶催化下发生的。
如图14所示，按照类似的流程，多肽1与含氯乙酰基多肽氧酯4发生了多肽连接和侧链环化反应，生成了目的单环肽产物10。如图15所示，按照类似的流程，多肽1与含氯乙酰基多肽硫酯5发生了多肽连接和侧链环化反应，生成了目的单环肽产物10。如图16所示，按照类似的流程，多肽1与含氯乙酰基修饰二氨基丙酸的多肽6发生了多肽连接和侧链环化反应，生成了目的单环肽产物11(ESI-MS(m/z)：calculated for C103H151N31O31S:2351.1；found:2351.0)。
实施例9：
SortaseA酶催化下制备侧链环化的双环肽
配10.0mL的HEPES缓冲液(pH 7.0)，其中含有50.0mM HEPES、100.0mM NaCl、2.0mMCaCl2和1.0mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)。取1.0mL的HEPES缓冲液(pH 7.0)，加入4.0μL多肽2(序列为H-GRYDPANCIHPKGWCGGSG-NH2，99.0μg，终浓度为50.0μM)，然后加入10.0μL的SortaseA酶(90.0μg，终浓度为5.0μM)，接着加入4.0μL含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7(42.0μg，终浓度为50.0μM)。混合反应溶液后于37℃摇床中，使用高效液相色谱检测反应。且肽2和含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7预先溶解在含1％乙腈和0.1％三氟乙酸的水溶液中。
如图17所示，根据高效液相色谱的跟踪结果，在SortaseA酶的存在下，多肽2与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7发生了多肽连接和侧链环化反应，生成了目的双环肽产物12(ESI-MS(m/z)：calculated for C118H168N34O34S2:2670.1；found:2670.2)。在没有Sortase A酶的存在下，多肽2与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7没有发生反应。这些实验结果表明，多肽2和含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7的肽连接和侧链环化反应是在酶催化下发生的。如图18所示，按照类似的流程，多肽2与含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽氧酯8发生了多肽连接和侧链环化反应，生成了目的双环肽产物12。如图19所示，按照类似的流程，多肽2与3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基二氨基丙酸的多肽9发生了多肽连接和侧链环化反应，生成了目的双环肽产物13(ESI-MS(m/z)：calculated for C115H162N34O34S2:2628.1；found:2628.0)。
实施例10：
SortaseA酶催化的肽环化反应对噬菌体的修饰效率
1、构建M13KE-GX12C噬菌体文库
使用M13KE噬菌体载体(来自NEB公司)，构建GX12C多肽文库，其中X是通过NNK编码的随机氨基酸，N为A/T/C/G，K为G/T。根据M13KE载体的酶切位点Kpn I和Eag I酶切位点特征，设计核酸文库，从生物生工(上海)公司定制模板链及引物序列如下：
文库DNA(模板链1)：5’-CATGT TTC GGC CGAGCC GCC AGA GCC GCC AGA GCC GCCGCA MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN MNN GCC AGA GTG AGA ATAGAAAGG TAC CCG GGCATG-3’(M为A/C)；
引物DNA：5’-CATGCCCGGGTACCTTTCTATTCTC-3’；
文库DNA和引物DNA等比例混合退火，通过Klenow DNA聚合酶延伸产生双链DNA文库。将双链DNA文库和M13KE载体被Kpn I-HF和Eag I-HF处理，并构建带有文库DNA的重组M13KE噬菌体载体，电转化ER2738感受态细胞。所有含ER2738电转细胞的SOC培养基复苏40分钟，接种于含有早期对数生长期ER2738的LB培养基中，37℃震荡5小时产生噬菌体，蓝斑滴度测定多样性为106。
2、基于SortaseA酶的反应条件对噬菌体的影响
取五等份噬菌体(1012pfu)，分别溶解于1.0mL五种不同的溶液，溶液A：商业化中性PBS；溶液B：50.0mM HEPES，100.0mMNaCl，2.0mM CaCl2，1.0mM TCEP，pH 8.0；溶液C：50.0mMHEPES，100.0mM NaCl，2.0mM CaCl2，1.0mM TCEP，5.0μM SortaseA酶，pH 8.0；溶液D：50.0mM HEPES，100.0mM NaCl，2.0mM CaCl2，1.0mM TCEP，50.0μM含氯乙酰基多肽3(序列为AcNH-Leu-Pro-ClAcLys-Thr-Gly-NH2)，pH 8.0；溶液E：50.0mM HEPES，100.0mM NaCl，2.0mMCaCl2，1.0mM TCEP，5.0μM SortaseA酶，50.0μM含氯乙酰基多肽3(序列为AcNH-Leu-Pro-ClAcLys-Thr-Gly-NH2)，pH 8.0。噬菌体在37℃下震荡1小时后，进行滴度检测。
如图20所示，五种溶液处理的噬菌体滴度差别不大(最高和最低差别在1倍以内)，说明SortaseA酶的反应条件对噬菌体的侵染性影响很小，是一个生物兼容性好的多肽环化策略。
3、链霉亲和素磁珠捕获噬菌体
取M13KE-GX12C噬菌体(2×1011pfu)于1.0mL的HEPES缓冲液(50.0mM HEPES，100.0mM NaCl，2.0mM CaCl2，1.0mM TCEP，pH 8.0)，加入10.0μL的SortaseA酶(终浓度为5.0μM)和4.0μL的Biotin-1(序列为Biotin-βAla-βAla-Leu-Pro-ClAcLys-Thr-Gly-NH2，终浓度为50.0μM)，于37℃震荡1小时。然后聚乙二醇(4％PEG8000，0.5M NaCl)沉淀噬菌体颗粒，重悬在1.0mL的TBS缓冲液中，并梯度稀释至预定浓度的噬菌体溶液。分别取20.0μL噬菌体溶液于2个2.0mL的空离心管：A和B。向预先洗涤的链霉亲和素磁珠加入50.0μL Binding缓冲液(10.0mM Tris-Cl、150.0mM NaCl、10.0mM MgCl2、1.0mM CaCl2，pH 7.4)和50.0μLBlocking缓冲液(10.0mM Tris-Cl、150.0mM NaCl、10.0mM MgCl2、1.0mM CaCl2，0.3％Tween-20，3％(w/v)BSA)，于室温下旋转孵育1小时。向溶有噬菌体的A和B管中加入50.0μLBinding缓冲液和50.0μL Blocking缓冲液，于室温下旋转孵育1小时。然后将A管噬菌体加入链霉亲和素磁珠中，于室温缓慢旋转孵育30分钟，然后于磁力架捕获磁珠，转移上清至新的空离心管中，并用200.0μL washing缓冲液(10.0mM Tris-Cl、150.0mM NaCl、10.0mMMgCl2、1.0mM CaCl2，pH 7.4，0.1％Tween-20)洗涤磁珠2次，一并转移至含噬菌体上清的离心管中。620.0μL的经磁珠捕获的A管的上清液和B管中噬菌体进行滴度检测，噬菌体的酶修饰效率为：修饰噬菌体(％)＝[(B滴度-A滴度)/B滴度]×100％。重复该实验3次，取平均数。作为比较，我们将4.0μL的Biotin-1替换为4μL的HEPES缓冲液，进行上述相同的噬菌体捕获实验。
经过Biotin-1修饰的噬菌体中，73％的噬菌体颗粒被捕获。作为对比，未被Biotin-1修饰的噬菌体在磁珠处理前后没有明显观察到滴度的明显变化，表明SortaseA酶催化的噬菌体表面的修饰效率能够达到73％。
实施例11：
噬菌体单环肽文库构建及功能性单环肽配体筛选
1、构建pCANTAB 5E-GX12C噬菌体文库
使用pCANTAB 5E噬菌粒-辅助噬菌体(M13KO7)(来自四川阿帕克生物科技有限公司)，构建GX12C多肽文库，其中X是通过NNK编码的随机氨基酸，N为A/T/C/G，K为G/T。根据pCANTAB 5E噬菌粒载体上的酶切位点Sfi I和Not I特征，设计核酸文库，从通用生物(安徽)股份有限公司定制编码链及引物序列如下：
文库DNA(编码链1)：5’-GCT ggcccagccggccATG GCC GGC NNK NNK NNK NNK NNKNNK NNK NNK NNK NNK NNK NNK TGC GGC GGC TCT GGC GGC TCT GGC GGC gcggccgcTAAACTAT-3’(K：G/T，N：A/T/C/G；序列中的SfiI和NotI内切酶识别序列用小写字母标识)；
引物DNA：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCGCCGCC-3’；
文库DNA和引物DNA等比例混合，通过Klenow DNA聚合酶延伸产生双链DNA文库。将双链DNA文库和pCANTAB 5E噬菌粒被Sfi I和Not I处理，构建带有文库DNA的重组pCANTAB5E噬菌粒载体，电转入TG1感受态细胞，涂布于2×YT(含Amp和葡萄糖)平板过夜培养，并通过稀释法测定滴度以确定文库的多样性，并随机挑取噬菌体颗粒分析噬菌体的质量。使用甘油溶液收集初代大肠文库，保存在-80℃。通过噬菌体滴度测定，噬菌体文库多样性为4×108。
2、靶标蛋白的生物素化及其验证
蛋白质的生物素化可采用两种方法。方法一：取600.0μg靶蛋白TEAD4(26.53kDa，终浓度为10.0μM)与20倍当量的Biotin-PEG-NHS(商业购买，1000g/mol)溶解于2.0mL PBS(pH 7.4)，室温孵育1小时，再使用ZebaTM脱盐离心板去除多余的生物素试剂。方法二：取200.0μL靶蛋白TEAD4(26.53kDa，母液浓度113.5μM)与20倍摩尔过量的Biotin-PEG-NHS(1000g/mol)一起溶解于1.8mL PBS(pH 7.4)中，在室温下缓慢旋转孵育1小时。使用超滤浓缩和Lysis buffer(20.0mM HEPES,500.0mM NaCl,5％甘油,pH 7.5)置换来去除过量的Biotin-PEG-NHS。
3、针对固定化TEAD4的单环肽配体筛选
取适量储备的分装噬菌体甘油菌，室温数分钟融化后接种于2xYT液体培养基(含葡萄糖和Amp)。于37℃至OD600达到0.3～0.5。按照感染复数(MOI)为20(辅助噬菌体是TG1的20倍)加入辅助噬菌体M13KO7，于37℃侵染1小时。4℃及10000rpm离心弃去上清，收集菌体，并用2xYT培养基(含Amp和Kana，不含葡萄糖)重悬，28℃培养16小时。4℃及8000rpm离心20分钟，转移上清噬菌体于无菌离心瓶，加入预冷的5×PEG/NaCl溶液。冰浴1小时后，于4℃及10000rpm离心20分钟，弃上清。噬菌体颗粒重悬在100.0mL TBS，于4℃及10000rpm离心20分钟，转移上清至新的无菌离心瓶中，并重复一次噬菌体的PEG/NaCl沉淀过程。噬菌体菌液于4℃及10000rpm离心20分钟，弃上清，重悬于TBS中，并用0.45μm无菌过滤器过滤，4℃可保存数天，或甘油长期保存-20℃。
取1011pfu噬菌体，于1.0mL HEPES缓冲液(50.0mM HEPES，100.0mM NaCl，2.0mMCaCl2，1.0mM TCEP，pH 8.0)混匀，加入10.0μL SortaseA(9.0mg/mL)和4.0μL含氯乙酰基多肽3(序列为AcNH-Leu-Pro-ClAcLys-Thr-Gly-NH2，32.0μg，终浓度为50.0μM)，37℃，250rpm震荡1小时。然后，加入预冷的5×PEG/NaCl溶液，混匀后冰浴30分钟，4℃及10000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀重悬于1.5mL binding缓冲液，加入750μL blocking缓冲液，室温缓慢旋转30分钟。取40.0μL预洗的链霉亲和素包裹的磁珠，用376.0μLPBS重悬，加入12.8μL Biotin-TEAD4(5μg)，室温缓慢旋转30分钟后，用磁铁固定磁珠，去上清，用1.0mL PBS清洗磁珠3次，将磁珠重悬于300.0μLbinding缓冲液和150.0μLblocking缓冲液中，室温缓慢旋转30分钟。然后混合噬菌体液体和磁珠液体，常温缓慢旋转30分钟后，于磁力架上弃去上清，用1.0mLwashing缓冲液洗涤磁珠8次，再用1.0mL binding缓冲液洗涤2次。然后，磁珠重悬于100.0μL Elution缓冲液(pH 2.2)中，孵育5分钟后置于磁力架上，转移上清至含50.0μLNeutralization缓冲液(pH 8.0)的新离心管中。收集的噬菌体少量用于滴度测定，其它与TG1于37℃孵育1小时后，离心15分钟，弃去上清，重悬菌体于2×YT，涂2×YT(含Amp和葡萄糖)大板，28℃倒置过夜，第二天用2×YT(含Amp)刮下，并按照上述流程进行第二、三和四轮噬菌体制备及筛选。
经过四轮筛选噬菌体的滴度增加了100倍，表明噬菌体发生了富集。随机挑选第四轮和第三轮噬菌体颗粒测序，发现一个高度富集的多肽序列(序列为GQWPKSFWDFSLGCGGSG)。如图21所示，合成了该序列对应的荧光素修饰的环肽14(FAM为5(6)羧基荧光素修饰)，并进行靶标TEAD4的偏振荧光测试，其结合TEAD4的亲和力为2.1μM。这些结果表明，本专利中技术方案用于筛选功能性单环肽的有效性。
实施例12：
噬菌体双环肽文库构建及功能性双环肽配体筛选
1、构建pCANTAB 5E-GX6CX6C噬菌体文库
使用pCANTAB 5E噬菌粒-辅助噬菌体(M13KO7)(来自四川阿帕克生物科技有限公司)，构建GX6CX6C多肽文库，其中X是通过NNK编码的随机氨基酸，N为A/T/C/G，K为G/T。根据pCANTAB 5E噬菌粒载体上的酶切位点Sfi I和Not I特征，设计核酸文库，并从通用生物(安徽)股份有限公司定制编码链及引物如下：
文库DNA(编码链2)：5’-GCT ggcccagccggccATG GCC GGC NNK NNK NNK NNK NNKNNK TGC NNK NNK NNK NNK NNK NNK TGC GGC GGC TCT GGC GGC TCT GGC GGC gcggccgcTAAACTAT-3’(K：G/T，N：A/T/C/G；序列中的SfiI和NotI内切酶识别序列用小写字母标识)；
引物DNA：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCGCCGCC-3’；
文库DNA和引物DNA等比例混合，通过Klenow DNA聚合酶延伸产生双链DNA文库。将双链DNA文库和pCANTAB 5E噬菌粒被Sfi I和Not I处理，构建带有文库DNA的重组pCANTAB5E噬菌粒载体，电转入TG1感受态细胞，涂布于2×YT(含Amp和葡萄糖)平板过夜培养，测定滴度以确定文库的多样性，并随机挑取噬菌体颗粒分析噬菌体的质量。甘油收集初代大肠文库，保存在-80℃。通过噬菌体滴度测定，噬菌体文库多样性为2×108。
2、针对固定化TEAD4的双环肽配体筛选
取适量储备的分装噬菌体甘油菌，室温数分钟融化后接种2×YT液体培养基(含有葡萄糖和Amp)。37℃培养至OD600达到0.3～0.5。按照感染复数(MOI)为20(辅助噬菌体是TG1的20倍)加入辅助噬菌体M13KO7，于37℃侵染1小时。然后，4℃及10000rpm离心15分钟，弃去上清，收集菌体，并用2×YT培养基(含Amp和Kana，不含葡萄糖)重悬，28℃震荡培养16小时。于4℃及8000rpm离心20分钟，转移上清噬菌体于无菌离心瓶，加入预冷的5×PEG8000/NaCl溶液，冰浴1小时。4℃及10000rpm离心20分钟，弃上清，噬菌体颗粒重悬在50～100mL TBS，于4℃及10000rpm离心20分钟，转移上清至新的无菌离心瓶中，并重复一次噬菌体的PEG/NaCl沉淀过程。噬菌体菌液于4℃及10000rpm离心20分钟，弃上清，重悬于TBS中，并用0.45μm无菌过滤器过滤，4℃可保存数天，或甘油长期保存-20℃。
取1011pfu噬菌体，于1.0mL HEPES缓冲液(50.0mM HEPES，100.0mM NaCl，2.0mMCaCl2，1.0mM TCEP，pH 7.0)混匀，加入10.0μL SortaseA(9.0mg/mL)和4.0μL含3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基多肽7(序列为AcNH-Leu-Pro-CabLys-Thr-Gly-NH2，42.0μg，终浓度为50.0μM)，37℃，250rpm震荡1小时。然后，加入0.25mL预冷的5×PEG/NaCl溶液，混匀后冰浴30分钟，于4℃及10000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀重悬于1.5mLbinding缓冲液，加入750μL blocking缓冲液，室温缓慢旋转30分钟。取40μL预洗的链霉亲和素包裹的磁珠，用376μLPBS重悬，加入12.8μL Biotin-TEAD4(5μg)，室温缓慢旋转30分钟后，用磁铁固定磁珠，去上清，用1.0mL PBS清洗磁珠3次，将磁珠重悬于300.0μL binding缓冲液和150.0μLblocking缓冲液中，室温缓慢旋转30分钟。然后混合噬菌体液体和磁珠液体，常温缓慢旋转30分钟后于，于磁力架上弃去上清，用1.0mL washing缓冲液洗涤磁珠8次，再用1.0mLbinding缓冲液洗涤2次。然后，磁珠重悬于100.0μL Elution缓冲液(pH 2.2)中，孵育5min后置于磁力架上，转移上清至含50.0μLNeutralization缓冲液(pH 8.0)的新离心管中。收集的噬菌体少量用于滴度测定，其它与TG1于37℃孵育1小时后，于4℃及4000rpm离心15分钟，弃去上清，用2×YT重悬菌体，涂2×YT(含Amp和葡萄糖)大板，28℃倒置过夜，第二天用2×YT(含Amp)刮下，并按照上述流程进行第二、三轮噬菌体制备及筛选。注意，第三轮筛选中，我们使用了不包括靶标蛋白的磁珠作为对照筛选。
经过三轮筛选噬菌体的滴度增加了10倍，特别是其滴度是第三轮对照组的135倍，表明噬菌体发生了显著富集。随机挑选第四轮和第三轮噬菌体颗粒测序，发现一个高度富集的多肽序列(序列为GLTSWVSCHFLRSLCGGSG)。如图22，合成了该序列对应的荧光素修饰双环肽15(FITC：异硫氰酸荧光素酯修饰)，并进行靶标TEAD4的偏振荧光测试，其结合TEAD4的亲和力为63.9nM。这些结果表明，本专利中技术方案用于筛选功能性双环肽的有效性。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种连接酶催化的多肽环化方法，其特征在于，所述连接酶催化的多肽环化方法包括以下步骤：
S1、制备侧链含低反应性基团的SortaseA酶识别的多肽类化合物，且该化合物具有以下结构通式：
其中，Xa为氢、乙酰基、由除半胱氨酸外天然或者非天然氨基酸组成的寡肽基中的任意一种；Xb为亲电体基团、含亲电体基团的由天然或者非天然氨基酸组成的寡肽基中的任意一种，其中亲电体基团包括氯乙酰基、3,5-二[(2-氯乙酰基)氨基]苯甲酰基；Xc为氧(氧酯键)、氮氢(酰胺键)、硫(硫酯键)中的任意一种，Xd为氨基、由除半胱氨酸外天然或者非天然氨基酸组成的寡肽序列中的任意一种；n为1～5之间任何一个数目；
S2、利用以上多肽类化合物在SortaseA酶存在条件下与N-末端为甘氨酸且序列中含半胱氨酸的多肽模板在缓冲盐溶液中发生多肽连接和多肽侧链环化，产生环肽分子；
S3、选取S2中的N-末端为甘氨酸且序列中含半胱氨酸的多肽模板，通过基因编码融合表达在噬菌体pIII蛋白质的N末端，再经过S2步骤操作来构建噬菌体展示的环肽库，并针对靶标蛋白筛选环肽配体。
2.根据权利要求1所述的一种连接酶催化的多肽环化方法，其特征在于，所述S2中多肽模板为以下两种：
模板a：G-(X)m-C；模板b：G-(X)m-C-(X)y-C；
其中，模板a用于构建单环肽，模板b用于构建双环肽，G代表甘氨酸，X代表任意一种天然L-氨基酸，C代表L-半胱氨酸且位置可以根据要求改变，m和y代表3～20之间的氨基酸数目。
3.根据权利要求1所述的一种连接酶催化的多肽环化方法，其特征在于，所述SortaseA酶是其野生型或者突变体。
4.根据权利要求1所述的一种连接酶催化的多肽环化方法，其特征在于，所述S2中多肽类化合物的浓度范围为0.1μM～10.0mM，SortaseA酶的浓度范围为0.1μM～10.0mM。
5.根据权利要求1所述的一种连接酶催化的多肽环化方法，其特征在于，所述S2中的缓冲盐溶液为除磷酸盐外的常用缓冲液，包括HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、NaOAc(乙酸钠)和Tris(三羟甲基氨基甲烷)中的任意一种，其中含CaCl20.1 mM～10mM，和TCEP(三(2-羧乙基)膦)0.1μM～10.0mM，pH范围为6.0～9.0。
6.根据权利要求1所述的一种连接酶催化的多肽环化方法，其特征在于，所述S2中多肽连接和多肽侧链环化反应的时间为15分钟～6小时，反应温度为20～45℃。
7.根据权利要求1所述的一种连接酶催化的多肽环化方法，其特征在于，所述S3中的噬菌体包括由pCANTAB 5E噬菌粒和辅助噬菌体M13KO7组成的噬菌体***或M13KE噬菌体***。
8.根据权利要求1所述的一种连接酶催化的多肽环化方法，其特征在于，所述S3中针对靶标蛋白筛选环肽配体包括以下步骤：
S3-1、利用所述的连接酶催化的多肽环化方法构建噬菌体展示的单环肽或双环肽文库；
S3-2、靶标蛋白被生物素化，固定在磁珠上，所述S3-1中噬菌体展示的单环肽或双环肽文库与固定化的靶标蛋白共孵育，经过2～4轮生物淘选，对生物淘选后的噬菌体颗粒进行测序；
S3-3、根据测序结果合成富集的目标环肽，评价与靶标蛋白的结合力和生物活性。
9.一种如权利要求1-8所述的连接酶催化的多肽环化的应用，其特征在于，所述多肽环化应用于基因编码环肽文库的构建，包括对噬菌体展示的多肽文库进行多肽连接和侧链环化，构建噬菌体展示的单环和双环肽库。
10.根据权利要求9所述的一种连接酶催化的多肽环化的应用，其特征在于，所述连接酶催化的多肽环化得到的环肽配体应用于药物、检测试剂盒或其它生物医学和生物材料的开发。
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