CN1044103A - 抗人绒毛膜***抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对hCG具有结合活性的多肽。
本发明还涉及编码这类多肽的核苷酸序列，含有这类多肽的药物制剂和含有这类多肽的免疫试剂。

Description

本发明涉及与hCG有免疫反应性的多肽，其hCG结合片段，编码该多肽的核酸或含有该编码序列的核酸，含有这些核酸的宿主细胞，药物产品，以及含有该多肽和/或其片段的免疫试剂。
为了控制人类的生育，常常给女性服用药物。这些药物中的活性物质干预了一个或多个在繁殖中发挥作用的生物过程。
几十年来人们主要是使用甾类化合物来达到控制生育的目的，该类化合物能影响到***。
在过去的十年中，人们也把注意力转向干扰繁殖过程、尤其是hCG激素（人绒毛膜***）发挥作用的过程中的其它关键时期。hCG是一种糖蛋白激素，它尤其是由胎盘的滋养层组织分泌，并在与特定的膜受体结合后刺激甾类激素的产生。所产生的甾类激素（特别是孕酮）负责维持妊娠。因此，通过抑制hCG的功能就可导致妊娠的流产。
人们曾试图通过免疫学方法抑制hCG的功能。为此，给人服用经修饰的hCG，以期发生免疫反应。该方法至今未被证明是成功的。总之，人们发现所产生的抗体量太低，或者是所产生的抗体缺乏所需的专一性，以大量捕获hCG。
因此，人们已选择了另一种方法，在该方法中，通过服用与hCG特异反应的多肽（如抗体）而成功地降低了hCG的浓度。
天然存在的抗体（免疫球蛋白，Ig）尽管分化成各种类型，但仍具有共同点，即它们都至少具有两个抗原结合（Fab）区。因蛋白质保留（Fc）区的差异而导致抗体类型的不同。通常是分化为以下类型：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM;经常也将这类型进一步分为各亚型。图1显示了IgG分子的结构，其详细结构将在以下讨论。抗体分子由多肽轻链和多肽重链组成，它们分别被称作L和H，具有氨基末端的各个多肽链区与抗原的特异结合有关，这些区域具有很大程度的可变性。事实上，对于抗一种抗原的特定部分（抗原决定基）的每一种抗体来说，这些区域是特定的。它们分别被称作LFv和HFv，它们共同形成抗体分子FV区。具有羧基末端的链区则很少变化，即，它们只显示出以上所提到的各种型和亚型特有的差异，它们分别被称作LFc和HFc。
来自不同动物种的相应抗体类型的FC区通常在氨基酸组成和序列上显示出明显的差异。
因此，来自另一种动物种的抗体将被识作异物而引起免疫排斥反应。
最近的研究表明，Fv区本身由或多或少的可变区组成，已发现高度可变（超变）区专门负责抗原结合，它们被称作CDR′S（互补决定区），每一条链有三个CDR′S，它们埋在所谓的FR′S（骨架区）中。后者的功能可能是维持CDR′S处于正确位置的空间结构。Fv区的六个CDR′S共同形成抗体与其所抗抗原的总的接触位点。
从以上所述的关于免疫球蛋白的分子的精细结构以及由各种亚结构所赋予的功能的详细知识中可以看到，从理论上讲有可能有目的地对这些分子进行修饰。重组DNA技术尤其适合于这一目的，而且已叙述了这种类型的遗传操作技术的大量实际应用。
Schering公司的欧洲专利公开No.0        088        994叙述了含有编码特定免疫球蛋白的LFv和HFv片段的DNA序列的表达载体，以及这类免疫球蛋白片段在大肠杆菌（E.COli）中的表达。
Celltech公司的EP        0        120        694尤其涉及在一种宿主细胞中表达一种免疫球蛋白的轻链和重链，或其Fv片段。根据需要，以这种方式制备的免疫球蛋白可由一个与一特异单克隆抗体相同的Fv区和一个来自另一抗体的Fc片段组成（所谓的“嵌合免疫球蛋白”）。
同上述两个专利文献一样，Genentech和City        of        Hope的EP0        125        023涉及在一种宿主细胞中表达编码一种免疫球蛋白片段或一种嵌合免疫球蛋白的DNA，这里的宿主细胞是原核或真核微生物。
与此类似，日本Research        Development公司的欧洲专利EP0        171        496叙述了通过重组DNA技术制备嵌合抗体，其中，特别是其Fc区相应于作人免疫球蛋白的Fc区。
Celltech公司的WO86/01533具体限定了在不灭的哺乳动物细胞中表达具有抗原结合区的嵌合蛋白，其另一个蛋白质区可以是另一种免疫球蛋白的Fc区，但也可能是（一部分）另一种蛋白质（例如酶）。
Winter的欧洲专利0        029        400叙述了修饰抗体的制备，其中至少部分Fv区的CDR′S已被另一种免疫球蛋白的相应CDR′S取代。通过这一技术（称作“CDR移植”）就有可能将CDR′S从例如小鼠单克隆免疫球蛋白转移至具有人免疫球蛋白其它方面性质的分子中。
本发明的目的就是要提供对hCG具有特别专一的亲和力的多肽（尤其是免疫球蛋白或其片段）。
在多肽与hCG类似物发生交叉反应的危险性很高的情况下，本发明的多肽尤其能用于hCG的特异识别。具体地说，它涉及到与人黄体化激素（hLH）及人卵刺激激素（hFSH）等蛋白质的交叉反应。这两种蛋白质和hCG一样，也由两条多肽链组成，其中一条（α链）与hCG的相同，另一条（β链）显示出与hCG的β链不同程度的强烈同源性。
因此试图找到被人体耐受的抗体，它们对hCG具有很强的亲和力，但对hCG的相似蛋白质的结合程度很低。具体地，已发现合适的抗体为具有一个或多个以下CDR′S的多肽：
(i)ARG-ALA-SER-GLU-SER-VAL-ASP-ASN-ASN-GLY-ILE-SER-PHE-MET-ASN；
(ii)ALA-ALA-SER-ILE-GLN-GLY-SER；
(iii)-GLN-GLN-ILE-LYS-GLU-VAL-PRO-PRO-THR；
(iv)ASP-TYR-ASN-MET-HIS；
(v)TYR-ILE-TYR-PRO-TYR-SER-GLY-PRO-THR-GLY-TYR-ASN-GLN-ARG-PHE-ASN-SER；
(vi)GLU-GLY-ILE-PHE-TYR-THR-MET-ASP-TYR。
当然，其功能与上述CDR′S一致的CDR′S以及与上述CDR′S的不同在于其中一个或多个氨基酸已被取代或发生变化但未导致CDR的特定空间结构被破坏的CDR′S都适合于这一应用。
本发明的多肽可含有一个或多个上述CDR′S或其功能等价物，最好是与天然存在的和/或人工合成制造的FR′S连在一起。
本发明多肽轻链和重链的N-末端区的序列分别示于图2和图3，这些N-末端区共同形成一个hCG结合抗体片段（FhCG），编码这些氨基酸序列的核苷酸序列也示于这些图中。在图2和图3的氨基酸序列中以及核苷酸序列中均框出了CDR′S。
除图2和图3所示的FR′S外，也可使用其它天然存在的FR′S或与天然存在的FR′S具有相同功能的氨基酸序列。例如，与人抗体FR′S相对应的序列。
hCG结合抗体片段FhCG亦按以上方式使用，也可将其结合到较大的多肽中。
为此，可将两个或多个所说FhCG多肽彼此偶联-最好通过共价双键或通过一支持物。另一种可能就是将一抗体链的Fc片段的至少一部分与一种或两种Fv片段的C末端共价偶联（可通过所谓的连接子）。
再一种可能就是将一种或两种Fv片段通过C末端与（部分）其它多肽偶联，最好是不在服用多肽的生物体中引起免疫反应。
按照本发明，是通过例如重组DNA技术来制备多肽。为此，按已知方法将编码所需多肽的核苷酸序列***到一载体中，该载体适合于所选宿主细胞的稳定转化，该宿主获得了产生所说多肽的能力。在一个这种类型载体中，所需核苷酸序列是按其表达控制成分（转录***）与其功能连接的方式结合进去。同时，所说载体可含有保证其功能相关部分在宿主细胞中复制的成分。为此，载体可含有它本身的复制子，如E.COli中的复制起点，或SV40的复制起点。在真核细胞的情况下它也可被使用。真核细胞也可被以稳定方式整合到宿主细胞染色体转化。
可以利用的宿主细胞为原核或真核细胞，尤其是哺乳动物细胞;最好是使用哺乳动物细胞，因为这些细胞能够影响到转录后的处理，如多肽的糖化和装配。
可在体外培养被适当载体转化的宿主细胞，该载体含有如本发明多肽编码的核苷酸序列，并在合适的条件下产生-最好分泌-所需杂交多肽。用于这一目的的培养***及培养条件依赖于所选择的宿主细胞。最好是所选择的条件能够使所需多肽分泌至培养液中，如果合适的话，可从培养液中进一步分离多肽。
本发明的多肽可用于防止妊娠，但也可用于其它的治疗目的，如抗绒膜癌或其它产hCG肿瘤。hCG结合多肽也可应用于诊断，如体内诊断（例如肿瘤定位）和体外诊断，体液（血液、血清、尿液等）中hCG的测定。
对于治疗目的，本发明的多肽是在加到可作治疗用的载体上之后被服用。具体地说，这种载体含有水，也可能含有PH缓冲化合物，稳定剂，抗生素，碳水化合物，甘氨酸，以及苄醇等。
当用于抗绒膜癌时，是将本发明的多肽与能够抑制或阻止肿症形成和/或能够杀死或协助杀死肿瘤细胞的物质一起服用，或者是将它们偶联后服用。为此，可将多肽与例如细胞生长抑制物质或细胞毒性物质偶联。
当进行hCG的体外诊断时，可将hCG结合多肽，例如颗粒、固体支持物或标记物结合。
实施例1
本实施例叙述了一种杂交抗体的生产，该抗体的可变部分（v）来自小鼠，恒定部分（c）来自人。根据来自两个物种的遗传物质构建编码轻链和重链的基因。
从一种产生抗hCG骨髓瘤细胞系分离出编码可变区的基团。从中分离RNA，制备cDNA（Gubler，u.，和Hoffmamn，B.T.和Sambrook，J.，Molecular        Cloning：a        laboratory        man        ual        Cold        Spring        Harbor        Laboratory，Cold        Spring        Harbor，New        York，1982）在噬菌体Kgt10中构建cDNA库。通过与探针杂交而筛选克隆，该探针得自两个恒定区的已知核苷酸序列（γ和K）（Honji，T.，Obata，M.，Yanawaki-Kataoka，Y.Katoaka，T.，Kawakami，T.，Takahoshi，N.和Mano，Y.，Cell        18，559-568，1979;Max.E.E.，Maizel，J.V.和Leder，P.，J.Biol.Chem.256，5116-5120，1981）。
然后将按此方式获得的克隆***物转移至噬菌体M13中，并使用双脱氧法（Sanger，F.，Nicklen，S.和Coulson，A.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467，1977）测定可变区（L和H链）的核苷酸序列（分别为图2和图3所示）。从这一序列进一步得到氨基酸序列和CDR′S位置。
通过使用这些V区的核苷酸序列和早已经公开的人C区的核苷酸序列，构建了杂种H和L基因。
图4给出这些基因的图示。
借助限制酶识别位点同时在5′-和3′-侧限制这些可变片段。为此，在AUG起始密码子位置前不远的5′-侧***EcoRI连接子（图2和3中1-6核苷酸）建立一个EcoRI酶的识别位点。在3′-侧使用了已存在的Sau        3AI酶（在可变H区末端前的56个核苷酸）和BanI酶（在可变L区末端前的22个核苷酸）的识别位点。用这种方法得到的EcoRI-Sau        3AI和EcoRI-BanI片段分别编码实际上完全的H和L基因可变区。
编码恒定H区的基因是从人胎儿肝脏DNA库中得到的（Takahashi，N.，Neda，S.，Obata，M.，Nikaido，T.，Nakai，S.and        Honjo，T.，Cell        29，671-679，1982）。选择Aγ2基因。将该基因分离为大约2200碱基对的NarI-SphIDNA片段。将NarI识别位点定位于第一外显子（CH1）的20位处;SphI识别位点位于大约离终止密码子650个碱基对处，这样除前20个碱基外，完整的CH序列定位于这一DNA片段上。此外，3个内含子和天然多聚腺苷酸化信号（Ellison，J.and        Hood，L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，1984-1988，1982）也定位于这一片段上。
通过寡核苷酸合成将编码人k恒定部分的基因制备成315个碱基对的NarI-BamHI片段，在编码Ck部分的11位建立NarI识别位点。此外，在该基因中间部位建立一个PstI识别位点，这样合成能够分两半进行。选择这两个识别位点，从而由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列（Hieter，P.A.，Max，E.E.，Seid-man，J.G.，Maizel，J.V.and        Leder，P.，Cell        22，197-207，1980）不会经历任何修饰。与Hieter等人的序列相比，在4处引入了其它碱基，即：344位，T→G;347，A→G;473，C→G和476，A→G（从Hieter等人的序列编码，见上）。
在该片段末端的Bam        HI识别位点与终止密码子（5′-TAGGTATCC-3′）部分重叠。在5个和6个寡核苷酸的两个嵌段中进行合成。通过互补合成制备一些来自嵌段的寡核苷酸并借助T4-DNA连接酶互相连接且***到噬菌体M13中。检查核苷酸序列后，将两个嵌段连接起来形成NarI-BamHI        Ck片段。在Applied        Biosystem        318ADNA合成仪上进行寡核苷酸合成。
为了使H和L基因二者的两个V和C片段互相连接，设计了编码V的最后几个氨基酸和（连续）编码C的前几个氨基酸的DNA片段（在图4中称为连接子）（分别为Sau3        AI-NarI和BanI-NarI）。再化学合成这些DNA片段。V和C片段通过连接片段偶联得到了嵌合基因，这两条链的每一条中的嵌合基因都编码相关的各链片段的原始氨基酸序列，此外尽可能含有原始碱基序列（图4中的“连接子”）。这样得到的DNA片段编码其中V区的氨基酸序列完全得自于小鼠而C区得自于人的免疫球蛋白链。如上所述，这些核苷酸序列是小鼠V区和人C区的。
为了便于***到表达载体中，通过连接子的加入将H基因的SphI识别位点修饰成BamHI识别位点，使得这两个基因都定位于EcoRI-BamHI片段上。
用于在真核细胞中表达的载体大多得自于PKCR（O′Hare，K.，Benoist，C和Breathnach，R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78，1572-1531，1981）。
称为pKMS的载体示于图5中并由下列成分组成：
a.人金属硫堇-IIA启动子（MT-IIA），由此发生***基因（X，为H或L基因）的转录。将启动子定位于837碱基对Hind-III-NcoI片段上（就转译开始而言为-764和+73;Karen，M.and        Richards，R.I.，Nature.299，797-802，1982），其NcoI识别位点已经被修饰在EcoRI位点。为此先借助于Mung        Bean核酸酶除去NcoI识别位点。然后将MT-IIA片段***到M13mp11中（Hind        IIIx        SstI，SstI位点已通过用Mung        Bean核酸酶消化变得“平整”）。MT-IIA片段作为EcoRI-Hind        III-DNA片段从M13mp11-ds-DNA中分离出来;
b.用于实现尽可能高度转录的Mu        LV（E）-和SV40-增强子序列。逆转录病毒增强子得自于Mu        LV的LTR并由长为203个碱基对的Sau        3AI-XbaIDNA片段组成（Van        Beveren，C.，Rands，E.，Chattopadhyay，S.K.，Lowy，D.Rand        Verma，I.M.，J.Virol.41，542-556，1982）。SV40-DNA片段长为326个碱基对并含有早期启动子（得自于pSV2        CAT质粒的Hind        III-PvuII片段，Gomnan，C.M.，Moffat，L.F.and        Howard，B.H.，Molec.Cell.Biol.2，1044-1051，1982）。Mu        LV-增强子的XbaI识别位点最初连接于pBR322的EcoRI识别位点上（通过用Mung        Bean核酸酶消化使EcoRI识别位点变得“平整”）。然后将pBR322的Hind-III识别位点用于MT-IIA启动子的附着，这样得自于pBR322的29碱基对“EcoRI”-Hind-III片段定位于Mu        LV增强子和MT-IIA启动子之间。唯一的ClaI识别位点定位于这一片段上。通过利用DNA聚合酶I使Mu        LV增强子SauIIIA识别位点变纯并附着于SV40启动子的PauII侧;
c.兔β-珠蛋白基因的最后（编码）部分和SV40转译终止区，借此无内含子基因（如嵌合k-基因）在初级信使RNA上装备上内含子并具有终止区;
d.带有用于在大肠杆菌中复制和选择的大肠杆菌复制起始点和氨苄青霉素抗性基因的pBR327序列。最后提到的成分以及在C下所提到的区都是从pKCR质粒的最大BamHI-EcoRI片段中得到的（O′Hare，K.，Benoist，C和Breathnach，R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78，1527-1531，1981），条件是所谓pBR322的“有毒序列”已通过与pBR327的同源区交换而除去并且最后的编码β-珠蛋白-外显子已被大量除去（碱基对1122-1196：VanOoyen，A.，van        den        Berg，J.，Mantel，N.and        Weissmann，C.，Science206，337-344，1979）。通过用EcoRI和BglII酶（其识别位点存在于β-球蛋白基因中）部分消化和用DNA-聚合酶I填充“粘性末端”实现后者。然后两个末端互相连接。
通过用DNA聚合酶填充除去存在于pKCR中的第二个EcoRI识别位点。在pKMS的构建过程中下列成分（以正确的顺序）定位于这一填充的EcoRI识别位点和SV40启动子的Hind-III识别位点之间：
-得自pBR322的EcoRI（填充的）-ClaI-DNA片段（24个碱基对）;
-多连接子区：得自M13mp10的Hind-II-Hind-III-DNA片段。
在pKMS的EcoRI和BamHI断裂位点之间各自独立地***嵌合H和L基因。这样形成的质粒称为pKMS.H和pKMS.L，被用于通过磷酸钙沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO.K1;ATCC        CCL-61）（Wigler，M.，Pellicer，A.，Silverstein，S.，Axel，R.，Urlaub，G.and        Chasin，L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA        76，1373-1376，1979）。为此，使用一种DNA混合物，该混合物的组成为10.6ug        pKMS.H，8.2μg        pKMS.L和1.2μg含有新霉素抗性基因和对重金属有抗性的MT-IIA基因的质粒（pAG60，Colbere-Garapin，F.，Horodinceau，F.，Kourilsky，P.和Garpin，A.A.，J.Mol.Biol.150，1-14，1981）以及3kb P含有整合于Hind-III识别位点的人MT-IIA基因的Hind-III-DNA片段（Karin，M.and Richards，R.I.，Nature 299，797-802，1982）。转染后过48小时通过用浓度为0.8m/ml的+G418培养基更新培养基开始选择。大约14天后，开始第二次选择。为此将选出的有新霉素基因存在的细胞群体***成五部分，加入含有50mM ZnCl2和1-5μmCdCl2浓度增强的培养基。用这种方法实现能把MT-IIA基因带到表达井中的细胞选择。因为免疫球蛋白质粒以与选择质粒相同的时间被转染并且可能在同一位点整合于染色体DNA中，所以可能在发生MT-IIA基因高度表达的细胞中免疫球蛋白基因也将被带到表达井中。然后检测用Cd2+选择的特异细胞群体上清液中嵌合抗体的存在。克隆来自抗体产量最高的Cd2+-抗性细胞群体的细胞。检测抗体的试验基于一种“夹心”EIA，将样品加入到附着有羊抗人IgG的微滴板孔中。洗脱后，带有样品的板与抗人山羊血清和辣根过氧化物酶的结合物一起保温。在加入底物TMB后通过颜色反应检测酶结合抗体与孔的结合。用与板结合的hCG和针对与HRP偶联为结合物的人Ig的山羊血清进行类似的试验。在这两种试验中G418-抗性细胞群体都为阳性。这意味着用上述质粒转染的CHO.K1细胞能够分泌由人免疫球蛋白轻链和重链组成的蛋白质。此外，该蛋白质能结合到hCG上。
实施例2
第二个例子描述编码某一杂种抗体的基因的构建，其中只有部分可变区即CD′S得自于小鼠，而FR′S和恒定部分来源于人。已经化学合成了可变的重链和轻链基因序列。设计这些基因的方法是CDR区与图2和3中方框里的序列相同，而FR区得自于称为WEA的人抗体（Goni，F.，and        Frangione，B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80，4837-4841，1983）。信号序列得自于Vx        I和VH        III基因系的同感序列。WEA抗体链是这些基因系的代表。合成并以9段装配58个寡脱氧核糖核苷酸，其大小变化范围为25-48个核苷酸。在一段中的寡核苷酸的5′-末端被5′-磷酰化（两个最外面的寡核苷酸例外），退火并连接到M13mp11RF中。通过序列分析选出各段中的DNA克隆。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化DNA片段并将它们连接起来形成完整可变区序列。完全的免疫球蛋白基因的构建，***到载体中的情况和中国仓鼠卵巢细胞的转染如前例所述。

Claims (10)

1、具有结合hCG活性的多肽，其特征在于它包含至少下列多肽片段之一：
(i)ARG-ALA-SER-GLU-SER-VAL-ASP-ASN-ASN-GLY-ILE-SER-PHE-MET-ASN；
(ii)ALA-ALA-SER-ILE-GLN-GLY-SER；
(iii)-GLN-GLN-ILE-LYS-GLU-VAL-PRO-PRO-THR；
(iv)ASP-TYR-ASN-MET-HIS；
(v)TYR-ILE-TYR-PRO-TYR-SER-GLY-PRO-THR-GLY-TYR-ASN-GLN-ARG-PHE-ASN-SER；
(vi)GLU-GLY-ILE-PHE-TYR-THR-MET-ASP-TYR。
2、至少含有免疫蛋白链一个区，具有通过所谓框架区相互连接的抗原结合区的多肽，其特征在于它至少包含一个含有下列多肽片段之一的抗原结合区：
(i)ARG-ALA-SER-GLU-SER-VAL-ASP-ASN-ASN-GLY-ILE-SER-PHE-MET-ASN；
(ii)ALA-ALA-SER-ILE-GLN-GLY-SER；
(iii)-GLN-GLN-ILE-LYS-GLU-VAL-PRO-PRO-THR；
(iv)ASP-TYR-ASN-MET-HIS；
(v)TYR-ILE-TYR-PRO-TYR-SER-GLY-PRO-THR-GLY-TYR-ASN-GLN-ARG-PHE-ASN-SER；
(vi)GLU-GLY-ILE-PHE-TYR-THR-MET-ASP-TYR。
3、DNA序列，其特征在于编码权利要求1-2的多肽。
4、DNA序列，其特征在于它的一个区编码权利要求1-2的多肽。
5、重组DNA，其特征在于它含有权利要求4的核苷酸序列。
6、含有权利要求4的DNA序列，在表达控制成分指导下的表达载体。
7、已由权利要求4的表达载体转化并能够产生权利要求1的多肽的宿主细胞。
8、含有权利要求1-2的多肽的药物制剂。
9、含有权利要求1-2的多肽用于诊断或治疗的免疫试剂。
10、权利要求9的免疫试剂，其特征在于它与不溶性载体，颗粒，标记物或细胞毒性物质键合。
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