JPH02231567A - 血清又は血液中の物質を診断検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Φメラモノクロナール抗体又ｈそのフラグメ
ントヲ診断試験に使用することに関する。

従来の技術 臨床上の診断において、モノクロナール抗体を製造する
ハイデリドーマ技術が開発されて以来、該抗体は広く免
疫測定に使われている。この際にたいていの場合、モノ
クロナール抗体はマウス細胞系で製造し、それ故抗原％
異的な超可変領域は別としてマウス％異性領域だけを有
する。このようなマウスからのモノクロナール抗体を免
疫測定に、例えばＲｌ，　ＩＲＭＡ，　Ｈ？ＭＡに使用
する。所謂゜サンドウィッチ１アツセイ、例えばＢａｔ
，ＩＳＡ法（　ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕ
ｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ　）では診断する際にヒ
トの血液又は血清中に含まれる物質を、一方が固相に固
定されておりかつ第２のものが標識を有する２種の抗体
を介して検出する。通常、標識は酵素標識であり、これ
により検出のために呈色反応を惹起させることができる
。

しかしながらここ数年このような診断検出をする際に特
定の患者では法外に高い偽値が頻繁に確認された。この
法外に高い数値は、２つの事情、つまり ａ）　　２つの抗体、即ち壁に固定した抗体とシグナル
担持抗体とを抗原により架橋することをベースとする＠
伊ンドウイツチ１試験の構想及び ｂ）患者の血清中で所謂異好性抗体又は抗一マウスー抗
体の形成 が重なる場合に認められる。

ヒト毘好性抗体は鴇なる動物種のＩｇＧに対して、とり
わけマウスのＩｇＧに対して作用し、それ故一般に試験
抗体が関係している。しかし異好性抗体はしばしばラッ
ト、牛、羊、馬、モルモット又はサルのＩｇＧ，または
犬、ネコ又はイエウサイのＩｇＧとの交叉反応も呈する
。この原因は種々のＩｇＧ分子のＦ（ａｂ’）１フラグ
メント（　Ｂｏａｃａｔｏ及び８ｔｕａｒｔ共著、Ｃｌ
ｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　３２巻、１４９１〜１４９５頁（
１９８８年）〕又はＦｃ部分［　Ｃｌａｒｋ及びＰｒｉ
ｎｃｅ共著、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｗ−ｓ　３　３巻、４１
４Ｎ（１９８７年）］中の共通のエビトープであるよう
に思われる。

このような異好性抗体はヒトに広く分布してお ＃９、恐らく動物生産物との関わりにより又はその注入
により形成された。人体中での抗−マウスー抗体の発生
の原因も主にそれに帰せられる０ １サンドウィッチ“アツセイでは、多価異好性［体又は
抗一マウスー抗体がモノクロナール抗体に、抗原が存在
しなくとも結合することにより検出抗体と同相抗体との
架橋が惹起され、それ故誤つ九試験シグナルが誘発され
、かつ他方では正しい抗原結合を試験抗体が立体的に阻
害する。

それ故、１サンドウィッチ１イムノアツセイにおける仁
のような試験の妨害ｔ−回避するために、鴨なる種、例
えばマウス又はラットのモノクロナール抗体を使用する
ことが提案された［：　ＢＯ８ＣａｔＯ及び８ｔｕａｒ
ｔ共著、Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．ｅ４３巻、２７〜３３
画（１９８８年）〕。しかしこの方法では前記の課題を
解決することはできない。それというのも既に記載した
ように、ヒト異好性抗体はいろいろな動物種のＩｇＧに
対して作用するからである。多数の患者の異好性抗体は
マウスＩｇＧとも、またラットＩｇＧとも反応ずる。現
在高い効率を有するモノクロナール抗体はマウス及びラ
ットカらしか得られないのエ で、自から制限されたものとなっている。

一に、異好性抗体を含有する血清を試験する際に試１９
結果に誤差のないようにするために、モノクロナール試
験抗体が由来している神の非イムｙ　（　Ｎｉｃｈｔ−
１ｍｍｕｎ　）　ＩｇＧの添加により患者の抗体ｔｌ−
飽和することが提案された（　Ｂｏｓｃａｔｏ及び８ｔ
ｕａｒｔにより）。しかしこのように多量のマウス抗体
を用意することは問題が多く、高価でありかつ明らかに
所望の結果をもたらさない。

血清中に含まれる鴨好性抗体をポリエチレングリコール
沈殿により除去することが提案された［　Ｋａｈｎ及び
その他共著、Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｅｏｄｏｃｒｉｎ．Ｍ
ｅｔａｂｏｌｉａｍ．＊　６　６巻、５２６〜５３６頁
（１９８８年）］。しかしこれもま九経費がかかり、抗
原試験に適用できるだけで、抗体試験には適用できない
。更に、同じ文献に、診断に使用する抗体をヨード化し
て、ヒト抗一マウスー抗体がそれをもはや認識できない
ようにすることが提案されている。しかしこの方法もま
た莫大な経費を必快とし、いずれにせよ抗体の活性損失
をもたらす。

懸好性抗体を抗一ヒトーイムノグロデリン又はプロテイ
ンＡで除去するという他の提案（　ＣＬｉｎ．　Ｃｈｅ
ｍ．ｅ　３　４巻、２６１　〜２６４１Ｋ（１　９８８
年）〕もまた慣用的な測定には経費がかかり、かつまた
抗原試験にのみ好適で、抗体試験に好適ではない。

発明が解決しようとする課題 それ故、本発明は、患者血清中の鴨好性抗体の妨害作用
を除きかつ患者血清中の物質である抗原並びに抗体を妨
害さねずに定号することを可能にするという課題をベー
スとする。

課題を解決するための手段 本発明によりこの課題は、ヒト抗体の町変領域の全部又
は一部が、所望の％鴨性を有するヒト以外のモノクロナ
ール抗体の相応する部分により置換されている前紀ヒト
抗体より成るキメラモノクロナール抗体又はそのフラグ
メントを患者の血液又は血清中の物質の定童的免疫学的
測定に使用することにより解決される。

キメラ抗体として、ヒト抗体の可変領域（Ｖヨ及びＶｔ
，　）＊ヒト以外のモノクロナール抗体（例えばラット
又は有利にはマウスから）の相応する領域で置換した前
記のヒト抗体を使用すると有利である。モノクロナール
ヒト抗体を使用すると特に優れている。キメラ抗体とし
て、ｖＨ及びＶｔ，からの超可変領域を一部又は特に有
利に完全に、ヒト以外のモノクロナール抗体（例えばラ
ット及び有利にはマウス）の相応する領域で置換した抗
体〔リシエイプド（　ｒｅｓｈａρｅｄ　）抗体〕を使
用するのも優れている。従って、このような優れた抗体
はヒト抗体のＦｃ部、Ｆａｂ部の定常領域及び可変領域
の７レームヮーク領截（　ｆｒａｍｅｖｒｏｒｋ−Ｂａ
ｒｅｉｃｈ　）　ｆ含育する。１フレームワーク領域“
とは、３個の超可変領域を包囲するかもしくはそれらの
間に存在する、抗体２つの重鎖及び軽鎖のそれぞれ４個
の領域である。

このようなキメラ抗体の構成は例えばＶｅｒｈｏｅｙｅ
ｎ及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ共著、′パイオアッセイ（　
Ｂｉｏ−ａｓｓａｙ　）　”　　８巻、７４〜７８頁（
１９８８年）に記載されている。本発明でキメラ抗体又
はそのフラグメントを使用することにより、試験抗体と
異好性抗体との相互作用の危険はほとんど回避される。

本発明方法はモノクロナール抗体を使用するすべての測
定法、例えば同様に懸好性抗体又は抗−マウスー抗体に
より試験結果が誤る恐れのあるＲＩＡにも利用すること
ができる。

しかし本発明はＩＲＭＡ及び工ＥＭＡのような１サンド
ウィッチ１法に特に重要かつ好適である。

可変領域が換えられでいるキメラ抗体の製法は文献〔例
えばＢｒｉｉｇｇｅｍａｎｎ及びその他共著、（　１　
９　８　７　）　，　Ｊ．　’Ｕｘｐ．　Ｍａｄ．　１
　６　６巻、１３５１〜ｊ３６１ｇ、Ｉ，ｉｕ及びその
他共著、（１９８７）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａ
ｄ．　８ｃｉ．σ８人８４巻、３４３９〜３４４３頁、
Ｗｈｉｔｔｌｅ及びその他共著、Ｐｒｏｔｏｉｎ　Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＋　１巻（１９８７），４９９　〜
５０５Ｎ、Ｎａｔｕｒ’Ｊ　３　１　４巻（１９８５）
４５２〜４　５　４　，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　
１　３　７巻（１　９８６）１　０６＜５−１　０７４
Ｎ、（｝ｓｎｅ５４巻（１９８７）５３−４ｔｌ画、及
びＰＣ’Ｔ’８６／０　１　５　３　３′ｇｆＬびにヨ
ーロッパ公開特許第０２３９４００号明細−芹〕に記載
されており、当業者は特別な試験に必要な条件に相応し
て変史することができる。キメラ抗一Ｔ８Ｈ−抗体（　
ＭＡＫ　＜Ｔ８Ｈ＞　）の若干変更した製法は実施例に
Ｐ載する。

超可変領域だけが変換されているキメラ抗体（リシエイ
プド抗体）の製法は１ネイチャー（　Ｎａｔｕｒｅ　）
″，３２１巻（１９８（５年）、５２２〜５２５頁及び
１ネイチャー　　３３２巻（１９８８年）、３２３〜６
２７頁に記載されている。抗体のフラグメントの製法は
公知方法〔例えばＪｏｈｎｓ　ｔｏｎｅ及び’ｒｈｏｒ
ｐｅ共著、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｉｎ　Ｐｒ
ａｃｔｉｃｅ，　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ　（　１９８２年）５２〜５３負〕で行なウこと
ができる。

本発明の優れた実施形では診断のための１サンドウィッ
チ１イムノアツセイにおいて少なくとも１個のキメラモ
ノクロナール抗体又はそのフラグメントを使用する。こ
れにより両方の試験抗体の架，僑は回避される。それと
いウのもせいぜい非中メラ抗体が異好性抗体又はマウス
抗体と結合し得るだけであり、しかし架橋には両方の試
験抗体の結合が必要だからである。しかしながらたいて
いの場合、とりわけ患者血清中に渇好性抗休が比較的高
い割合で存在する場合、免疫試験においてとりわけ交叉
反応を回避するためにキメラ抗体だけを使用すると有利
である。

優れた実施形では、キメラモノクロナール抗体を使用す
る診断試譬はＥＬＩ８Ａ　（　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎ−
ｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ　）
である。

たいていの場合、罷好性抗体は七ノクロナール抗体のＦ
ｃ部分に結合するが、あらゆる可能な相互作用を回避す
るために、ヒトモノクロナール抗体の町変領域又は超町
ｆ領域が所望の特異性のモノクロナールマウス抗体の相
応する部分に置換されているキメ２一抗体を使用すると
優れている。これにより、交叉反応性を有するヒト抗−
マウスー抗体もしくは異好性抗体との相互作用は回避さ
れる。

本発明の優れた実施形では、患者血清中の甲状腺刺激ホ
ルそン（ＴＳＨ）を検出するためにｇＬＩＢＡ試験法に
よりキメラ抗−Ｔ８Ｈ一抗体又はそのフラグメントを使
用する。このために、クローン化し之抗一Ｔ８Ｈ　−　
ＭＡＫ　−　ｃＤＮＡから、レセプターとしての２つの
マウス免疫グロデリン遺伝子及びそれぞれ１個のヒトκ
−ないしｒ１遺伝子の定常碩域により軽備及び重鎖の九
めの２つの完全なキメラ遺伝子を再構成し、これらの発
現ベクター中に導入し（例１）かつ好適な宿主細胞中で
発現させた。キメラ抗体は細胞培地から公知方法により
皐離した。

それ故、本発明により、殊に１サンドウィッチ“アツセ
イ法で患者の血清又は血液中の鴨好性抗体又は抗一マウ
スー抗体が原因となる、マウスからの七ノクロナール抗
体を使用する診断用イムノアツセイの法外に高い試験結
果を回避することができる。

それ故、本発明の目的は、患者の血清又は血液中の物質
に対して作用する、第一の抗体Ｒ１が固相に結合町能で
あるか又は既に結合しておりかつ第２の抗体Ｒｓが標識
を有するこの２種の抗体Ｒｌ及びＲｓｔ−結合させ、場
合により抗体Ｒ１を固相に結合させ、形成されたＲｌ　
，物質及びＲＩＩｊ：　Ｄ成る固相結合の複合体を分離
しがつ抗体−の標識を検出することにより血清又は血液
中の物質を診断検出する方法であり、その際に少なくと
も抗体Ｒ１又はＲ１１の一方として、キメラモノクロナ
ール抗体又はそのフラグメントを使用する。

本発明の範囲において１固相に結合可能“とは抗体Ｒ１
が例えばＲ１のＦ０部分に．対して作用する固相結合の
第３抗体、又はＲ１に結合したピオチン分子と固相結合
のストレプタビジンのような付加的な成分を介して同相
に結合可能であるとも埋解すると有利である。

この際に例えば欠のような試験法の別法がある： ａ）抗原に対するキメラヒト抗体のＰＣ部分を結合する
、ヒト抗体のＦ０フラグメントに対する固相結合の抗体
の使用及び同様に抗原に対する、例えばベルオキシダー
ゼ標識した第２抗体を介して複合体の標＃ＩＩ： ｂ）固相結合のストンプタビジン、ピオチン化した、抗
原に対するキメ２抗体並びに同様に抗原に対して作用す
る標識第２抗体の使用：Ｃ）マウス抗体のＦＣ　ｒ部分
に対する固相結合の抗体、それと結合ｏＴ能な、抗原に
対して作用するマウス抗体及び抗原に対して作用する標
識キメラ抗体の使用； （１）同相結合のストレプタビジン、ビオチン化した、
抗原に対して作用するマウス抗体及び同様に抗原に対し
て作用する標識キメラ抗体の使用； ｅ）抗原に対して作用する、固相結合のキメラ抗体及び
同様に抗原に対して作用する標識マウス抗体の使用：又
は ｆ）抗原に対して作用する同相結合のマウス抗体及び同
様に抗原に対して作用する標識キメラ抗体の使用。

本発明方法において抗体の標識は放射性標識でも、また
他の標識法、例えば酵素標識でもよい。本発明で酵素標
識を使用すると優れており、これは酵素により惹起され
た呈色反応を介して検出する。

標識は間接的にその都度の抗体に結合しているピオチン
を介して及びストレプタビジンと結合した標識、例えば
ベルオキシダー＋Ｐ′ｔ−介して行なうこともできる。

固相としては、例えば反応容器の壁が該当する。

前記のすべての別法に抗体全体を使用する代りに該抗体
の一定のフラグメントだけを使用ｆることもできること
は明らかでありかつそれは本発明の実施形である。

本発明方法の優れた実施形ではキメラモノクロナール抗
体２ｆｌｔ使用する。これにより、とりわけ鴨好性抗体
が高濃度で存在する場合に試験結果の正確さが更に高ま
る。

キメラモノクロナール抗体を使用する本発明方法は、抗
体と検出すべき物質とからのサンドイツチの形成をベー
スとするものではない例えばＲＩＡのよクな診断試験に
も適用することができる。それというのもこのような試
験でも異好性抗体の存在による試験結果の誤差が懸念さ
れるからである。しかし特に“サンドイツチ”イムノア
ツセイにとって重要である。

モノクロナール抗体の製造は既に記載した公知方法によ
り実権することができる。

本発明により、患者の血清又は血液中の昂好性抗体又は
抗−マウスー抗体が惹き起こす診断試験の妨害を簡単に
かつ有効に回避することができる。技術水準で提案され
たような、モノクロナール抗体が取得された種の非％髄
的非イムンＩｇＧの添加の必要性もしくは異好性抗体又
は抗−マウスー抗体の経費のかかる沈ｌ＃は本発明によ
り回避され、明らかに高まった試験結果の精度が達成さ
れる。

実施例 次に本発明を添付図面につき実施例により詳説する。

例　　１ Ｔ８Ｈに対する中メラ抗体の製造（キメラモノクロナー
ル抗体、キメ２抗−Ｔ８Ｈ　−　ＭＡＪＣ　）ａ）ベク
ターｐ１　１　１　９６（第５図）の構成抗イデイオタ
イプＭＡＫ　Ａ　２　０　４　４　Ｃ　Ｆ．　８ａｂ−
１１ｔｚｋｙ及びその他共著、ＥｕＢｏ　Ｊ．．　４巻
、３４５一ぜ■−クレノウフラグメントをフイリングし
（　ａｕｆｆｕｌｌｅｎ　）　、Ｎｏｔ　（リンカー（
　５’　（｝ＣＧＧＣ’ＣＧＣ３′）を挿入し、かつ末
端が同様にフイリングされかつＮｏｔ　ｌ　’）ンカー
が挿入されているＤｒａ　ｌ／　Ｐｖｕ　１１切断ｐＵ
Ｃ　１　８　Ｃ　Ｙａｎｉａｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎｔ　Ｃ
ｏＧ．　Ｖｉｅｉｒａ及びＧ．　Ｍｅｓｓｉｎｇ共著、
Ｇｅｎｅ　３　３巻、１０３〜１１９頁（１９８５年）
〕中でクローン化したＣ　Ｔ．　ＭａｎｉａｔｉＬ　Ｌ
　Ｆ．　Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．　８ａｍｂｒｏｏｋ共
著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（　１　９　８　２　）
　ｅ　Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　’Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　］。

第５図はベクターｐ１　１　１　９６の図であり、前記
のようにｐＵＣベクター（：　Ｃ．　Ｙａｎｉｓｃｈ−
Ｐｅｒｒａｎ及びその他共著、Ｇｅｎｅ＋　３　３巻、
１０３　〜１１９画（１９８５年）　ｓ　ｐＵ０　１　
８のヌクレオチド位６３０〜２６７５）’ｔ−ベースと
して構成した。

Ｎｏｔｌフラグメント（＝コ）は機能的に転位された、
マウスのＫ遺伝子のＶ領域を有する。突然変毘（ヌクレ
オチド位６もしくは３１２）により、■領域の初めにｇ
ｃｏＲＶ及びＪ領域の終りにＸｈｏ　ｌ切断部位が導入
された。

ｂ）ベクターｐ１　１　１　９７（第６図）の構成抗イ
テイオタイプＭＡＫ　Ａ　２　０　４　４　ＣＰ．　８
ａｂ−１１ｔｚｋｙ及びその他共著、ＥＭＢＯ　Ｊ．　
４巻、３４５〜３５０！（１　９８５年）〕のｒ１遺伝
子からの１ｋｂのＥｃｏ　ＲＩ　／　｝ｆｉｎｄ　ＩＩ
１７　２グメント金末端でフイリングし、Ｎｏｔｌリン
カーを挿入しかつＤｒａ　Ｉ　／　Ｐｖｕ　Ｈ切斬され
かつ同様に処理したベクターｐＵＣ　１８　Ｃ　Ｙａｎ
ｉｇｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，　Ｃｍ　Ｇ．Ｖｉｅｉｒａ及
び（｝．　Ｍｅｓｓｉｎｇ共著、Ｇｅｎｅ．　３　３巻
、１０３〜１１９貞（１９８５年）〕中にクローン化し
た。

第６図はベクターｐ１１１９７の図であり、このベクタ
ーは前記のようにｐＵＣベクター（Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ
−Ｐｅｒｒｏｎ及びその他共著、Ｇｏｎｅ　ｔ　３　３
巻、１０３〜１１９頁（ｊ９８５年）　ｓ　ｐ（ＪＣ１
８のヌクレオチド位６３０〜２６７５）ｔ−ベースとし
て構成した。Ｎｏｔｌフ２グメント（＝コ）は機能的に
転位したマウスのｒ１遺伝子のＶＤ，Ｔ領域を有する。

Ｃ）オリ？ヌクレオチド方向付け突然変異第１図のＤＮ
Ａ配列中に１位にオリ♂ヌクレオチド■を用いてＦｉＣ
ＯＲＶ切断位を及び３２５位（オリがヌクレオチド…）
にＸｈｏ　■切断部位を挿入した。オリデヌクレオチド
Ｉのヌクレオチド１〜９は第１図には含まれていない抗
一’Ｉ’８Ｈ−　ＭＡＫのκ鎖のリーダーペプチド領域
と相同性である。＠１図は》仏Ｋの成熟κ鎖を示丁。第
２図のＤＮＡ配列中の７位（オリ♂ヌクレオチドＭ）に
Ｐｖｕ　Ｈ切断位を及び６４４位（オリ♂ヌクレオチド
■）にＰｓｔｌ切断位を挿入した。ｐ１　１１　９６中
のＭＡＫ　Ａ　２　０　４　４　Ｃ　Ｆ．　８ａｂｌｉ
ｔｚｋｙ及びその他共著、２ＭＢＯＪ．，　４巻、３４
５〜３５０頁（　１　９８５年）〕のＸ遺伝子のＶＪ領
域の配列において１位（オリイヌクレオチドＶ）にＩｅ
ｃｏＲＶ切断位を及び３１０位（オリ？ヌクレオチド■
）にＸｈｏ　［切断位を挿入した（第５図）。

すべての突然変異は１イヤツプド・ジエプレツクス１法
（　ｇａｐｐｅｄ−１ｕｐｌｅｘ−Ｍｅｔｈｏｄ　）　
（Ｉｎｏｕｙｅ及びその他共著、８ｙｎｔｈ．　Ａｐｐ
ｌ．　ＤＮＡ　ＲＮＡ．　１８１〜２０６頁（１９８７
年）、編集者８．Ａ．穐胃，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ　）によりプ２ス建ドＤＮＡから出発して実施した
。

使ったオリイヌクレオチド Ｉ　：　５’　ＡＣＣＡＡＣＧＧ’Ｉ’ＧＡＴＡ’ｒＣ
Ｇ’ｒＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧｔ’Ｉ：　５’　ＧＧＣＡ
ＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＣ｝Ｇ３’１ｉ
　：　５’Ａ’ｒＧＡＧＣＡＧＣ”ｒＧＣＡＡＧＡＧＴ
ＣＡＧＧＡＣ３’■：　５’　Ｇ’ｒＣＡＣＣＧ’Ｉ’
Ｃ’ｒＣ’ｒＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧ３’Ｖ　：　５
’　ＧＡ’ｒＡ’ｌ’ＣＧＴＧＣＴＡＡＣＴＣＡＧＴＣ
ＴＣ！ＣＡ６’ＶＩ　：　５’　ＧＯ’Ｉ’ＧＯＴＧＧ
ＧＡＣＣ！ＡＡＧＣ’Ｉ’ＣＧＡＧＣ’Ｉ’（｝　５’
ｄ）ベクターｐ１０１９５（第７図）の構成ｇｃｏ　Ｐ
ＬＩ及びＢａｍ　ＩＩで切断したプラスぱドｐ８Ｖ　２
ｎｅｏ　（　Ｒ．　Ｃ．　Ｍｕｌｌｉｇａｎ，　Ｐｅ　
Ｂａｒｇ共著、Ｆｒｅｅ．　Ｍａｔ．　Ａｃａｄ．　８
ｃｉ．　Ｖ８Ａｌ　７　８巻、２０７２〜２０７６１［
（１９８１年）〕中に、ＭＡＫＡ２０４４０Ｋ遺伝子の
エンハンサー領域（　Ｎａｔｕｒｅ，　３　０　７巻、
８０〜８２頁（１９８４年）〕を含有する２　ｋｂのｆ
ｃｃｏＲＩ　／　Ａｓｐ　７　０　０一フラグメント（
　ｈａｐ　７　０　０はリンカーによりＢａｎ　Ｈｌに
転移）をクローン化した。生成プ２スミドのＢＩＩＬｍ
Ｈ！切断位中に末端のプイリング後、ヒ｝Ｋ遺伝子の定
常領域を含有するｐｃ　１（　Ｈ，　Ｇ．　Ｋｌｏｂｅ
ｃｋ及びその他共著、Ｎｕｃｌ．　ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
ｓ　１　２巻、６９９５〜７ＱＱ６１１ｔＣ１９Ｂ４年
）〕からの２．８　ｋｂのＴＬｃｏ　ＲＩフラグメント
（同様にフィリング）ｔ−クローン化した。生成プラス
（｝”のマウスＫエンハンサーの上にのったＸｂａ　Ｉ
切断位をリンカー挿入によりＮｏｔｌ切断位に転移した
。

第７図はベクターｐ１０１９５ｔ−示し、前記のように
該ベクターはｐ８Ｖ　２　ｎｅｏ　Ｃ　Ｒ．Ｃ．　Ｍｕ
ｌｌ１ｇａｎ及びｐ．　Ｂｅｒｇ共著、Ｐｒｏｃ．　Ｎ
ａｔ＊　Ａｃａｄ．　８ｃｉ．Ｕ８Ａ，　７　８巻、２
０７２〜２０７６両（１９８１年）〕ヲペースとして構
成した。そのＨｃｏ　Ｒｌ切断位及びＢａｍＩＩ切断位
の間にマウスのκエンハンサーを含有するＤＮＡフラグ
メント（　＝＝）並びにヒトＫ遺伝子の定常領域を含有
するＤＮＡフラグメント（ニコ）ｔ−クローン化した。

これはＢａｎ　ＨＩ切断位の欠失をもたらした。

ｅ）ベクターｐ１　１　２０１　（第８図）の構成ｇｃ
ｏ　ＲＩ及びＢａｎ　ＨＥで切断したプラスミドｐ８Ｖ
　２ｇｐｔ　（　Ｒ．Ｃ．　Ｍｕｌｌｉｇａｎ．　Ｐ．
　Ｂｅｒｇ，　Ｐｒｏｃ．Ｈａｔ，　Ａｃａｄ．　８ｃ
ｉ．　Ｕ８Ａｅ　　７　８巻、２０７２〜２０７６頁（
ｊ９８１乍）〕中に、ヒトｒ１遺他共著、Ｃｅｌｌ．　
２　９巻、６７１〜６７９頁（１９８２年）〕會クロー
ン化し九。（このもともとのＨｉｎｄ　ｒ１フラグメン
トｆ　Ｈｉｎｃｌ　Ｉ末端のフィリング及びｐ［Ｔｃ　
１　９　（　Ｃ．　Ｙａｎｉａｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ及び
その他共著、Ｇｅｎ６．３巻、１０３〜１ｆ９頁（１９
８５年）〕の同様にフィリングしたＡｓｐ　７　１　８
切断位に中間クローン化することによりｇｃｏ　ＲＩ　
−Ｂａｍ　ＩＩ−フラグメントに転移させた。）生成プ
ラスミドのＢｃｏ　ＲＩ切断位中に同一方向で、ＭＡＫ
　Ａ　２　０　４　４　（　Ｆ．　８ａｂｌｉｔｚｋｙ
及びソノ他共著、！ｌｅＭＢｏ　Ｊ．，　４巻、３４５
　〜３５０！［（１９８５年）］のｒ１遺伝子のエンハ
ンサー領域（Ｃｅｌｌ．４巻、８８５一８９７頁（１９
８５年）〕を含有する１．６ｋｂのＨｉｎｄ　ｍ　−　
Ｅｃｏ　Ｒｌ−フラグメントを挿入した。その際に、Ｈ
ｉｎｄ　Ｉｌｌ切断位はアダプター（　５’　ＡＧＣＴ
ＧＣＧＧＣＣＧＣ３’ｆ　ハ｛デリツド形成した５’　
ＡＡＴＴＧＣＧＧＧＣＣＧＣ３’　）にょりＮｏｔ｝切
断位に転移しかつまたｇｃｏ　ＲＩ切断位に適合し念。

第８図はベクターｐ１　１　２０ｊを示し、該ぺｙｐ−
は前記のようにｐ３ｖ　２　ｇｐｔ　（　Ｒ．Ｃ．　Ｍ
ｕｌｌ−ｉ　ｇａｎ及びＰ．　Ｂｅｒｇ共著、Ｐｒｏｃ
．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　７　８
巻、２０７２　〜２０７６１９８１年）〕ヲベースとし
て構成した。そのｇｃｏ　ＲＩ−及びＢａｍ　Ｈｌ一切
断位の間に、マウスのイムノグロデリン重鎖のエンハ／
サーを含有するＤＮＡフラグメント（ニコ）ヲかつヒト
ｒ１遺伝子の定常領域を含有するＤＮＡフラグメント（
二口）をクローン化した。

ｐｓＶ　２　ｇｐｔからのＥｃｏ　ＲＩ切断位はＮｏｔ
ｌ切断位に転移した。

ｆ）キメラ抗体の軽鎖用発現グラスξドの構成第１図に
よるＤＮＡ　ｔ−突然変異により導入した切断位でＥｃ
ｏ　ＲＶ及びＸｈｏ　ｌで制限した。Ｖ領域に相応する
３　２　３　ｂｐフラグメントを、同様にＥｃｏ　ＲＶ
及びＸｈｏ　ｌで制限したベクターｐ１１１９６中にク
ローン化した。生成ベクターｐ１　１　２２３をＮｏｔ
ｌで制限し、イムノグロデリン部分に相当するＬ８ｋｂ
のフラグメントを単雛しかつＮＯｔｌで制限したベクタ
ーｐ　１０１９５中にクローン化した（第９図）。生成
し九ベクター１）　１　１　２　２　５　（　Ｄ８Ｍ　
５　０　９　４　）　ｔ　ＣｓＣＬ　’ａ度勾配遠心法
［　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ及びその他共著、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８２／ｉＦ−）、Ｃｏｌｄ　８
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　］
によジ精製した。

ｇ）　　’Ｐメラ抗体の重鎖用の発現プラスミドの構成 第２図のｄＯＮｋ　ｔ−突然変異により導入した切断位
でＰｖｕ　ｌ［及びＰａｔｉで制限した。内部Ｐｓｔ■
切断位の結果、Ｖ領域に相当する２３１ｂｐ及び１０３
ｂｐの２つのフラグメントが生成する。両方のフラグメ
ントを元の方向において、同様にＰｖｕ　ｌ及びＰａｔ
ｌで制限したベクターｐ１１１９７中にクローン化した
。生成ベクターｐ１１２２１ｔ−Ｎｏｔｌで制限した。

イムノグロデリン部分に相当する１　ｋｂのＮｏｔｌフ
ラグメント全ベクターｐ１　１　２０１のＮｏｔｌ切断
位中にクローン化した（第１０図）。生成ベクターｐ　
１　１　２　２　４　（　ＤＡＭ　５　０　９　３　）
をＣｓＣｔ密度勾配慮心法により精製したＣ　Ｔ．　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ及びその他共著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　−　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ　（　１　９　８　２年）、Ｃｏｌｄ　８ｐｒｉ
ｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　］。

ｈ）＠乳動物細胞を発現プラスミドによりト２ンスフエ
クション ベクターｐ１　１　２２４（Ｄ８Ｍ５０９５）並びにベ
クターｐ１　１　２２５（ＤＳＭ５０９４）そそれらの
唯一のＰ’ｖｕ　Ｉ切断位（細菌ａｍｐ　遺伝子中）で
線状化した。ｓｐ　２／Ｏ　　Ａｇ　１　４細胞（ＡＴ
ｃｃＣＲＬ　１５　８　１　）　ｋ　ＲＰＭＩ培地（　
Ｇ．Ｅ．　Ｍｏｏｒｓ．　Ｒ．Ｅ．　Ｇｅｒｎｅｒ及び
Ｈ．Ａ．　Ｆｒａｎｋｌｉｎ共著、Ｃｕｌｔｕｒｅｏｆ
　Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｇ．
　Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．＊　１９９巻、５１９〜５２６頁（
１９６７年）〕上で発育させた。この培地は牛胎児血清
１０幅、グルタミン２０ミリモル／ｔ，ビルげン＃Ｎａ
１ミリモル／ｔ１　８−アデグアニン２０μ９／ｔ及び
アミノ酸（　ＭＥＭアミノ酸、組成についてはＲ．Ｇ．
　Ｈａｍ著、２ｘｐ．　Ｃｅｌｌ．　Ｒｅｓ．．　２　
９巻、５１５〜５２６頁（１９６３年）＃照〕を付加し
た。

指数的に増噛する細胞（約５　Ｘ　１　０５個／１）を
Ｉ　Ｘ　Ｈ８ＢＳ緩衝液（　Ｇ．　Ｃｈｕ及びその他共
著、Ｈｕｃｌ＊　Ａｃｉｄｓ　ＲｅｓＢ　１５巻、１３
１１〜１３２６頁（１９８７年）〕中に再懸濁して全量
１．２５×１０６個／１にした。線状化し九ベクターｐ
１　１　２　２　４　（　ＤＡＭ　５　０　９　３　）
及びｐ１　１　２２５（　Ｄ８Ｍ　５　０　９　４　）
　ｔ−それぞれ１２．５μｇ／＠ｔの濃度で添加した。

細胞及びＤＮＡを１０分閣０℃で予め恒温保持し、引続
いてアリコート８００ａｔを１回の電気パルス２３　Ｑ
　Ｖ　（　Ｂｉｏ　ＲａｄＧｏｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　）
に暴し、その後で更に０℃で１０分間恒温保持した。そ
の後、ＲＰＭＩ　（前記のもの、但し８−アデグアニン
を含まない）中の細胞金クローン化板上に塗布した。

トランスフエクションして２４時間後かラＧ４　１　８
　（　Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ　Ｇｉｂｃｏ，　Ｉ　Ｗ　／
　ｎｌ　）又は０４１８と付加的にミゴフェノール酸（
３段階で２５０ｎｇ／１１７から５０ＯｎＩＩ／ｄを介
して２μｓ／１に上昇させる）ＶＣよって選択した。両
方の選択庫埋により、ベクターｐ　１　１　２　２　４
　（　ＤＡＭ５０９３）並びにベクターｐ　１　ｊ　２
　２　５　（　Ｄ８Ｍ５０９４）を含有しかつ活性なキ
メラ抗−’Ｉ’８Ｈ−　ＭＡＫ　（　ＢＣＡＣＣ　８　
８　０　９　１　４　０　５　）　ｔ−発現するクロー
ンが得られた。キメラ抗一Ｔ８Ｈ　−　ＭＡＫ　ｆ）κ
鎖及びｒ鎚のアばノ酸一及びＤＮＡ配列は第３図及び第
４図に図示されている。

キメラ抗一’Ｘ’８Ｈ−　ＭＡＫ　１ｆｔｇＥ産するこ
のハイデＩＩ　｝’−マｌａＤ系ｔｌｒｒｃＡｃｃ　８
　８　０　９　１　４　０　３テ寄托し九（機関：　ｆ
ｃｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ！
ｌｌｉｍｌＣｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，　Ｐｏｒｔｏｎ
　Ｄｏｗｎ，英（至））ｏ同様にして次のキメラＭＡＫ
１ｆｔ製造することができる。

ＥＣＡＣＣ　８４１２２００６　　　卵胞＠微ホルモン
（ＩＰ８Ｈ）に対してｇｃＡｃｃ　８４１２２００１　
　　Ｉｔ体形成ホルモン（ＬＨ）に対してＥＣＡＣＣ　
８５１２１７０１　　　　テストステロンに対して例　
　２ 二重ＭＡＫサンドウィッチ試験におけるキメラ抗−　Ｔ
８Ｈ　−　ＭＡＫの作用性の検出ａ）抗−Ｔ８Ｈ　−　
ＭｋＫ 抗一’Ｉ’８Ｉ｛　−　ＭＡＷとしては、そのκ鎖及び
ｒ鎖のアミノ酸配列が第１図及び第２図に図示されてい
るＭＡＫ１ｋ使用した。

ｂ）抗一ＴＢＨ　−　ＭＡＫ　（第１因及び第２図）に
相補性の’１’８Ｈ結合マウス抗体のべルオキシダーぜ
接合体の製造 モノククナール抗−Ｔ８Ｈ−抗体（　ｗｃ＊ｃｃ　８７
１２２２０２　）のＺｇＧフラクションを腹水から硫酸
アンそエウム沈＠反びｆ）ｉｅＡＩＢイオン交換体によ
るクａマトグラフイ（　Ａ．　Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ及び
Ｒ．　Ｔｈｏｒｐｅ共著、Ｚｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　ｉｍ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，　４　４　〜４５［（
１９８２年）　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　８ｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ〕により精製した。ＩｇＧ２００ａｐからＦａｂフ
ラグメ７　｝　９　０　１１９　ｆ：Ｊｏｈｎｇｔｏｎ
及びＴｈｏｒｐｅによる方法（前記文献５２〜５３頁）
で製造した。Ｆａｂフラグメント５０１＋９ｔｓ−アセ
チルーチオー無水コハク酸と反応させかつ西ドイツ国特
許゛公開第３８２５７３５号明細書、例８．２の方法に
より、前重合したマレインイミドーヘキサノイルーベル
オキシダーぜ５０智と結合させた。

ＡＣＡ　２　２−クロマトグラフイにより分子量２〜３
００００００の接合体プールが得られた。収ｔ：１３５
０００のベルオキシダーぜ（　ＰＯＤ　）活性を有する
蛋白質３１■。

Ｃ）作用試験の実施 １．抗一’ｒ８Ｈ　−　ＭＡＫによる参考２ＬＩ８Ａ　
（　ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ
ｅｎｔ　ａｓｓａｙ　）工ａ１： ミクロ滴定板の凹部をポリクロナール羊（抗一マウスＦ
ａｒ　）　Ｉｇｏ　（免疫吸収させた）５μ９／ｍｔ−
用いて自発吸着によＯ塗布し（２５℃、２時間）、かつ
ＨＩｌｅＰｆｆｌ８緩衝液１５０ミリモル／ＮａＣｔ１
　５　０ミリモル（ｐＨ７　’）中の１４−クロテイｙ
　（　Ｃｒｏｔａｉｎ　）　Ｃ　ｔ−後負荷して（２５
℃で３０分間）残りの吸着位を飽和した。

工程２： 空にした凹部中に、ＲＰＭＩ　ｍ胞培地中に溶解し７’
ｔ　ＩｇＣｋ　５　０ｄｌ　ＮＦ）濃ａｆ）Ｋ　−　’
ｒ８｝Ｉ　−　ＭＡＫ　（　例２ａ）各０．２１１４　
！　２ペット添加し、かつ室温で６０分間恒温保持した
。対照のためにＭＡＫ　−ＩｇＧｔ含まない緩衝液を使
用した。

工程３： 緩衝液Ａで３回洗浄した後で、それぞれ４０８２００μ
ｔと一緒にピペット添加し、かつ室温で６０分間恒温保
持した。

Ｔ８Ｈ標準溶液は牛血清を’Ｉ’８Ｈ溶液で増蓄するこ
とにより製造した。様々に増加させた標憩溶液の’ｒ８
Ｈ濃度は市販の’ｒ８Ｈ試験（　ｆｅｎｚｙｍｕｎ−Ｔ
ｅａ　？Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｇ
Ｉ！Ｉｂ　Ｈ社、注文番号７３６０８２）で測定する仁
とにより関係づけた。

工程４： 緩衝液Ａで２回洗浄した後で、それぞれの凹部中にＰＯ
Ｄ＠性１００ｍσ／Ｖを有する酵素接合体溶液０．２１
１１ｔ−装入し友（ｂ）からの接合体ａ縮物を緩衝液Ｃ
中で稀釈）。接合体を室温で６０分間恒温保持した。

工程５： 緩衝液Ｃで３回洗浄後、それぞれの凹部をＡＲＴ一基質
（　２　．　２’−アジノージー［３−エチルベンゾチ
アゾリンースルホネー｝　］　ＡＢ’ｒ８■１．９ミリ
モル／ｔ，　　リン酸塩−クエン酸一緩衝液（ｐＨ４．
４）１００ミリモル／１，過硼酸ナトリウム３．２ミリ
モル／ｔ）０．２１！Ｊで充填し、かつ室温で６０分間
恒温保持し九。

凹部中の生成着色溶液の吸光度ヲ冫クロ滴定板に好適な
光度計で４　０　５　ｎｍで測定した。

緩衝液Ａ： リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．９　　　　１＜Ｓｆリモ
ル／ｔ牛血清アルデミン　　　　　　　　０．２４Ｎａ
Ｃｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
１５モル／ｔ牛Ｉ　ｇＧ　　　　　　　　　　　　Ｏ　
．１惨緩衝液Ｂ： 羊ｒｇ（｝　０．１　４　ｆｃ添加し念緩衝液Ａ緩衝液
Ｃ： リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．９　　　３２ミリモル／
ｔ牛血清アルデミン　　　　　　　０．２４Ｎａ（，ｔ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ．１５
モル／ｔデキストラン’ｒ　５００　　　　　　　　２
係フェノール　　　　　　　　　　　０．０１係（ｌ＃
度は試験における最終濃度である）２．キメラ抗−Ｔ８
Ｈ　−　ＭＡＫ　（例１）にょるＥｔ，Ｉ８Ａ試，験 キメラＭＡＫによる試＠は作用試験の実残ｃ）の参考試
験１の工程と全く同様に冥捲した。但し久の点ｔ−変更
した： 工程１において、ポリクロ九ル羊（抗ヒトーＦｃ，　）
　−　ＩｇＧ　（免疫吸収させた）ｔ−塗布した。

工程２ではキメラ抗Ｔ８Ｈ　−　ＭＡＸ　５　Ｑ　ｒ３
１ｙ　ａｓ　ｔ−含有する細胞培養上溌みの稀釈液をピ
ペット添加した。キメラ抗−Ｔ８Ｈ　−　ＭＡＫの濃度
はヒトー’ｃｒ一特１性ミクロ滴定ＢＴ，１８ｋにより
測定した。

第１１図は抗−Ｔ８Ｈ　−　ＭＡＫ　ｆ用いた試験であ
る例２ｃ）１の標準曲線（曲線■）及びキメラ抗−ＴＳ
Ｈ　−　ＭＡＫを用いた試験である例２ｃ）２の傾準曲
線（曲線■）１ｋ比較して示す図である。

検量曲線は倶差限界範囲内で同等である。それ故、キメ
ラＭＡＫ中のＴＳＨ結合部位は不変でありかつ中メラＭ
ｋＫはＦ。γ部分においてヒトＩｇＧと同様に挙動する
。

対照としては例２ｃ）２による試験で例２　ｃ）１によ
り羊（抗マウスＦｃｒ　）　ＩｇＧ　塗布したミクロ滴
定板を使用した。予想通り、標準試料に関して空値とは
鴇なる吸光度は得られなかった。

表１に６人の患者の血清の測定値を掲載し友（ＰＳ７１
　．ＰＳ９２，Ｐ８９９）。測定値から、マウス一二重
一ＭＡＫ一免疫試験において高い偽値が得られることが
知られる。対照として、阻害因子を含まないＴｓａ＜０
．５μＵ／１１１１７の正常なヒト血清の試料ｐｓ１０
７ｔ−試験し念。

両方の試験系で得られる血清試料の吸光度をそれぞれの
標燻曲線を用いてＴ８Ｈμσ／試料ｄに換算した。

キメラ抗−ＴＳＨ　−　ＭＡＫを用いる試験系において
阻害因子を含有するヒト血清で規定量のＴＳＨが正しく
測定されること金検査するためにそれぞれの血清にＴ８
Ｈ　２　０μσ／１を加え、同様に測定した。

表　　１ 抗−Ｔ８Ｈ　−　ＭＡＫ及びキメラ抗−Ｔ８Ｈ　−　Ｍ
ＡＫを用いた作用試験の結果 ｔ　羊（抗マウスＦｃｒ）塗布による試験系２．羊（抗
ヒ｝　Ｆｃｒ）塗布による試験系患者血清中に含まれて
いる’Ｉ’８Ｈ　Ｏ濃度はＩｉ：ｎｚｙ−ｍｕｎ　’Ｉ
’８Ｈ試験パッケージ（　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍＧｍｂ　Ｈ社、注文番号７３６０８２）で
測定した。

この試験は抗−マウスーＩｇＧ阻害因子によって妨害さ
れない。それというのもマウスがらの抗−　Ｔ８Ｈ一抗
体のＦａｂフラグメントとベルオキシダーゼとからの接
合体の代りに、羊からのポリクロナール抗−Ｔ８Ｈ一抗
体からのへ．フラグメントとベルオキシダーぜとからの
接合体が含まれているからである。

実側値：Ｐ８７１（０．５２μ［７／Ｉｔｊ）、Ｐ８９
　２　（　２．２μＵ／ａｇ）、Ｐ８９９（０．９μＵ
／ＩＩＪ） 前記の表の数値から、例２Ｃ）１による試験系では阻害
因子を含有する患者血清中に著しく高い見掛け上のＴ８
Ｈ含量の偽値が認められる。

キメラ抗−Ｔ８Ｈ　−　ＭＡＫを使い、その他は全く同
じ試験系（例２　ｃ）　２　）ではこの妨害は児全に除
去される。真に高い’Ｉ’８Ｈ含量は誤差限界範囲で正
しく認められる。

【図面の簡単な説明】

第１図は’Ｔ！８ＨＫ対するモノクロナール抗体のκ鎖
のＤＮＡ一及びアミノ酸配列を示す図、ｔＪＩＪ２図Ｆ
ｉ’ｒ８Ｈに対するモノクロナール抗体のｒ鎖のＤＮＡ
一及びアミノ酸配列を示す図、第３図はＴ８Ｈ　Ｋ　対
Ｔるキメラモノクロナール抗体のκ鎖のＤＮＡ一及びア
ミノ酸配列を示す図、第４図は’Ｉ’８Ｈに対するキメ
ラモノクロナール抗体のｒ　６８ｏＤＮＡ一及びアミノ
酸配列を示す図、第５図はベクターｐ１　１　１　９６
の図、第６図はベクターｐ１　１　１　９７の図、第７
図はベクターｐ　１０１９５の図、第８図はベクターｐ
１　１　２０１の図、第９図はκ領構成のクローン化工
程のｇ！！を示す図、第１０図はｒ鎖構成のクローン化
工楊の概曽を示す図、第１１図は抗−Ｔ８Ｈ−モノクロ
ナール抗体の標準曲線■及びキメラ抗一Ｔ８Ｈ−モノク
ロナール抗体の標準曲線■を比較して示す因である。 ＦＩＧ．１ ＦＩＧ．２ （１冫 ＶａｌＴｙｒ？ｈｒ工１＊ＰｒｏＰｒｏＰｒｏＬｙｓＧ
ｌＦＩ０．３ ＶａＬＴｈｒＨＬｔｓＧＬｎＧＬｙＬａｕ；＠ｒｓ＠ｒ
ＰｒＯＶａよＴＴ１ｒＬＹ＃５＠ｒＦｎｔＡｊｌｌ’Ｌ
Ａｒ９ＧｉｙＧＡｕＬ７＃ｊＧｎＯＦＩＧ，２ ＦＩＧ．４ ＦＩＧ．４ ＦＩＧ．６ ＦＩＧ，５ （ＴＡＴＭＣＡ（ＧＡＴＴＧＡＧＴ（ＡＧＡＧＧＴ（Ｃ
（ＴＧＧＴＴ（ひ〔〔Ｔ〔 ＦｊＧ，７ ＦｊＧ，８ ＦＩＧ．１０ −Ｊコ］田１０１．− ＦＩＧ．９ 一一皿！エロユ一一 ＦＩＧ　．　１１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、患者の血清又は血液中の物質に対して作用する、第
   一の抗体Ｒ＿１が固相に結合可能であるか又は既に結合
   しておりかつ第２の抗体Ｒ＿２が標識を有するこの２種
   の抗体Ｒ＿１及びＲ＿２を結合させ、場合により抗体Ｒ
   ＿１を固相に結合させ、形成されたＲ＿１、物質及びＲ
   ＿２より成る固相結合の複合体を分離しかつ抗体Ｒ＿２
   の標識を検出することにより血清又は血液中の物質を診
   断検出する方法において、少なくとも抗体Ｒ＿１又はＲ
   ＿２の一方として、可変領域の全部又は一部が、所望の
   特異性を有するヒト以外のモノクロナール抗体の相応す
   る部分により置換されているヒト抗体より成るキメラモ
   ノクロナール抗体又はそのフラグメントを使用すること
   を特徴とする、血清又は血液中の物質を診断検出する方
   法。