DE69504959T2

DE69504959T2 - Humanisierte monoklonale antikörper gegen humanes interleukin - 4

Info

Publication number: DE69504959T2
Application number: DE69504959T
Authority: DE
Inventors: Barbara Berkeley Heights Nj 07922 Dalie; Kenneth Cranford Nj 07016 Miller; Nicholas Millington Nj 07946 Murgolo; Stephen Madison Nj 07940 Tindall
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1994-03-10
Filing date: 1995-03-08
Publication date: 1999-02-18
Anticipated expiration: 2015-03-09
Also published as: ATE171473T1; DE69504959D1; WO1995024481A3; CA2185112C; EP0749481B1; JPH09510095A; ES2121358T3; US5597710A; WO1995024481A2; EP0749481A1; DK0749481T3; AU1971295A; CA2185112A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Polypeptide, die variable Bereiche eines humanisierten monoklonalen Antikörpers umfassen, der spezifisch an Human-IL-4 bindet, auf monoklonale Antikörper und Bindungsfragmente, die die Polypeptide umfassen, und auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Polypeptide, Antikörper und Bindungsfragmente umfassen. Die Erfindung bezieht sich auch auf Nucleinsäuren und rekombinante Vektoren, die die obigen codieren, und auf Verfahren zur Herstellung der Polypeptide und Antikörper.

Hintergrund der Erfindung

Human-Interleukin-4 (IL-4) ist ein in hohem Maße pleiotropes Lymphokin, das viele verschiedene Komponenten des Immunsystems beeinflußt. Es hat T-Zellen-Wachstumsfaktor-(TCGF)-Aktivität und B-Zellen-Wachstumsfaktor-Aktivität. Es vermag die TCGF- Aktivität von Interleukin-2 (IL-2) und die koloniebildende Aktivität von Granulocyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) zu potenzieren. Es induziert außerdem (a) die bevorzugte Erzeugung von IgG&sub1; und IgE, (b) den Niederaffinitätsrezeptor für IgE (CD23) und (c) die Expression von Human- Leukocyten-Klasse-II-DR-Antigenen.
Diese Aktivitäten legen mehrere mögliche therapeutische Verwendungen für IL-4 nahe, z. B. als Antitumormittel [Tepper et al., Cell 57 : 503 (1989)], Potenzierungsmittel für die IL-2- Antikrebstherapie, Potenzierungsmittel für die GM-CSFstimulierte Knochenmarksregeneration oder als Mittel zur Behandlung des Bare-Lymphocyte-Syndroms [Touraine, Lancet, S. 319-321 (7. Februar 1981); Touraine et al., Human Immunology 2: 147 (1981); und Sullivan et al., J. Clin. Invest. 76: 75 (1985)]. IL-4 und IL-4-Agonisten sind also potentiell nützliche therapeutische Mittel.
Andererseits kann die IgE- und CD23-induzierende Wirkung von IL-4 wichtige nachteilige Konsequenzen für Personen haben, die unter allergischen Krankheiten leiden. Die Verfügbarkeit von IL-4-Antagonisten könnte eine Alternative für die Verwendung von Glucocorticoid-Steroiden ergeben, die viele schädliche Nebenwirkungen haben, insbesondere bei längerer Verwendung.
Monoklonale Antikörper, die spezifisch für das Blockieren der biologischen Aktivität von Human-IL-4 sind, sind ein Mittel zum Aufbau von Agonisten oder Antagonisten durch Erzeugung anti-idiotypischer Antikörper (US-Patent 4,731,237) oder durch Mimotopen-Screening [Geysen et al., J. Immunol. Meth. 102 : 259 (1987); PCT-Patentanmeldungen WO 86/00991 und WO 86/06487]. Da die meisten monoklonalen Antikörper jedoch von Nagerzellen stammen, gibt es die Möglichkeit, daß sie immunogen sein könnten, wenn sie bei einem Menschen therapeutisch verwendet werden, insbesondere über längere Zeit.
Um diese Möglichkeit zu vermeiden, wäre es wünschenswert, über Human-Antikörper oder "humanisierte" Antikörper gegen Human- IL-4 zu verfügen. Die Herstellung humanisierter Antikörper gegen IL-4 wurde tatsächlich in der Internationalen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer WO 93/17106 offenbart. Die offenbarten Antikörper sind zwar nützlich, besitzen jedoch nicht die gleichen Bindungsaffinitäten wie der ursprüngliche monoklonale Nager-Antikörper, auf dem sie beruhen.
Es wäre wünschenswert, über einen humanisierten Antikörper gegen Human-IL-4 zu verfügen, der eine mit der des Nager- Antikörpers vergleichbare Bindungsaffinität besitzt. Aus dem gegenwärtigen Stand der Technik läßt sich jedoch nicht vorher sagen, ob oder wie ein solcher Antikörper hergestellt werden könnte.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt einen solchen monoklonalen Antikörper mit hoher Affinität, Verfahren und Zusammensetzungen, die für die Behandlung von mit IL-4 zusammenhängenden Krankheiten nützliche sind, sowie Zwischenstufen zur Herstellung solcher Materialien bereit.
Insbesondere stellt diese Erfindung Polypeptide bereit, die variable Bereiche der leichten oder schweren Kette eines humanisierten monoklonalen Antikörpers gegen Human-IL-4 umfassen und die Aminosäuresequenzen, wie sie in SEQ ID NO: 70 bzw. SEQ ID NO: 79 gezeigt sind, oder Teilsequenzen solcher Sequenzen aufweisen. In einer Ausführungsform umfassen solche Polypeptide einen vollständigen humanisierten monoklonalen Antikörper. In anderen Ausführungsformen umfassen sie IL-4- bindende und/oder antigene Fragmente des humanisierten monoklonalen Antikörpers.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin isolierte DNAs bereit, die Polypeptide codieren, die variable Bereiche der leichten oder schweren Kette eines humanisierten monoklonalen Antikörpers gegen Human-IL-4 umfassen und die Aminosäuresequenzen, wie sie in SEQ ID NO: 70 bzw. SEQ ID NO: 79 gezeigt sind, oder Teilsequenzen solcher Sequenzen aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin rekombinante Vektoren und Wirtszellen, die die obigen DNAs umfassen, sowie Verfahren zur Herstellung der Polypeptide, die das Kultivieren solcher Wirtszellen unter Bedingungen, bei denen die DNAs exprimiert werden, umfassen, bereit.
Diese Erfindung stellt weiterhin IL-4-Bindungszusammensetzungen, einkettige Bindungsproteine, Fusionsproteine und auf dem humanisierten monoklonalen Antikörper beruhende Antikörperfragmente bereit.
Antikörper gegen den humanisierten Antikörper einschließlich anti-idiotypischer Antikörper und Fragmente solcher Antikörper werden ebenfalls von dieser Erfindung bereitgestellt, ebenso wie pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger sowie eine oder mehrere der obigen Bindungszusammensetzungen, Proteine, Polypeptide, antigenen Fragmente, Antikörper oder Antikörperfragmente umfassen.
Durch Verabreichung einer wirksamen Menge von einer oder mehreren der oben genannten Zusammensetzungen können durch Human-IL-4 vermittelte Krankheiten oder Zustände behandelt werden.

Kurzbeschreibung der Figuren

Diese Erfindung ist anhand der beigefügten Figuren besser zu verstehen:
Fig. 1 zeigt bei verschiedenen humanisierten Antikörpern vorgenommene Ersetzungen von Aminosäureresten im Vergleich zu den Antikörpern 25D2 und LAY.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines kompetitiven Assays, bei dem die Wirkungen variierender Konzentrationen der angegebenen Antikörper auf die Bindung einer festgelegten Menge Human-¹²&sup5;I-IL-4 an immobilisierten Ratten- Antikörper 25D2 gemessen wurden. Die gebundene Radioaktivität ist als Funktion der Konzentration des freien Antikörpers sowohl bei 4ºC als auch bei Raumtemperatur gezeigt.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Bioassays, bei dem die Wirkungen variierender Konzentrationen der angegebenen Antikörper auf die Reaktion einer Jijoye- Zellinie auf eine festgelegte Konzentration an Human-IL-4 durch ELISA gemessen wurden. Die Extinktion bei 405 nm ist als Funktion der Antikörperkonzentration gezeigt.

BeschreibunQ der Erfindungt

Viele der Arbeiten, die zu Vorstufenkonstrukten führten, die zur Fertigstellung der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, sind in der Internationalen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer WO 93/17106 beschrieben. Man sollte sich auf diese Veröffentlichung beziehen, wenn man wünscht, die bei der Herstellung der hier offenbarten humanisierten Antikörper verfolgte Strategie zu verstehen. Alle wesentlichen technischen Schritte, die zur Herstellung der in dieser Erfindung verwendeten Ausgangskonstrukte erforderlich sind, sind jedoch unten im einzelnen beschrieben.
Die hier verwendeten Ausdrücke "DNA" und "DNAs" bezeichnen Moleküle, die Desoxyribonucleotide umfassen, die in einer Standard-5'→3' -Phosphodiesterbindung miteinander verknüpft sind, einschließlich sowohl kleinerer Oligodesoxyribonucleotide und größerer Desoxyribonucleinsäuren.
Antikörper umfassen ein Gefüge von Polypeptidketten, die über Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Zwei Hauptpolypeptidketten, die als leichte Kette und schwere Kette bezeichnet werden, bilden alle größeren Strukturklassen (Isotypen) des Antikörpers. Sowohl schwere Ketten als auch leichte Ketten werden weiter in Teilbereiche unterteilt, die als variable Bereiche und konstante Bereiche bezeichnet werden.
Schwere Ketten umfassen einen einzigen variablen Bereich und drei oder vier verschiedene konstante Bereiche, und leichte Ketten umfassen einen einzigen (von dem der schweren Kette verschiedenen) variablen Bereich und einen einzigen (von denen der schweren Kette verschiedenen) konstanten Bereich. Die variablen Bereiche der schweren Kette und der leichten Kette sind für die Bindungsspezifität des Antikörpers verantwortlich.
Der hier verwendete Ausdruck "variabler Bereich der schweren Kette" bedeutet ein Polypeptid, das (1) typischerweise eine Länge von 110 bis 125 Aminosäuren aufweist und (2) dessen Aminosäuresequenz der einer schweren Kette eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung entspricht, beginnend mit der Nterminalen Aminosäure der schweren Kette. Ähnlich bedeutet der Ausdruck "variabler Bereich der leichten Kette" ein Polypeptid, das (1) typischerweise eine Länge von 95 bis 115 Aminosäuren aufweist und (2) dessen Aminosäuresequenz der einer leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung entspricht, beginnend mit der N-terminalen Aminosäure der leichten Kette.
Die Ausdrücke Fab, Fc, F(ab)&sub2; und Fv werden in ihren immunologischen Standardbedeutungen verwendet [Klein, Immunology (John Wiley, New York, 1982); Parham, Kapitel 14, in Weir, Hrsg., Immunochemistry, 4. Aufl. (Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986)].
Der hier verwendete Ausdruck "monoklonaler Antikörper" bezieht sich auf eine homogene Population von Immunglobulinen, die spezifisch an ein Epitop (d. h. eine antigene Determinante) von Human-IL-4, dem humanisierten Antikörper dieser Erfindung oder an antigene Fragmente davon binden.
Antigene (d. h. immunogene) Fragmente des humanisierten Antikörpers dieser Erfindung können IL-4-Bindungsfähigkeit haben oder auch nicht. Unabhängig davon, ob sie IL-4 binden, eignen sich solche Fragmente als Antigene zur Herstellung von Anti körpern nach Standardverfahren. Diese Antikörper, ob sie nun polyklonal oder monoklonal sind, können z. B. nach wohlbekannten Verfahren in einer immobilisierten Form an einen festen Träger gebunden verwendet werden, um die humanisierten Antikörper durch Immunaffinitätschromatograghie zu reinigen.
Antikörper gegen die antigenen Fragmente können ebenfalls, unmarkiert oder mit Standardverfahren markiert, als Basis für Immunoassays der humanisierten Antikörper verwendet werden. Welche besondere Markierung verwendet wird, hängt von dem Typ des verwendeten Immunoassays ab. Beispiele für Markierungen, die verwendet werden können, sind unter anderem radioaktive Markierungen, wie ³²p, ¹²&sup5;I, ³H und ¹&sup4;C; Fluoreszenzmarkierungen, wie Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl und Umbelliferon; chemilumineszente Markierungen, wie Luciferin und 2,3-Dihydrophthalazindione; sowie Enzyme, wie Meerrettich-Peroxidase, Alkalische Phosphatase, Lysozym und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase.
Die Antikörper können nach bekannten Verfahren mit solchen Markierungen markiert werden. Zum Beispiel können Kopplungsmittel, wie Aldehyde, Carbodiimide, Dimaleinimid, Imidate, Succinimide, bisdiazotiertes Benzidin und dergleichen, verwendet werden, um die Antikörper mit Fluoreszenz-, Chemilumineszenz- oder Enzymmarkierungen zu markieren.
Die dabei verwendeten allgemeinen Verfahren sind in der Technik wohlbekannt und sind z. B. beschrieben in Immunoassay: A Practical Guide, 1987, Chan (Hrsg.), Academic Press, Inc., Orlando, FL. Solche Immunoassays könnten z. B. mit Fraktionen während der Reinigung der humanisierten Antikörper oder mit Serumproben von Patienten, die die humanisierten Antikörper oder Fragmente davon mit IL-4-Bindungswirkung erhalten, durchgeführt werden.
Selbstverständlich können auch die humanisierten Antikörper selbst oder IL-4-bindende Fragmente davon für die Immunaffinitätsreinigung oder den Immunoassay von Human-IL-4 verwendet werden.
Es ist in der Technik wohlbekannt, daß Epitope im allgemeinen wenigstens fünf Aminosäurereste enthalten [Ohno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 2945 (1985)]. Daher umfassen die antigenen Fragmente dieser Erfindung typischerweise wenigstens fünf Aminosäurereste der Sequenz der vollständigen schweren oder·leichten Kette des humanisierten Antikörpers. Vorzugsweise enthalten sie wenigstens 7 und am meisten bevorzugt etwa 10 Aminosäurereste, um zu gewährleisten, daß sie antigen sind. Ob ein gegebenes Fragment immunogen ist, kann leicht durch Routineversuche bestimmt werden.
Solche antigenen Fragmente können durch proteolytische Spaltung des Antikörpers oder durch chemische Synthese oder Rekombinationstechnik hergestellt werden und sind also nicht durch proteolytische Spaltstellen eingeschränkt.
Vorzugsweise werden kleinere antigene Fragmente zuerst durch Vernetzung oder durch Kopplung an ein immunogenes Trägermolekül (d. h. ein Makromolekül mit der Eigenschaft, daß es in einem Wirtstier unabhängig eine immunologische Reaktion hervorruft und mit dem die Polypeptide der Erfindung kovalent verknüpft werden können) immunogener gemacht. Vernetzung oder Konjugation an ein Trägermolekül kann erforderlich sein, da kleine Polypeptidfragmente manchmal als Haptene wirken (Moleküle, die spezifisch an einen Antikörper zu binden vermögen, die aber keine Antikörperproduktion hervorrufen können, d. h. nicht immunogen sind). Durch die Konjugation solcher Fragmente an ein immunogenes Trägermolekül werden sie durch einen Effekt, der üblicherweise als "Trägereffekt" bekannt ist, immunogen.
Zu den geeigneten Trägermolekülen gehören z. B. Proteine und natürliche oder synthetische polymere Verbindungen, wie Polypeptide, Polysaccharide, Lipopolysaccharide usw. Proteine als Trägermoleküle werden besonders bevorzugt; dazu gehören unter anderem Schlitzschnecken-Hämocyanin und Säugerserumproteine, wie Human- oder Rinder-Gammaglobulin, Human-, Rinder- oder Kaninchen-Serumalbumin oder methylierte oder andere Derivate solcher Proteine. Weitere Trägerproteine werden dem Fachmann geläufig sein. Vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, wird das Trägerprotein für das Wirtstier, in dem Antikörper gegen die Fragmente erzeugt werden sollen, fremd sein.
Eine kovalente Kopplung an das Trägermolekül läßt sich unter Verwendung von in der Technik wohlbekannten Verfahren erreichen; ihre genaue Wahl wird durch die Natur des verwendeten Trägermoleküls bestimmt. Wenn das immunogene Trägermolekül ein Protein ist, können die Fragmente der Erfindung z. B. unter Verwendung wasserlöslicher Carbodiimide, wie Dicyclohexylcarbodiimid oder Glutaraldehyd, gekoppelt werden.
Kopplungsmittel wie diese können auch verwendet werden, um die Fragmente mit sich selbst zu vernetzen, ohne ein getrenntes Trägermolekül zu verwenden. Eine solche Vernetzung zu Aggregaten kann die Immunogenität ebenfalls erhöhen. Die Immunogenität kann auch durch die Verwendung bekannter Adjuvantien allein oder in Kombination mit Kopplung oder Aggregation erhöht werden.
Zu den geeigneten Adjuvantien für die Impfung von Tieren gehören unter anderem Adjuvans 65 (das Erdnußöl, Mannidmonooleat und Aluminiummonostearat enthält), Freunds vollständiges oder unvollständiges Adjuvans, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Alaun, Tenside, wie Hexadecylamin, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N',N'-bis(2-hydroxymethyl)propandiamin, Methoxyhexadecylglycerin und Pluronic-Polyole, Poly anionen, wie Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Polyacrylsäure und Carbopol, Peptide, wie Muramyldipeptid, Dimethylglycin und Tuftsin, sowie Ölemulsionen. Die Polypeptide könnten auch nach dem Einbau in Liposomen oder andere Mikroträger verabreicht werden.
Informationen über Adjuvantien und verschiedene Aspekte von Immunoassays sind z. B. in der Serie von P. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, 3. Aufl., 1987, Elsevier, New York, offenbart.
Serum, das von so immunisierten Tieren erzeugt wird, kann direkt verwendet werden. Alternativ dazu kann die IgG-Fraktion mit Standardverfahren, wie Plasmaphorese oder Adsorptionschromatographie unter Verwendung von IgG-spezifischen Adsorbentien, wie immobilisiertem Protein A, aus dem Serum abgetrennt werden.
Der hier verwendete Ausdruck "Bindungszusammensetzung" bedeutet eine Zusammensetzung, die zwei Polypeptidketten umfaßt, die (1), wenn sie operationell miteinander verbunden sind, eine Konformation annehmen, die eine hohe Bindungsaffinität zu Human-IL-4 hat, und die (2) von einem Hybridom abgeleitet sind, das für Human-IL-4 spezifische monoklonale Antikörper erzeugt.
Der Ausdruck "operationell miteinander verbunden" soll darauf hinweisen, daß die zwei Polypeptidketten zur Bindung mit einer Vielzahl von Mitteln relativ zueinander positioniert werden können, einschließlich der Assoziation in einem nativen Antikörperfragment, wie einem Fab- oder Fv-Fragment, oder mit Hilfe gentechnisch erzeugter cysteinhaltiger oder anderer Linker an den Carboxytermini.
Verfahren zur Herstellung rekombinanter Fv-Fragmente auf der Grundlage bekannter Sequenzen variabler Bereiche von schweren und leichten Ketten eines Antikörpers sind in der Technik bekannt und wurden z. B. von Moore et al. (US-Patent Nr. 4,642,334) und von Plückthun [Bio/Technology 9: 545 (1991)] beschrieben. Alternativ dazu können sie auch nach Standardverfahren chemisch synthetisiert werden.
Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen den humanisierten Antikörper der Erfindung oder antigenen Fragmenten davon verwendete Hybridome werden durch wohlbekannte Techniken erzeugt. Gewöhnlich beinhaltet das Verfahren die Fusion einer immortalisierenden Zellinie mit einem B-Lymphocyten, der den gewünschten Antikörper erzeugt. Alternativ dazu sind auch fusionsfreie Techniken zur Erzeugung unsterblicher antikörpererzeugender Zellinien möglich, die ebenfalls in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen, z. B. eine viral induzierte Transformation [Casali et al., Science 234: 476 (1986)]. Immortalisierende Zellinien sind gewöhnlich transformierte Säugerzellen, insbesondere Myelomzellen, die von Nagern, Rind und Mensch abgeleitet sind. Zweckmäßigerweise und wegen der Verfügbarkeit werden am häufigsten Ratten- oder Maus-Myelomzellinien eingesetzt.
Techniken zur Gewinnung der geeigneten Lymphocyten aus Säugern, denen das Zielantigen injiziert wurde, sind wohlbekannt. Im allgemeinen werden Lymphocyten des peripheren Blutes (PBLs) verwendet, wenn Zellen menschlicher Herkunft gewünscht werden, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen werden verwendet, wenn nichtmenschliche Säugerquellen gewünscht werden. Einem Wirtstier werden wiederholte Dosen des gereinigten Antigens injiziert, und man läßt das Tier die gewünschten antikörperbildenden Zellen erzeugen, bevor diese für die Fusion mit der immortalisierenden Zellinie entnommen werden. Techniken für die Fusion sind in der Technik ebenfalls wohlbekannt; sie beinhalten im allgemeinen das Mischen der Zellen mit einem Fusionsmittel, wie Polyethylenglycol.
Hybridome werden nach Standardverfahren selektiert, wie durch HAT-Selektion (HAT = Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin). Von diesen Hybridomen werden solche, die den gewünschten Antikörper sezernieren, ausgewählt, indem man ihr Kulturmedium durch Standard-Immunoassays testet, wie Western-Blotting, ELISA (enzymelinked immunosorbent assay), RIA (Radioimmunoassay) oder dergleichen. Antikörper werden mit Hilfe von Standard- Proteinreinigungstechniken aus dem Medium gewonnen [Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)]. Viele Literaturstellen mit einer Anleitung zur Anwendung einer der obigen Techniken stehen zur Verfügung [Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982)]. Monoklonale Antikörper können auch unter Verwendung wohlbekannter Phagen- Bibliothekssysteme erzeugt werden.
Die Verwendung und Erzeugung von Antikörperfragmenten ist ebenfalls wohlbekannt, z. B. Fab-Fragmente [Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)], Fv-Fragmente [Hochman et al., Biochemistry 12: 1130 (1973); Sharon et al., Biochemistry 15: 1591 (1976); Ehrlich et al., US-Patent Nr. 4,355,023] und Antikörper-Halbmoleküle (Auditore-Hargreaves, US-Patent Nr. 4,470,925).
Monoklonale Antikörper der Erfindung werden entweder als glycosylierte oder unglycosylierte Versionen der rekombinant erzeugten humanisierten Antikörper erzeugt. Im allgemeinen werden unglycosylierte Versionen in E. coli erzeugt, und glycosylierte Versionen werden in Hefe-oder Säugerwirtszellen erzeugt, z. B. Eierstockzellen Chinesischer Hamster (CHO), COS- Affen- oder Maus-L-Zellen.
Die rekombinant erzeugten humanisierten Antikörper werden erzeugt, indem man einen Expressionsvektor nach Standardvorschriften in eine Wirtszelle einführt [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982); Okayama und Berg, Mol. Cell. Biol. 2: 161 (1982); Okayama und Berg, Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983); Hamer, Genetic Engineering 2: 83 (1980); US-Patent Nr. 4,599,308; Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 2: 1304 (1982)].
Der Aufbau von bakteriellen oder Säuger-Expressionsvektoren ist in der Technik wohlbekannt, sobald die Nucleotidsequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, bekannt ist oder in sonstiger Weise zur Verfügung steht. Zum Beispiel hat Deßoer (US-Patent Nr. 4,511,433) Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Expressionsvektoren offenbart. Goeddel et al. (US- Patent Nr. 4,601,980) und Riggs (US-Patent Nr. 4,431,739) haben die Erzeugung von Säugerproteinen durch E.-coli- Expressionssysteme offenbart. Riggs (loc. cit.), Ferretti et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 599 (1986)], Sproat et al. [Nucleic Acids Res. 13: 2959 (1985)] und Mullenbach et al. [J. Biol. Chem. 261: 719 (1986)] offenbaren, wie man synthetische Gene für die Expression in Bakterien aufbaut.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden Ergebnis, daß ein humanisierter Antikörper gegen Human-IL-4, der in der Internationalen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer WO 93/17106 offenbart ist, unter Verwendung von Verfahren, die in der Veröffentlichung nicht offenbart sind, weiter verändert werden konnte, so daß man einen neuen humanisierten Antikörper mit deutlich verbesserten Eigenschaften erhielt. Dieser als h25D2-9 bezeichnete neue Antikörper ist zum Teil durch Aktivitäten in einem kompetitiven IL-4-Bindungsassay und in einem Bioassay gekennzeichnet, die mit denen des monoklonalen Nager- Antikörpers 25D2, auf dem der humanisierte Antikörper beruht, vergleichbar sind.
Obwohl der beste, in der Internationalen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer WO 93/17106 offenbarte humanisierte Antikörper, der als h25D2-1 bezeichnet wurde, in dem kompetitiven Bindungsassay bei 4ºC ähnliche Ergebnisse lieferte, schien der Antikörper h25D2-9 bei Raumtemperatur beträchtlich leistungsfähiger zu sein als der Antikörper h25D2-1. Wegen der verbesserten Aktivität, die Antikörper h25D2-9 bei der höheren Temperatur aufweist, ist dieser Antikörper für die therapeutische Verwendung besser geeignet.
Der neue humanisierte Antikörper h25D2-9 ist weiterhin durch eine gegenüber den zuvor offenbarten humanisierten Antikörpern überraschend erhöhte Expression in COS-Zellen gekennzeichnet. Die verfügbaren Daten lassen vermuten, daß diese erhöhte Expression, die fünf- bis zehnmal stärker ist als die Expression des Antikörpers h25D2-1 in denselben Zellen, auf eine verstärkte Kettenassoziation innerhalb der Zellen zurückzuführen ist. Die vorliegende Erfindung hängt jedoch keineswegs davon ab, ob diese mögliche Erklärung richtig ist oder nicht.
Der humanisierte Antikörper h25D2-9 wurde entworfen, indem man in den Antikörper h25D2-1 weitere Gerüstmodifikationen einführte. Dieses Verfahren, das den Ersatz einiger Nicht- Consensus-Gerüstreste durch entweder Nager- oder Consensus- Human-Reste beinhaltete, wurde durchgeführt, indem man bis zu einem gewissen Grade die Regeln befolgte, die von Adair et al. in der Internationalen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer WO 91/09967 offenbart sind.
Wie in den Beispielen unten angemerkt, wurden die Verfahren von Adair et al. jedoch modifiziert. Weiterhin liegen Beweise dafür vor, daß ein humanisierter Antikörper mit den überlegenen Eigenschaften des Antikörpers h25D2-9 nicht hätte erzeugt werden können, wenn man die Verfahren von Adair et al. de novo auf den monoklonalen Nager-Antikörper 25D2 angewendet hätte. Erforderlich ist eine Modifikation des Ausgangskonstrukts h25D2-1 gemäß den Regeln von Adair et al., wie sie hier modifiziert wurden.
Die Nucleotidsequenzen von cDNAs, die die variablen Bereiche der schweren (VH) und der leichten (VL) Kette des monoklonalen Anti-Human-IL-4-Antikörpers 25D2 codieren, dessen Erzeugung unten beschrieben ist, sind im Sequenzlisting durch SEQ ID NO: 1 bzw. 2 definiert. Die aus diesen Nucleotidsequenzen vorhergesagten Aminosäuresequenzen sind ebenfalls in SEQ ID NO: 1 bzw. 2 definiert.
Die Nucleotid- und vorausgesagten Aminosäuresequenzen der variablen Bereiche der leichten und der schweren Kette des Antikörpers h25D2-9 sind in SEQ ID NO: 70 bzw. 79 gezeigt, obwohl der Fachmann sich darüber im klaren sein wird, daß diese Sequenzen auch Teilsequenzen enthalten, die nicht im variablen Bereich liegen.
Insbesondere enthalten die Sequenzen des variablen Bereichs sekretorische Leitsequenzen, die typischerweise während der posttranslationalen Prozessierung in eukaryontischen Zellen unter Bildung der reifen Formen abgespalten werden. Die mutmaßlichen aminoterminalen Reste für die reifen Formen der leichten und der schweren Kette sind in SEQ ID NO: 70 bzw. 79 angegeben. Obwohl die angegebenen Leitsequenzen verwendet wurden, wird sich der Fachmann darüber im klaren sein, daß man stattdessen auch viele andere wohlbekannte Leitsequenzen einschließlich Nicht-Antikörper-Leitsequenzen hätte verwenden können.
Die in SEQ ID NO: 70 und 79 gezeigten variablen Bereiche können auch die Grundlage für die Gestaltung nichtpeptidischer mimetischer Verbindungen bilden, die die funktionellen Eigenschaften des Antikörpers h25D2-9 nachahmen. Verfahren zur Herstellung solcher mimetischer Verbindungen wurden von Saragovi et al. beschrieben [Science 253: 792 (1991)].
Außer daß sie eine Basis für die Herstellung eines überlegenen humanisierten Antikörpers gegen Human-IL-4 liefert, kann die Information in SEQ ID NO: 70 und 79 auch verwendet werden, um einkettige IL-4-Bindungsproteine zu erzeugen, die miteinander verknüpfte Fragmente der schweren und leichten Kette des Fv- Bereichs, wie es von Bird et al. beschrieben wird [Science 242: 423 (1988)], oder Bindungsstellen für biosynthetische Antikörper (BABS), wie es von Huston et al. beschrieben wird [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 (1988)], umfassen. Einzeldomänen-Antikörper, die isolierte variable Bereiche der schweren Kette umfassen [Ward et al., Nature 341: 54 4 (1989)] können ebenfalls unter Verwendung der offenbarten Sequenzinformation hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um bispezifische Antikörper aufzubauen, die eine Bindungsspezifität für ein weiteres Antigen sowie für IL-4 aufweisen. Solche Antikörper können durch bekannte Verfahren aufgebaut werden, z. B. durch chemische Reassoziation von Halbmolekülen, wie es von Brennan et al. beschrieben wird [Science 229: 81 (1985)].
Die variablen Bereiche des Antikörpers h25D2-9 können auch in einem Polypeptid miteinander gekoppelt werden, entweder direkt oder über eine Linkersequenz. Ein oder mehrere der variablen Bereiche können auch in ein anderes (Nicht-Immunglobulin-) Polypeptid oder Protein eingebaut werden, wodurch sie dem Polypeptid oder Protein eine IL-4-Bindungsfähigkeit verleihen.
Die leichte und die schwere Kette des Antikörpers h25D2-9 können auch in Verbindung mit der komplementären Kette von einem anderen monoklonalen Antikörper verwendet werden, was zu einer Art "Hybrid"-Antikörper führt. Zum Beispiel wurde die schwere Kette des Antikörpers h25D2-9 mit der leichten Kette des Antikörpers h25D2-1 kombiniert und umgekehrt. Wenn die komplementäre Kette von einem für Human-IL-4 spezifischen Nager-Antikörper, wie Antikörper 25D2, ausgewählt wird, würde sich ein "halbhumanisierter" Antikörper ergeben. Ob solche Antikörper eine ausreichende Affinität zu IL-4 haben, kann durch Routineversuche unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren leicht bestimmt werden.
Polypeptide, die "einen variablen Bereich einer leichten oder schweren Kette eines humanisierten monoklonalen Antikörpers gegen Human-IL-4 umfassen und Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NO: 70 bzw. 79 gezeigt sind, oder Teilsequenzen solcher Sequenzen aufweisen", sind hier so definiert, daß sie alle obigen abgeleiteten Formen des spezifischen bindenden Bereichs des Antikörpers h25D2-9 umfassen. Selbstverständlich würde man die reifen Formen ohne jede sekretorische Leitsequenz verwenden.
Nucleinsäuren, die die variablen Bereiche der schweren oder leichten Kette des Antikörpers h25D2-9 codieren, können durch Standardverfahren unter Verwendung der in SEQ ID NO: 70 und 79 angegebenen Nucleinsäuresequenzinformation hergestellt werden. Zum Beispiel kann DNA chemisch synthetisiert werden, wobei man z. B. das Phosphoramidit-Verfahren mit festem Träger nach Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981)], das Verfahren von Yoo et al. [J. Biol. Chem. 764: 17078 (1989)] oder andere wohlbekannte Verfahren verwendet. Dies kann geschehen, indem man eine Reihe von Oligonucleotidcassetten, die Paare von synthetischen Oligonucleotiden umfassen, nacheinander miteinander verknüpft, wie es unten beschrieben ist.
Da der genetische Code degeneriert ist, können selbstverständlich viele verschiedene Nucleotidsequenzen Polypeptide mit den durch SEQ ID NO: 70 und 79 definierten Aminosäuresequenzen oder Teilsequenzen davon codieren. Die Codons können so ausgewählt werden, daß man eine optimale Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen erhält. Solche degenerierten Varianten fallen ebenfalls in den Umfang dieser Erfindung.
Die Insertion der DNAs, die die variablen Bereiche der schweren und leichten Kette des Antikörpers h25D2-9 codieren, in einen Vektor ist leicht zu erreichen, wenn die Termini beider DNAs und des Vektors verträgliche Restriktionsstellen umfassen. Wenn sich dies nicht erreichen läßt, kann es notwendig sein, die Termini der DNAs und/oder des Vektors zu modifizieren, indem man einzelsträngige DNA-Überhänge, die durch Spaltung mit Restriktions-Endonucleasen erzeugt wurden, durch Abbau unter Bildung glatter Enden zurückschneidet, oder dasselbe Ergebnis zu erreichen, indem man die einzelsträngigen Termini mit einer geeigneten DNA-Polymerase auffüllt.
Alternativ dazu kann jede gewünschte Spaltstelle erzeugt werden, indem man Nucleotidsequenzen (Linker) an die Termini ligasiert. Solche Linker können spezifische Oligonucleotidsequenzen umfassen, die gewünschte Restriktionsstellen definieren. Restriktionsstellen können auch durch Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugt werden. Siehe z. B. Saiki et al., Science 239: 487 (1988). Der gespaltene Vektor und die DNA-Fragmente können erforderlichenfalls auch durch Homopolymer-Schwanzbildung modifiziert werden.
Die Expression der Nucleinsäuren, die die Polypeptidketten der humanisierten Antikörper dieser Erfindung codieren, kann nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, wobei man entweder einen oder zwei Expressionsvektoren verwendet. Die Synthese der vollständigen Antikörper kann in einer einzigen Wirtszelle durchgeführt werden, oder die schwere und die leichte Kette können in zwei verschiedenen Wirtszellen hergestellt und dann miteinander kombiniert werden. Die dabei verwendete Methode ist z. B. im US-Patent Nr. 4,816,397 an Boss et al. und im US-Patent Nr. 4,816,567 an Cabilly et al. offenbart.
Die Polypeptide, Antikörper und Fragmente dieser Erfindung können durch Standardverfahren gereinigt werden; dazu gehören unter anderem die präparative Disk-Gel-Elektrophorese, iso elektrische Fokussierung, HPLC, Umkehrphasen-HPLC, Gelfiltration, Ionenaustausch- und Verteilungschromatographie, Ligandenaffinitäts-Chromatographie mit Protein A oder G sowie Gegenstromverteilung. Reinigungsverfahren für Antikörper sind z. B. offenbart in The Art of Antibody Purification, 1989, Amicon Division, W. R. Grace k Co.
Unter Verwendung der monoklonalen Antikörper, Bindungszusammensetzungen, Fusionsproteine oder einkettigen Bindungsproteine der Erfindung oder von gegen solche monoklonalen Antikörper gebildeten anti-idiotypischen Antikörpern können pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt werden, um mit IL-4 zusammenhängende Krankheiten zu behandeln.
Einige der Zusammensetzungen haben IL-4-blockierende oder -antagonistische Wirkungen und können verwendet werden, um IL- 4-Aktivität zu unterdrücken. Solche Zusammensetzungen umfassen die monoklonalen Antikörper, Bindungszusammensetzungen oder einkettigen Bindungsproteine der Erfindung und einen physiologisch annehmbaren Träger.
Andere Zusammensetzungen umfassen anti-idiotypische Antikörper, die unter Verwendung der monoklonalen Antikörper der Erfindung als Antigen hergestellt wurden, und einen physiologisch annehmbaren Träger. Diese anti-idiotypischen Antikörper, die entweder monoklonal oder polyklonal sein können und die nach Standardverfahren hergestellt werden, können die Bindungsaktivität von IL-4 selbst nachahmen. In diesem Fall können sie als IL-4-Agonisten potentiell nützlich sein.
Die humanisierten Antikörper (oder Bindungsfragmente) dieser Erfindung können in Form von Komplexen verwendet werden, in denen die Antikörper an IL-4 gebunden sind. Solche Komplexe können die Halbwertszeit von IL-4 im Serum verlängern und somit eine verlängerte Freisetzung erzeugen, indem sie die Geschwindigkeit des Abbaus verringern. Sie können auch eine kontrollierte Freisetzung des IL-4 erzeugen, da das IL-4 langsam von den Komplexen abdissoziiert.
Die Dosierung bei einer therapeutischen Anwendung wird vom behandelnden Arzt bestimmt, der verschiedene Faktoren berücksichtigt, die die Wirkung der Antikörper modifizieren können, z. B. den Zustand, das Körpergewicht, Geschlecht und die Ernährung des Patienten, die Schwere einer gegebenenfalls vorhandenen Infektion, die Verabreichungszeit und andere klinische Faktoren.
Typische Vorschriften für die therapeutische Verabreichung von Antikörpern sind in der Technik wohlbekannt und wurden z. B. offenbart von Elliott et al. [The Lancet 344: 1125 (1994)], Isaacs et al. [The Lancet 340: 748 (1992)], Anasetti et al. [Transplantation 54: 844 (1992)], Anasetti et al. [Blood 84: 1320 (1994)], Hale et al. [The Lancet 2: 1394 (17. Dezember 1988)], Queen [Scrip 1881 : 18 (1993)] und Mathieson et al. [N. Eng. J. Med. 323 : 250 (1990)].
Die Verabreichung der Zusammensetzungen dieser Erfindung erfolgt typischerweise parenteral, durch intraperitoneale, intravenöse, subcutane oder intramuskuläre Injektion, oder durch Infusion oder durch irgendein anderes annehmbares systemisches Verfahren. Die Verabreichung durch intravenöse Infusion, typischerweise über einen Zeitraum von etwa 1 bis 5 Stunden, wird bevorzugt.
Häufig werden die Behandlungsdosen von einem niedrigen Niveau langsam gesteigert, um die Sicherheit und Wirksamkeit zu optimieren. Im allgemeinen werden die Antikörper-Tagesdosen in einen Bereich von etwa 0,01 bis 20 mg Protein pro kg Körpergewicht fallen. Typischerweise wird der Dosisbereich etwa 0,1 bis 5 mg Protein pro kg Körpergewicht sein.
Wenn IL-4 durch spezifische Bindung an die Antikörper oder Bindungsfragmente der Erfindung komplexiert ist, sollten die Mengen der verwendeten Komplexe typischerweise so eingestellt werden, daß sie etwa 0,001 bis etwa 50 ug IL-4 pro kg Körpergewicht pro Tag enthalten. Vorzugsweise wird die verabreichte Menge des komplexierten IL-4 im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 10 ug pro kg pro Tag und am meisten bevorzugt von etwa 0,05 bis etwa 2 ug pro kg pro Tag liegen.
Obwohl die Zusammensetzungen dieser Erfindung auch in einfacher Lösung verabreicht werden könnten, werden sie normalerweise in Kombination mit anderen Materialien, wie pharmazeutischen Trägern, verwendet. Bei den geeigneten pharmazeutischen Trägern kann es sich um jede verträgliche nichttoxische Substanz handeln, die zur Verabreichung der Zusammensetzungen der Erfindung an einen Patienten geeignet ist. Steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe können in einem Träger enthalten sein. Pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe (Puffersubstanzen, Dispersionsmittel) können ebenfalls in die pharmazeutische Zusammensetzung aufgenommen werden. Im allgemeinen sind für die parenterale Verabreichung solcher Medikamente geeignete Zusammensetzungen wohlbekannt; siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Science, 17. Aufl. (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990). Alternativ dazu können Zusammensetzungen der Erfindung auch durch implantierbare Wirkstoffabgabesysteme in den Körper eines Patienten eingeführt werden [Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199 (1984)].
Therapeutische Formulierungen können in jeder üblichen Darreichungsform verabreicht werden. Die Zubereitungen umfassen typischerweise wenigstens einen Wirkstoff zusammen mit einem oder mehreren annehmbaren Trägern. Zu den Zubereitungen können solche gehören, die für orale, rektale, nasale oder parenterale (einschließlich subcutane, intramuskuläre, intravenöse und intradermale) Verabreichung geeignet sind.
Die Zubereitungen können zweckmäßigerweise in Form von Dosiseinheiten angeboten werden und können nach jedem Verfahren hergestellt werden, das in der Fachkunde der Pharmazie wohlbekannt ist. Siehe z. B. Gilman et al. (Hrsg.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. Aufl., Pergamon Press; und Remington's Pharmaceutical Science, loc. cit., Easton, PA; Avis et al. (Hrsg.) (1993), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, New York; Lieberman et al. (Hrsg.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, New York; und Lieberman et al. (Hrsg.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, New York.

Beispiele

Die folgenden nichteinschränkenden Beispiele werden dazu dienen, die vorliegende Erfindung zu erläutern. Die Auswahl von Vektoren und Wirten sowie die Konzentration von Reagentien, Temperaturen sowie die Werte anderer Variablen sollen nur die Anwendung der vorliegenden Erfindung beispielhaft wiedergeben und sind nicht als Einschränkungen derselben anzusehen.
Wenn nichts anderes angegeben ist, sind Prozentwerte, die unten für Feststoffe in Feststoffgemischen, Flüssigkeiten in Flüssigkeiten bzw. Feststoffe in Flüssigkeiten angegeben sind, auf der Basis von w/w, v/v bzw. w/v. Während der Zellkultur wurden sterile Bedingungen aufrechterhalten.

Beispiel I. Klonierung des Antikörpers 25D2

Allgemeine Verfahren und Reagentien

Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden Standardverfahren der DNA-Rekombinationstechnik im wesentlichen so durchgeführt, wie es in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben ist.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus gesättigten Übernachtkulturen im kleinen Maßstab wurde gemäß dem Verfahren von Birnboim et al. durchgeführt [Nuc. Acids Res. 7: 1513 (1979)]. Dieses Verfahren erlaubt die Isolierung einer kleinen Menge DNA aus einer Bakterienkultur für analytische Zwecke. Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden größere Mengen Plasmid-DNA so hergestellt, wie es von Clewell et al. beschrieben wird [J. Bacteriol. 110: 1135 (1972)].
Spezifische Restriktionsenzymfragmente, die von einer Spaltung der Plasmid-DNA herstammen, wurden durch präparative Elektrophorese in Agarose isoliert. Gele mit den Maßen 9 · 5 1/2 cm wurden 1 Stunde mit 50 mA in Tris-Borat-Puffer laufen gelassen (Maniatis et al., loc. cit., S. 454) und dann mit 0,5 ug/ml Ethidiumbromid angefärbt, um die DNA sichtbar zu machen. Geeignete Gelabschnitte wurden herausgeschnitten, und die DNA wurde elektrisch eluiert (Maniatis et al., loc. cit., S. 164). Nach der elektrischen Elution wurde die DNA mit Phenol extrahiert (Maniatis et al., loc. cit., S. 458) und mit Ethanol gefällt (Maniatis et al., loc. cit., S. 461).
Restriktionsenzyme und T4-DNA-Ligase wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) bezogen. Die Reverse Transcriptase Superscript RNase H&supmin; stammte von BRL/Gibco (Rockville, MD), Taq-DNA-Polymerase von Stratagene (LaJolla, CA), das Klenow- Fragment der DNA-Polymerase von Pharmacia LKB Biotechnology, Inc. (Piscataway, NJ), Kälberdarm-Phosphatase von Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN), und RNAsin von Promega (Madison, WI). Alle Enzyme wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Das Sequenzierungssystem Sequenase, Version 2.0, wurde von United States Biochemical (Cleveland, OH) erhalten.
Desoxynucleotidtriphosphate und Oligo-dT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8;-Primer stammten von Pharmacia LKB Biotechnology, Rinderserumalbumin von Boeh ringer Mannheim Biochemicals, und redestilliertes Phenol von BRL/Gibco.
Der Plasmidvektor Bluescript wurde von Stratagene bezogen, während der kompetente E.-coli-Stamm DH5-a (Max Efficiency) von BRL/Gibco stammte.
Gewebekulturmedien und Ergänzungen stammten von BRL/Gibco, und Kälberfetusserum stammte von Hyclone Laboratories, Inc. (Logan, UT).

Zellkultur

Die Hybridomzellinie MP4.25D2.11 wurde in RPMI-1640-Medium, das mit 10% hitzeinaktiviertem Kälberfetusserum, 2 mM Glutamin und 10 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin ergänzt war, in einer feuchten Kammer von 37ºC mit 5% CO&sub2; aufrechterhalten.

Isolierung und Sequenzierung des monoklonalen Antikörpers 25D2

Durch die Hybridomzellinie MP4.25D2.11 konditioniertes Medium wurde durch Ultrafiltration auf das 10- bis 40fache konzentriert und dann in 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,0, 0,15 M NaCl mit 0,005% Natriumazid auf eine GAMMABIND-G®-Agarose-Säule aufgetragen. Gammaßind-G-Agarose ist eine in Kügelchen vorliegende Agarose, auf der rekombinantes streptokokkales Protein G kovalent immobilisiert wurde. Dann wurde das gebundene Protein mit 0,5 M Essigsäure eluiert, die mit Ammoniumhydroxid auf pH 3,0 eingestellt war. Fraktionen, die gereinigten monoklonalen Antikörper 25D2 enthielten, wurden durch Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) im wesentlichen so isoliert, wie es von Laemmli beschrieben wird [Nature 227: 680 (1970)].
Zwei Verfahren wurden verwendet, um die schweren und leichten Ketten des gereinigten Antikörpers 25D2 für die Sequenzbestim mung voneinander zu trennen. Beim ersten Verfahren wurde halbpräparatives SDS-PAGE mit anschließendem Electroblotting auf eine Polyvinyldifluorid-(PVDF)-Membran eingesetzt. In Kürze: 120 ug (800 umol) des hochgereinigten Antikörpers wurden nach der Reduktion mit 2-Mercaptoethanol einer Plattengelelektrophorese in SDS unterzogen (Laemmli, loc. cit.). Dann wurden die aufgelösten schweren und leichten Ketten auf eine IMMOBILON®- Membran (eine PVDF-Membran von Millipore, Bedford, MA) übertragen, wobei im wesentlichen das Electroblotting-Verfahren von Matsudaira [J. Biol. Chem. 261: 10035 (1987)] verwendet wurde. Die Banden, die den schweren und leichten Ketten entsprachen, wurden nach Anfärben mit Coomassie Brilliant Blue aus der Membran herausgeschnitten und für die N-terminale Sequenzierung verarbeitet.
Das andere Verfahren erlaubte die Isolierung größerer Mengen der schweren und leichten Ketten in Lösung. Bei Verwendung dieses Verfahrens wurde eine 6-ml-Probe von gereinigtem Antikörper 25D2, die 1 mg/ml Protein enthielt, bei 4ºC gegen 0,1 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0, dialysiert und dann einer oxidativen Sulfitolyse in Na&sub2;SO&sub3;/Na&sub2;S&sub2;O&sub6; unterzogen, im wesentlichen so, wie es von Morehead et al. beschrieben wird [Biochemistry 23: 2500 (1984)].
Nach der Sulfitolyse wurde das Antikörperpräparat gegen 1 M Essigsäure dialysiert, zur Trockne lyophilisiert, in 1 M Essigsäure auf ein Volumen von 1,5 ml rekonstituiert und einer Gelfiltration in einer SEPHADEX-G-75®-Säule von 1 · 30 cm (Pharmacia, Piscataway, NJ), die mit demselben Puffer äquilibriert worden war, unterzogen.
Fraktionen, die mit schweren und leichten Ketten angereichert waren, wurden getrennt vereinigt und getrennt einer Gelfiltration in einer SEPHADEX-G-75®-Säule von 1,5 · 100 cm in 1 M Essigsäure unterzogen. Die Reinheit der schweren und leichten Ketten nach diesem Schritt wurde durch analytisches SDS-PAGE bewertet. Fraktionen, die die schweren (4 nmol) und leichten (3 nmol) Ketten enthielten, wurden getrennt vereinigt und zur Sequenzierung im Vakuum auf Volumina von etwa 0,1 ml konzentriert.
Alle N-terminalen Aminosäuresequenzierungen wurden unter Verwendung eines Protein-Peptid-Sequencers des Typs Applied Biosystems Model 477A durchgeführt. Die Sequenzierung der auf die IMMOBILON®-Membran geblotteten isolierten schweren und leichten Ketten wurde im wesentlichen so durchgeführt, wie es von Yuen et al. beschrieben wird [Biotechniques 7: 74 (1989)1. Die Analyse der isolierten Ketten in Lösung erfolgte nach den Anweisungen des Herstellers des Sequencers.

Entwurf der Oliqonucleotidprimer und Klonierungsstrategie

Auf der Grundlage von Informationen aus den obigen Aminosäuresequenzanalysen wurden degenerierte Oligonucleotidprimer zur Verwendung bei der PCR entworfen. Ein als B1798 bezeichneter degenerierter Primer hatte eine Nucleotidsequenz, die die 13 aminoterminalen Aminosäurereste der reifen schweren Kette von 25D2 codiert. Ein anderer, als B1873 bezeichneter degenerierter Primer hatte eine Nucleotidsequenz, die die 7 aminoterminalen Aminosäurereste der reifen leichten Kette des Antikörpers codiert.
Ein als B1797 bezeichneter, nicht degenerierter Oligonucleotidprimer mit einer Nucleotidsequenz, die einem Segment im 3'- untranslatierten Bereich der DNA entsprach, die die schwere Kette des Antikörpers codiert [Bruggemann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6075 (1986)], wurde ebenfalls entworfen, sowie auch ein als B1868 bezeichneter, nicht degenerierter Oligonucleotidprimer mit einer Nucleotidsequenz, die einem Segment im K-konstanten Bereich der DNA entsprach, die die leichte Kette des Antikörpers codiert [Sheppard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7064 (1981)].
Weitere nicht degenerierte Primer wurden für die Verwendung bei der Isolierung von cDNA, die die variablen Bereiche der schweren und der leichten Kette des Antikörpers 25D2 codiert, auf der Grundlage von Nucleotidsequenzinformationen entworfen, die nach der PCR-Amplifikation von cDNA, die die vollständige schwere und leichte Kette codiert, erhalten wurde.

Oligonucleotid-Synthese

Oligonucleotidprimer mit im Sequenzlisting definierten Sequenzen wurden nach Standardverfahren unter Verwendung eines Synthesizers des Typs Applied Biosystem Model 380B synthetisiert.
Die Bezeichnungen dieser Primer, denen in Klammern die entsprechenden Sequenzidentifikationsnummern folgen, sind wie folgt:
B1797 (SEQ ID NO: 5)
B1798 (SEQ ID NO: 6)
B1868 (SEQ ID NO: 7)
B1873 (SEQ ID NO: 8)
B1884 (SEQ ID NO: 9)
B1902 (SEQ ID NO: 10)
B1921 (SEQ ID NO: 11)
B1922 (SEQ ID NO: 12)
B1932 (SEQ ID NO: 13)
T3 (SEQ ID NO: 14)
T7 (SEQ ID NO: 15)
Die Primer B1798 und B1873 wurden so entworfen, daß sie eine 5'-NotI-Restriktionsstelle definieren, um das Klonieren zu erleichtern. Die Primer B1797 und B1868 wurden aus dem gleichen Grund so entworfen, daß sie eine 3'-SpeI-Restriktionsstelle definieren.

RNA-Isolierung

Gesamt-Cytoplasma-RNA wurde aus der Hybridomzellinie MP4.25D2.11 isoliert, indem man die Zellen 15 Minuten in einem Lysepuffer inkubierte, der aus 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl&sub2; und 0,5% Nonidet P40 (einem Octylphenol- Ethylenoxid-Kondensat, das im Mittel 9 mol Ethylenoxid pro Mol Phenol enthält) bestand. Nach einem Zentrifugationsschritt mit 2000 · g während 5 Minuten bei 4ºC wurde das Zellkernsediment verworfen, und die überstehende Flüssigkeit wurde mit 10 000 · g während 15 Minuten bei 4ºC erneut zentrifugiert.
Nach dem zweiten Zentrifugationsschritt wurde die überstehende Flüssigkeit mit dem gleichen Volumen einer Lösung gemischt, die 200 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 20 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt. Das Gemisch wurde einmal mit dem gleichen Volumen Trisgepuffertem Phenol/Chloroform (1 : 1) und einmal mit Chloroform extrahiert. Nach den Extraktionen wurde das Gemisch über Nacht mit 1/20 Volumen 0,2 M Natriumacetat, pH 5,5, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol von -20ºC gefällt.

Synthese des ersten Stranges

cDNA des ersten Stranges wurde bei 37ºC während 90 Minuten in einem Reaktionsvolumen von 10 ul direkt aus Gesamt-Cytoplasma- RNA synthetisiert. Das Reaktionsgemisch enthielt 5,6 ul RNA in mit Diethylpyrocarbonat behandeltem destillierten H&sub2;O, 0,25 ul RNAsin (40000 Einheiten/ml), 2 ul 5X-Reverse-Transcriptase- Reaktionspuffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 200 mM KCl, 30 mM MgCl&sub2;, 3 mM Dithiothreit),0,25 ul Rinderserumalbumin (4 mg/ml), 1 ul 10 mM dNTP-Gemisch (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0,4 ul Oligo-dt-Primer (0,5 mg/ml) und 0,5 ul der Reversen Transcriptase Superscript RNase H&supmin; (200 Einheiten/ml).

Polymerase-Kettenreaktion

PCR-Amplifikationen wurden unter Verwendung eines programmierbaren Techne-Thermocyclusgeräts durchgeführt. Die PCR-Reaktionsgemische bestanden aus 10 ul Reaktionsgemisch der cDNA des ersten Stranges, 53,5 ml destilliertem H&sub2;O, 10 ul 10X-Taq- Polymerase-Reaktionspuffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl&sub2;, 0,1% Gelatine), 16 ul 1,25 mM dNTP-Gemisch (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 5 ul von jedem interessierenden Primer (20 umol/ul) und 0,5 ul Thermus-aquaticus-DNA-Polymerase.
Die PCR-Bedingungen beinhalteten 30 der folgenden Cyclen: Denaturierung bei 95ºC während 2 Minuten, Primerassoziation bei 37ºC während 2 Minuten, Primerverlängerung bei 72ºC während 3 Minuten und eine letzte Verlängerungszeit von 9 Minuten bei 72ºC. Am Ende der Amplifikation wurden 1 ul 100 mM dNTP-Gemisch und 1 ul Klenow-Fragment der DNA-Polymerase (5 Einheiten/ul) zu jeder der PCR-Reaktionen gegeben, und man ließ den Auffüllschritt 10 Minuten lang bei Raumtemperatur fortschreiten.
Die PCR-Gemische wurden einer Elektrophorese in Gelen mit 1% Agarose/Tris-Borat, die 0,5 ug/ml Ethidiumbromid enthielten, durchgeführt. Die interessierenden PCR-Fragmente wurden aus den Gelen herausgeschnitten und durch elektrische Elution gereinigt.

Subklonierung und DNA-Sequenzierung

Die gelgereinigten PCR-Fragmente wurden mit NotI und SpeI gespalten und dann in einem Gemisch, das 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit, 50 ug/ml Rinderserumalbumin, 1 mM ATP und 10 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt, 16-24 Stunden bei 15ºC mit einem dephosphorylierten NotI/SpeIgespaltenen Bluescript-Plasmidvektor ligasiert. Zellen des kompetenten E.-coli-Stamms DH5-α (Max Efficiency) wurden mit dem Ligasierungsgemisch transformiert.
Eine diagnostische Analyse der resultierenden Transformanten wurde durch Restriktionsabbau mit NotI und SpeI sowie durch PCR mit den bei den anfänglichen PCR-Reaktionen verwendeten Oligonucleotidprimern durchgeführt. Die Einschübe der interessierenden Subklone wurden einer DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Sequenase-Systems unterzogen.
Die Oligonucleotidprimer T7, B1884, B1921 und B1922 wurden verwendet, um DNA zu erhalten, die den variablen Bereich der schweren Kette codiert. Die Primer T3, B1902 und B1932 wurden verwendet, um DNA zu erhalten, die den variablen Bereich der leichten Kette codiert.

CDR-Bestimmungen

Die CDRs innerhalb der variablen Bereiche der schweren und der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers 25D2 wurden sowohl nach dem Verfahren von Kabat et al. [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Aufl., 1987, U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health], als auch durch Computer-Bindungsstellenschleifenanalyse bestimmt. Für die letztere Analyse wurde ein Computer des Typs Silicon Graphics Personal Iris Model 4D/25 unter Verwendung von Sybyl- oder IMPACT-Software eingesetzt. Die gewählte Vorgehensweise beinhaltete im wesentlichen eine Kombination der dreidimensionalen Modellierungsverfahren von Seville et al. [Biochemistry 27: 8344 (1988)], der Konformationsanalyseverfahren für hypervariable Bereiche von Immunglobulinen nach Chothia et al. [J. Mol. Biol. 196: 901 (1987); Nature 342: 877 (1989)] und der Proteinschleifen-Konformationsanalyseverfahren von Tramontano et al. [PROTEINS: Structure, Function and Genetics 6: 382 (1989)].

Beispiel II. Antikörper-Humanisierung

Allgemeine Verfahren und Reagentien

Restriktionsenzyme und DNA-modifizierende Enzyme stammten von New England Biolabs. Taq-Polymerase wurde von Perkin-Elmer Cetus, Inc., erhalten. Maus-Anti-Human-IgG4-Fc-Antikörper wurde von CalBiochem bezogen. Schaf-Anti-Human-IgG-(H+L)/ Peroxidase-Konjugat und Human-IgG4-Proteinstandards wurden von The Binding Site, Inc., erhalten. Ziegen-Anti-Ratten-IgG wurde von Jackson Immuno-Research Labs bezogen.
Gereinigtes Human-IL-4 (hIL-4) wurde von einem bakteriellen Expressionssystem, wie es im wesentlichen von Lundell et al. [J. Indust. Microbiol. 5: 215 (1990)] beschrieben wird, erhalten und nach dem IODOGENº-Verfahren (Pierce Chemical Co.) gemäß den Anweisungen des Herstellers radioiodiert. Ein als 25D2 bezeichneter gereinigter monoklonaler Ratten-Antikörper wurde von DeKruyffet al. beschrieben [J. Exp. Med. 170: 1477 (1989)].
Human-Wachstumshormon-(hGH)-Standards und ein Ziegen-Anti- Kaninchen-IgG/Peroxidase-Konjugat wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals, Inc., bezogen. Kaninchen-Anti-hGH stammte von Dako Corp., und Schaf-Anti-hGH wurde von Biodesign International erhalten. Protein-G-SEPHAROSE®-CL-4B wurde von Pharmacia, Inc., bezogen. Oligonucleotide wurden unter Verwendung eines DNA-Synthesizers des Typs Applied Biosystems (ABI) 380B synthetisiert.

Bakterienstämme, Plasmide. Zellinien und DNA-Rekombinationsverfahren

Alle Plasmide wurden im E.-coli-K-12-Stamm MM294 (ATCC 33625) vermehrt. Die Plasmide Bluescript (KS) und Bluescribe wurden von Stratagene Inc. erhalten. Die Plasmide pDSRS (ATCC 68232) und pSRS (ATCC 68234) sind bei der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich. Das Plasmid HuCK, das den Human- K-konstanten-Bereich codiert, und das Plasmid p24BRH, das den Human-IgG4-konstanten-Bereich codiert, wurden von der ATCC erhalten (unter den Zugriffsnummern ATCC 59173 bzw. ATCC 57413). Die Plasmidvektoren pUC19 und pSV. Sport stammten von BRL/GIBCO (Gaithersburg, MD).
Von der ATCC erhaltene COS-7-Zellen (ATCC CRL 1651) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/Hochglucose, das mit 10% FBS und 6 mM Glutamin ergänzt war, vermehrt. Die CHO- Zellinie DXB11 wurde von Dr. L. Chasin (Columbia University, New York, NY) erhalten und vor der Transfektion in Hams F12- Medium vermehrt, das mit 10% FBS, 16 mM Glutamin, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 0,1 mM Hypoxanthin und 0,016 mM Thymidin ergänzt war. Transfizierte CHO-Zellen wurden zur Selektion in DMEM/Hochglucose vermehrt, das mit 10% dialysiertem FBS, 18 mM Glutamin und 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren ergänzt war.
Eine Jijoye-Zellinie, die stabil mit einem rekombinanten Vektor transformiert war, der ein Human-Wachstumshormon- Reporter-Gen umfaßte, das operabel mit einem Human-Keimlinien&epsi;-Transcript-Promotor verknüpft war (C12-Zellen genannt), und eine Jijoye-Zellinie, die große Mengen des Human-IL-4-Rezeptors auf der Zelloberfläche exprimierte (CJ-Zellen genannt) wurden von Dr. Chung-Her Jenh von der Schering-Plough Corporation erhalten. Beide Zellinien wurden in RPMI (Gibco) vermehrt, das 15% Pferdeserum, 5% FBS, 6 mM Glutamin, 0,1 mM nichtessentielle Aminosäuren und 0,5 mg/ml Geneticin (Gibco) enthielt. Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden DNA- Rekombinationsverfahren so durchgeführt, wie es von Maniatis et al., loc. cit., beschrieben wird.
PCR wurde unter Standardbedingungen durchgeführt [Saiki et al., Science 230: 1350 (1985)], und die Sequenzen von durch PCR erzeugten Fragmenten wurden entweder durch manuelle oder durch automatische DNA-Sequenzierung bestätigt. Die manuelle DNA-Sequenzierung wurde mit SEQUENASE® (United States Biochemical Co.) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die automatische DNA-Sequenzierung wurde mit einem ABI-373A- DNA-Sequencer unter Verwendung des von ABI gelieferten Taq- Polymerase-Cyclus-Sequenzierungs-Kits gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Plasmid-DNA wurde für Transfektionen unter Verwendung von Qiagen-Säulen (Qiagen, Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet.

Bestimmung von Antikörperkonzentrationen durch ELISA (enzymelinked immunosorbent assav)

Antikörperkonzentrationen wurden durch einen IgG4-spezifischen ELISA bestimmt. In Kürze: Nung-MAXISORB®-Immunoplates wurden bei 4ºC wenigstens 4 Stunden mit einem monoklonalen Maus-Anti- Human-IgG4-Fc-Antikörper in einer Konzentration von 5 ug/ml in 50 mM Hydrogencarbonatpuffer, pH 9,5, beschichtet. Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer [3% Rinderserumalbumin (BSA) in Dulbeccos modifizierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; Gibco-BRL)] blockiert. Nach dem Waschen der Platten mit Waschpuffer (10 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 0,05% Tween-20) wurden Proben einer Verdünnungsreihe entweder als gereinigte Antikörper oder als konditioniertes Medium in einem Volumen von 100 ul auf die Näpfe der Platten aufgetragen.
Konditioniertes Medium, das die humanisierten Antikörper enthielt, wurde vor dem Assay typischerweise durch Zentrifugationsfiltration (Amicon, Inc.) auf das 10- bis 30fache konzentriert. Die Platten wurden 1-2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, und danach wurden die Proben abgesaugt, und die Näpfe wurden 3mal gewaschen. In jeden Napf wurden 50 ul Anti- Human-IgG-(H+L)/Peroxidase-Konjugat gegeben, und die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Platten 3mal gewaschen, und 50 ul ABTS-Peroxidase-Substrat (Boehringer Mannheim Biochemicals) wurden in jeden Napf gegeben, um die Immunkomplexe nachzuweisen. Die Platten wurden spektrophotometrisch bei 405 nm abgelesen.

Transfektionen

Für jeden der unten beschriebenen rekombinanten Antikörper wurden j eweils 5 ug der Plasmide für die schwere und für die leichte Kette in einem Gesamtvolumen von 250 ul durch Elektroporation unter Verwendung eines Biorad Gene Pulser in 5 · 10&sup6; COS-7-Zellen transfiziert. Nach 4 Stunden wurde das Medium (DMEM plus 10% FBS) durch DMEM minus Serum ersetzt. Die Zellen wurden 72 Stunden lang vermehrt, und danach wurde das Medium entnommen, durch Zentrifugation geklärt und für die anschliessende Antikörperreinigung bei -20ºC aufbewahrt. Um größere Mengen der humanisierten Antikörper zu erhalten, wurden rekombinante CHO-Zellinien ermittelt, die als h25D2-1 bzw. h25D2-4 bezeichnete Antikörper erzeugten.
Um stabile CHO-Zellinien zu isolieren, wurden 20 ug der geeigneten DNAs der Plasmide für die schwere und für die leichte Kette [Stoffmengenverhältnis von Plasmid für die schwere Kette zu Plasmid für die leichte Kette (mit dem dhfr-Gen) = 10: 1] nach dem Calciumphosphat-Fällungsverfahren [Graham et al., Virology 52: 456 (1973)] in 5 · 10&sup6; CHO-DXB11-Zellen transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen anhand der Resistenz gegen Hypoxanthin- und Thymidinmangel, d. h. dhfr-Expression, selektiert [Schimke et al., Methods in Enzymology 151: 85 (1987)].
Klone, die Antikörper sezernierten, wurden durch ELISA identifiziert, expandiert und einer Methotrexat-vermittelten Gen- Amplifikation unterzogen. Klone, die die größte Menge Antikörper sezernierten, wurden in Rollflaschen expandiert, und das serumfreie Medium wurde kontinuierlich entnommen. Konfluente Rollflaschenkulturen wurden 48 Stunden in serumhaltigem Medium vermehrt, und dann wurden die Zellen mit Dulbeccos modifiziertem PBS abgespült, und das Medium wurde durch ein serumfreies Präparat ersetzt. Das serumfreie Medium wurde nach 3-4 Tagen für die anschließende Antikörperreinigung entnommen.

Antikörperreinigung

Serumfreies konditioniertes Medium, das die Antikörper enthielt, wurde durch eine Mab-TRAP®-Säule mit Streptokokken- Protein-G-SEPHAROSE®-CL-4B (Pharmacia) geleitet, und die Antikörper wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers eluiert. Die endgültigen Antikörperkonzentrationen wurden durch ELISA bestimmt, wie es oben beschrieben ist.

Affinitätsmessungen

A. Affinitätskonstanten

Um zu bestimmen, ob die humanisierten Antikörper in der Lage waren, Human-IL-4 zu binden, wurden scheinbare Dissoziationskonstanten bestimmt, indem man Immunplatten mit Maus-Anti- Human-IgG4-Fc (Abfang-Antikörper) beschichtete und die Platten blockierte, wie es oben für den ELISA-Assay beschrieben ist. Nach dem Waschen der Näpfe wurden die Platten 2 Stunden bei Raumtemperatur mit konzentriertem konditionierten Medium inkubiert, das einen der humanisierten Antikörper enthielt (100 ul/Napf). Wildtyp-Ratten-Antikörper 25D2 wurde zum Vergleich parallel getestet, wobei man ein Anti-Ratten-IgG als Abfang-Antikörper verwendete.
Die Näpfe wurden gewaschen und mit ¹²&sup5;I-hIL-4 in Konzentrationen zwischen 4000 und 2 pM in Endvolumina von 100 ul inkubiert. Alle Assays wurden dreifach durchgeführt, und die Hintergrundbindung wurde bestimmt, indem man einen 1000fachen molaren Überschuß von unmarkiertem hIL-4 in Kontrollnäpfen verwendete. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Näpfe gewaschen, das Protein wurde in 75 ul Solubilisierungspuffer [0,1 N NaOH/l% Natriumdodecylsulfat (SDS)] solubilisiert, und die Lösung wurde in einem LKB-Gammazähler vermessen. Die Konzentrationen an gebundenem und freiem hIL-4 wurden bestimmt, und die Affinitäten der Antikörper wurden durch Scatchard-Plotanalyse bestimmt [Berzofsky et al., in Fundamental Immunology, 1984, Paul, E. E., Hrsg., Raven Press, New York, NY, S. 595-644].

8. Kompetitive Bindungsanalyse

Ein Vergleich zwischen der Antigenbindung durch Wildtyp- Ratten-Antikörper 25D2 und den humanisierten Antikörpern wurde vorgenommen, wobei ein kompetitiver Platten-Bindungsassay verwendet wurde, bei dem die Bindung von markiertem Human-IL-4 (¹²&sup5;IhIL-4) an mit Antikörper 25D2 beschichtete Platten in Gegenwart von unmarkiertem Antikörper 25D2, humanisiertem Antikörper h25D2-1 oder humanisiertem Antikörper h25D2-4, die alle gereinigt worden waren, gemessen wurde.
Immunosorb-Platten wurden wenigstens 16 Stunden bei 4ºC mit einer 60-ng/ml-Lösung des mit PBS verdünnten Ratten-25D2- Antikörpers beschichtet (100 ul/Napf). Dann wurden die Näpfe 4 Stunden bei Raumtemperatur mit Blockierungspuffer (3% BSA in PBS) blockiert. In jeden Napf wurden 50 ul konkurrierende Antikörper einer Verdünnungsreihe mit zweifacher Verdünnung plus die geeignete Menge ¹²&sup5;I-hIL-4 gegeben (50 ul Gesamtvolumen), und die Platten wurden 16-24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden 3mal mit Kaliumphosphat, pH 7,4, plus 0,05% Tween 20 gewaschen. Die Näpfe wurden trockengesaugt, und 75 ul Solubilisierungspuffer (0,1 N NaOH/l% SDS) wurden in jeden Napf gegeben, und es wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde aus jedem Napf entnommen und in einem LKB-Gammazähler vermessen.

Hemmung der Rezeptorbindung

Die humanisierten Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Bindung von radioaktiv markiertem hIL-4 an den auf Jijoye-CJ-Zellen exprimierten rekombinanten Human-IL-4-Rezeptor in Mikrotiterplatten zu hemmen. In Kürze: Von den humanisierten Antikörpern wurde eine Verdünnungsreihe in Zellwachstumsmedium mit Proteinkonzentrationen von 8,6 nM bis 4 pM hergestellt. Ratten-Antikörper 25D2 wurde genauso verdünnt und als positive Kontrolle verwendet. Dann wurden in jeden Napf Jijoye-CJ-Zellen (10&sup5; Zellen) und 44 pM ¹²&sup5;I-hIL-4 gegeben (200 ul Endvolumen pro Napf), und die Platten wurden 2 Stunden bei 4ºC inkubiert.
Nach der Inkubation wurde der Inhalt der Näpfe gemischt, und 185 ul wurden entfernt und auf Sucrosepolster geschichtet (150 ul 5%ige Sucrose in Wachstumsmedium plus 0,02% Natriumazid). Nach der Zentrifugation (1500 U/min. 4ºC, 10 Minuten) wurden die Röhrchen in flüssigem Stickstoff schnellgefroren, und die Böden der Röhrchen, die die Zellsedimente enthielten, wurden abgeschnitten und in einem Gammazähler vermessen. Die gebundene Aktivität (cpm) wurde gegen die Antikörperkonzentration aufgetragen, und die humanisierten Antikörper wurden bei den Konzentrationen, die für eine 50%ige Hemmung der Rezeptorbindung erforderlich waren (ICSO), mit dem nativen Antikörper verglichen.

Keimlinie-&epsi;-Promotor-Reporter-Gen-Assay

Jijoye-C12-Zellen wurden in einer Dichte von 4 · 10&sup5; Zellen/ 125 ul/Napfin Medium in 96-Napf-Platten geimpft. Verdünnungsreihen von Testantikörpern und 1 ng/ml hIL-4 wurden zu den Zellen gegeben, und die Platten wurden etwa 64 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden aus jedem Napf 100 ul des konditionierten Mediums entnommen und in einzelne Näpfe einer Immunplatte gegeben, die zuvor mit einer 1 : 2000- Verdünnung von Schaf-Anti-Human-Wachstumshormon (ahGH) in Natriumcarbonatpuffer, pH 9,5, beschichtet worden war. Die Platten wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und Smal mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer gewaschen, der 0,05% Tween-20 enthielt. In jeden Napf wurden 100 ul eines Kaninchen-Anti- Human-Wachstumshormon-Antiserums (1 : 1000 verdünnt) gegeben, und die Inkubation wurde 1 Stunde lang fortgesetzt.
Die Näpfe wurden wiederum gewaschen, wie es oben beschrieben ist, und in jeden Napf wurden 100 ul eines mit Meerrettich- Peroxidase konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1 : 10000 verdünnt) gegeben. Nach dem Waschen wurden 50 ul ABTS-Peroxidase-Substrat in die Näpfe gegeben, um die Immunkomplexe nachzuweisen. Die Platten wurden spektrophotometrisch bei 405 nm abgelesen.
Die optische Dichte (OD) bei 405 nm wurde gegen die Antikörperkonzentration aufgetragen, und die humanisierten Antikörper wurden bei den Konzentrationen, die für eine 50%ige Hemmung der Expression des Human-Wachstumshormons unter der Kontrolle des Keimliniens-Promotors erforderlich waren (ICSO), mit dem nativen Antikörper verglichen.

Humanisierte Antikörper

Homologie-Modellierung

Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren wurde bestimmt, daß der Antikörper LAY ein optimaler Kandidat für das Human-Gerüst war. Zuerst wurden Paare schwerer und leichter Ketten von LAY verfolgt.
Eine Aufstellung potentieller minimaler und maximaler 25D2- Reste, die in die Gerüstsequenzen eingepfropft werden könnten, wurde nach den oben beschriebenen Verfahren so bestimmt, wie es in Tabelle 1 gezeigt ist. Tabelle 1
a Reste für VH und VL beziehen sich auf die Nummern der Reste in SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2.
b Die maximalen Listen für VH und VL umfassen die entsprechenden minimalen Listen sowie die weiterhin angegebenen Reste.
Spezielle, unten beschriebene Konstrukte enthalten die folgenden Reste aus der obigen Tabelle: Tabelle 2

Aufbau von Expressionsvektoren für die leichte Kette von humanisiertem 25D2

Die Nucleotidsequenz von DNA für eine Anfangsversion der leichten Kette von humanisiertem 25D2 (h25D2L) einschließlich (5'→3') fünfzehn 5'-nichtcodierender Basen und Basen, die einen Methionin-Startrest, eine Leitsequenz und den variablen Bereich des Antikörpers codieren, ist zusammen mit der entsprechenden Aminosäuresequenz des Leitpeptids und des Antikörpers im Sequenzlisting durch SEQ ID NO: 6 definiert.
Beim Aufbau dieser humanisierten leichten Kette wurden stille Restriktions-Endonuclease-Spaltstellen aus dem Programm SILENT MAP® der Genetics Computer Group (GCG; Madison, WI) abgeleitet. Nucleotidsequenzen, die so ausgewählt wurden, daß sie die Proteinsequenz codierten, verwendeten Codons, die man in der Ratten-25D2-Sequenz findet, obwohl mehrere Codons geändert wurden, um Restriktions-Endonuclease-Spaltstellen zu erzeugen.
Der gesamte variable Bereich des Antikörpers wurde als drei zusammenhängende DNA-Fragmente kloniert, die als Paare von Oligonucleotiden synthetisiert wurden. Diese Paare von Oligonucleotiden wurden durch PCR amplifiziert und an einmaligen Restriktions-Endonuclease-Spaltstellen miteinander verbunden. Das Ergebnis waren drei Fragmente (von 5' nach 3' numeriert), die durch EcoRI/KpnI- (Fragment 1), KpnI/PstI- (Fragment 2) und PstI/MscI-Stellen (Fragment 3) genauer beschrieben werden. Bei den Amplifikationsreaktionen waren die beiden Oligonucleotide in jedem Paar über eine Strecke von 18-24 Nucleotiden komplementär zueinander. Daher diente jedes Oligonucleotid als Matrize für das andere.
Die Bezeichnungen dieser Oligonucleotidprimer, denen in Klammern die entsprechenden Sequenzidentifikationsnummern folgen, sind wie folgt:
2481 (SEQ ID NO: 17)
2482 (SEQ ID NO: 18)
2700 (SEQ ID NO: 19)
2641 (SEQ ID NO: 20)
2483 (SEQ ID NO: 21)
2491 (SEQ ID NO: 22)
2662 (SEQ ID NO: 23)
2661 (SEQ ID NO: 24)
Die Synthese von Fragment 1 erforderte zwei PCR-Amplifikationen. Eine erste PCR unter Verwendung der Primer 2481 und 2482 erzeugte ein Fragment, dem eine Translationsstartsequenz und die das Leitpeptid codierende Sequenz fehlen. Dieses Fragment wurde mit den Primern 2700 und 2641 erneut amplifiziert, so daß eine EcoRI-Stelle und anschließend die Translationsstart- und die das Leitpeptid codierende Sequenz hinzugefügt wurden. Das endgültige Fragment 1 enthielt also an seinem 5'-Terminus eine EcoRI-Stelle und danach eine Translationsstartsequenz [Kozak, Nucleic Acids Res. 12: 857 (1984)] und eine Sequenz, die ein Leitpeptid codiert, das den Anti-CAMPATH-1-Antikörpern entspricht [Reichmann et al., Nature 332: 323 (1988)].
Die Sequenz des Fragments 1 erstreckte sich über eine KpnI- Stelle hinweg und codierte die Aminosäurereste 1-36 des variablen Bereichs der humanisierten leichten Kette. Fragment 2 codierte die Reste 36-79 der humanisierten leichten Kette einschließlich einer KpnI- und PstI-Stelle am 5'- bzw. 3'- Terminus. Die Fragmente 1 und 2 wurden an der einmaligen KpnI- Stelle miteinander verbunden und zwischen der EcoRI- und der PstI-Stelle in den Vektor Bluescript (KS) subkloniert, so daß man das Fragment 1-2 erhielt. Fragment 3 codierte die übrigen Aminosäuren der variablen Domäne (Reste 78-106) und erstreckte sich von der PstI-Stelle über eine MscI-Stelle hinweg (die sich 22 Basen stromaufwärts des 3'-Terminus der variablen Domäne befand) und beinhaltete eine EcoRI-Stelle am 3'-Ende.
Fragment 3 wurde zwischen der PstI- und der EcoRI-Stelle in einen Vektor Bluescript (KS) subkloniert. Ein 321-bp-Fragment (Fragment 4), das 22 Nucleotide am 3'-Ende des humanisierten variablen Bereichs einschließlich der MscI-Stelle enthielt, hinzugefügt zur codierenden Sequenz für den gesamten Human-xkonstanten Bereich, wurde durch PCR erzeugt, wobei das HuCK- Plasmid als Matrize und die Primer 2856 und 2857, deren Sequenzen durch SEQ ID NO: 25 bzw. SEQ ID NO: 26 definiert sind, verwendet wurden. Außer der MscI-Stelle am 5'-Ende von Fragment 4 wurde am 3'-Ende noch eine EcoRI-Stelle aufgenommen, um das Klonieren zu erleichtern.
Fragment 4 wurde zwischen der gemeinsamen MscI-Stelle innerhalb des variablen Bereichs und der am 3'-Ende von Fragment 4 und dem Vektor vorhandenen EcoRI-Stelle mit Fragment 3 verbun den. Eine EcoRV-Stelle befand sich in dem Vektor stromabwärts von Fragment 3-4. Fragment 3-4 wurde als PstI/EcoRV-Fragment entfernt und zwischen der gemeinsamen PstI-Stelle im variablen Bereich und der SmaI-Stelle mit glatten Enden im Vektor an Fragment 1-2 ligasiert. Der gesamte codierende Bereich für die leichte Kette h25D2L konnte nach Spaltung an der Sall- und der BamHI-Stelle erhalten werden, die den codierenden Bereich im Bluescript-Vektor flankieren.
Der Säuger-Expressionsvektor wurde aufgebaut, indem man zuerst den Bluescript-Vektor, der die h25D2L-Sequenz enthielt, am 3'- Ende mit BamHI spaltete und dann das Spaltungsprodukt mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase unter Bedingungen behandelt, bei denen glatte Enden zurückbleiben. Dann wurde das h25D2L-DNA-Fragment nach Spaltung am 5'-Ende mit Sall erhalten. Schließlich wurde der h25D2L-codierende Bereich an den Vektor pDSRS ligasiert, der zuvor mit SalI und SmaI gespalten worden war. Der als pSDh25L bezeichnete fertige Vektor enthielt den gesamten codierenden Bereich für den humanisierten 25D2-Antikörper einschließlich des Signalpeptids und des Human-κ-konstanten Bereichs.
Eine Cotransfektion der obigen h25D2L-DNA mit einer DNA der schweren Kette (als h25D2H-1 bezeichnet; hergestellt wie unten beschrieben) in COS-7-Zellen ergab keine meßbare Antikörperexpression, obwohl man eine Antikörperexpression beobachtete, wenn die h25D2L-DNA mit DNA für eine humanisierte schwere Kette von einem nicht verwandten Antikörper (Daten nicht gezeigt) cotransfiziert wurde.
Da die leichte Kette h25D2L zusammen mit einer nicht verwandten schweren Kette exprimiert werden konnte, war es möglich, daß die Sequenz entweder der humanisierten leichten Kette von 25D2 oder der humanisierten schweren Kette die h25D2-Antikörper-Expression hemmte.
Eine Untersuchung der Fv-Grenzfläche des 25D2-Molekülmodells ließ vermuten, daß ein Ersatz der Human-LAY-Reste Leucin 46 und Tyrosin 49 durch die Tier-Reste Phenylalanin 46 und Phenylalanin 49 die Fähigkeit von h25D2L zur Kombination mit der schweren Kette beeinflussen könnte. Außerdem zeigte ein Vergleich von Sequenzen des variablen Bereichs der Human-κ- Kette in der Proteindatenbank Swiss-Prot (Bairoch, Amos) und der Untergruppe I der leichten Kette von Human-κ gemäß Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, loc. cit., daß das Leucin auf der Aminosäureposition 46 und das Tyrosin auf der Aminosäureposition 49 in hohem Maße konserviert sind. Daher wurde das obige Gen für die humanisierte leichte Kette neu aufgebaut, so daß an diesen Stellen Mutationen eingeführt wurden. Außerdem wurde ein Argininrest auf Position 107, der bei der h25D2L-DNA weggelassen worden war, wieder eingesetzt.
Zum Modifizieren der h25D2L-DNA wurden zwei Paare von Oligonucleotidprimern synthetisiert, um eine auf PCR beruhende Mutagenese des h25D2L-codierenden Bereichs durchzuführen. Primer 3016 (SEQ ID NO: 28), der als 5'-Primer verwendet wurde, umfaßte den codierenden Bereich für die Aminosäurereste 38-51 der variablen Domäne der leichten Kette und beinhaltete eine Stul-Stelle am 5'-Ende. Primer 3016 baute außerdem drei Nucleotidänderungen in die h25D2L-Sequenz ein. Dies führte zu einem Ersatz eines Phenylalaninrestes durch einen Leucinrest auf Position 46 der Aminosäuresequenz (F46L) und zu einem Ersatz eines Phenylalaninrestes auf Position 49 durch ein Tyrosin-Codon (F49Y). Ein als 3017 (SEQ ID NO: 29) bezeichneter 3'-Primer umfaßte die PstI-Stelle auf Position 237.
Ein 126-bp-Fragment wurde durch PCR erzeugt, wobei die Oligonucleotidprimer 3016 und 3017 sowie das h25D2L-Bluescript- Plasmid als Matrizen-DNA verwendet wurden. Das StuI/PstI-PCR- Fragment wurde verwendet, um das entsprechende Fragment im Vektor h25D2L zu ersetzen und dadurch die Änderungen F46L und F49Y einzubauen.
Ein als 3018 bezeichneter Oligonucleotidprimer (als 5'-Primer verwendet; SEQ ID NO: 30) wurde synthetisiert, der die Aminosäurereste 95-106 des variablen Bereichs der leichten Kette einschließlich der MscI-Stelle am 5'-Terminus und der ersten drei Reste des Human-xkonstanten Bereichs umfaßte. Außerdem wurde ein Codon für Arginin (R107) an der Verbindungsstelle zwischen dem variablen und dem konstanten Bereich in dem Primer eingesetzt. Ein weiterer, als 3019 bezeichneter Primer (SEQ ID NO: 31) wurde synthetisiert, um als 3'-Primer zu dienen. Dieser Primer entsprach Sequenzen im Bluescript-Vektor einschließlich der BamHI- und der SpeI-Stelle.
Unter Verwendung der Primer 3018 und 3019 und des h25D2L- Bluescript-Plasmids als Matrize wurde durch PCR ein Fragment erzeugt, das die Reste 95-107 der variablen Domäne und den gesamten codierenden Bereich der Human-K-Kette beinhaltete. Dieses MscI/SpeI-PCR-Fragment wurde verwendet, um das entsprechende Fragment in dem oben beschriebenen F46L, F49Y-Vektor zu ersetzen. Nach der Bestätigung der DNA-Sequenz der PCR- Fragmente wurde der Vektor mit SpeI gespalten und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase unter Bedingungen behandelt, bei denen glatte Enden entstehen. Ein Fragment, das den gesamten codierenden Bereich der leichten Kette h25D2L-1 des humanisierten Antikörpers enthielt, wurde nach Spaltung mit SalI isoliert und mit dem Vektor pDSRS ligasiert, der zuvor mit Sall und SmaI gespalten worden war. Der resultierende h25D2L-1-Expressionsvektor, der die Mutationen F46L, F49Y und 8107 von h25D2L enthält, wurde als pKM20 bezeichnet.
Die Nucleotidsequenz der DNA für die modifizierte Version der leichten Kette von humanisiertem 25D2 einschließlich (5'→3') fünfzehn 5'-nichtcodierender Basen und Basen, die einen Methionin-Startrest, eine Leitsequenz und den variablen Bereich des Antikörpers codieren, ist zusammen mit der entsprechenden Aminosäuresequenz des Leitpeptids und des Antikörpers im Sequenzlisting durch SEQ ID NO: 27 definiert.

Aufbau von Expressionsvektoren für die schwere Kette von humanisiertem 25D2

Die Nucleotidsequenz von DNA für eine Anfangsversion der schweren Kette von humanisiertem 25D2 (h25D2H-1) einschließlich (5'→3') fünfzehn 5'-nichtcodierender Basen und Basen, die einen Methionin-Startrest, eine Leitsequenz und den variablen Bereich des Antikörpers codieren, ist zusammen mit der entsprechenden Aminosäuresequenz des Leitpeptids und des Antikörpers im Sequenzlisting durch SEQ ID NO: 32 definiert. Die Nucleotidsequenzen, die so ausgewählt wurden, daß sie die Proteinsequenz einschließlich des Signalpeptids codierten, verwendeten Codons, die man in der Ratten-25D2-Sequenz findet. Mehrere Codons wurden geändert, um Restriktions-Endonuclease- Spaltstellen zu erzeugen.
Der gesamte variable Bereich wurde als drei zusammenhängende DNA-Fragmente kloniert, die als Paare von Oligonucleotiden synthetisiert wurden. Diese Paare von Oligonucleotiden wurden durch PCR amplifiziert und an einmaligen Restriktions-Endonuclease-Spaltstellen miteinander verbunden. Das Ergebnis waren drei Fragmente (von 5' nach 3' numeriert), die durch SalI/SmaI- (Fragment 1), SmaI/PstI- (Fragment 2) und PstI/ Apal-Stellen (Fragment 3) genauer beschrieben werden. Bei den Amplifikationsreaktionen waren die beiden Oligonucleotide in jedem Paar über eine Strecke von 18-24 Nucleotiden komplementär zueinander. Daher diente jedes Oligonucleotid als Matrize für das andere.
Die Bezeichnungen dieser Oligonucleotidprimer und die entsprechenden SEQ-ID-Nummern, die ihre Sequenzen definieren, sind wie folgt:
Die Synthese von Fragment 1 erforderte zwei Amplifikationsreaktionen. Ein erstes PCR-Produkt der Primer 2588 und 2599 wurde einer zweiten Amplifikationsrunde mit den Oligonucleotiden 2232 und 2445 unterzogen, was Fragment 1 ergab. Das endgültige Fragment 1 enthielt also an seinem 5'-Terminus eine Sall-Stelle und danach eine Translationsstartsequenz (Kozak, loc. cit.) und eine Sequenz, die das Leitpeptid codiert, das den Anti-CAMPATH-1-Antikörpern entspricht (Reichmann et al., loc. cit.). Die Sequenz des Fragments 1 erstreckte sich über eine SmaI-Stelle hinweg und beinhaltete die codierende Sequenz für die Aminosäurereste 1-42 des variablen Bereichs der humanisierten schweren Kette.
Fragment 2 codierte die Reste 42-82 der humanisierten schweren Kette einschließlich einer SmaI-Stelle und einer PstI-Stelle am 5'- bzw. 3'-Ende. Die Fragmente 1 und 2 wurden an der einmaligen SmaI-Stelle miteinander verbunden und zwischen der SaII- und der PstI-Stelle in den Vektor Bluescript (KS) subkloniert, so daß man das Plasmid pBS1-2 erhielt.
Fragment 3 codierte die übrigen Aminosäuren der variablen Domäne (Reste 81-121) und erstreckte sich von der PstI-Stelle über den 3'-Terminus des variablen Bereichs und weiter über 30 Nucleotide der codierenden Sequenz für den konstanten Bereich von Human-IgG4. Eine einmalige Apal-Stelle befand sich inner halb von sechzehn Nucleotiden von der IgG4-konstanten Sequenz in Fragment 3. Die Synthese von Fragment 3 erforderte ebenfalls zwei Amplifikationsreaktionen. Ein erstes PCR-Produkt der Primer 2523 und 2580 wurde einer zweiten Amplifikationsrunde mit den Primern 2642 und 2646 unterzogen, was Fragment 3 ergab.
Zur Herstellung eines ersten Expressionsvektors für die schwere Kette wurde das Plasmid p24BRH mit Apal und SacI gespalten, und ein Apal/SacI-Fragment, das genomische DNA von IgG4 enthielt, wurde isoliert. Fragment 3 wurde an eine gemeinsame Apal-Stelle an dem isolierten Fragment des Plasmids p24BRH ligasiert. Dann wurde ein resultierendes PstI/SacI-Fragment (das die Reste 81-121 des variablen Bereichs von h25D2H-1 umfaßte, die mit IgG4-DNA verknüpft waren, die den vollständigen konstanten Bereich von IgG4 codierte) mit einem Bluescribe-Plasmid ligasiert, das zuvor mit PstI und SacI gespalten worden war, wobei ein als pAS6 bezeichnetes Plasmid entstand.
Dann wurde die genomische DNA des IgG4 durch die cDNA ersetzt. Zuerst wurde ein Plasmid, das die IgG4-cDNA enthielt, die zwischen der Pstl- und der Notl-Stelle des Vektors pSV. Sport eingesetzt war, an der PstI-Stelle des Vektors stromaufwärts der cDNA und an einer BstEII-Stelle innerhalb der IgG4-cDNA gespalten. Dieses Plasmid war wie folgt aufgebaut worden.
Oligonucleotidprimer, die dem gesamten variablen Bereich der schweren Kette (VH) eines nicht verwandten humanisierten Antikörpers entsprachen, wurden nach Standardverfahren synthetisiert. Die Bezeichnungen dieser Oligonucleotide und die entsprechenden SEQ-ID-Nummern, die ihre Sequenzen definieren, waren wie folgt:
Paare von Nucleotiden, B2474CC und B2419CC, B2420CC und B2475CC bzw. B2477CC und B2479CC, wurden in der Hitze denaturiert, reassoziiert und mit Taq-Polymerase oder Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) inkubiert. Bei den Polymerase- Kettenreaktionen (PCRs) waren die beiden Oligonucleotide in jedem Paar über etwa 24 bis 30 Nucleotide komplementär zueinander. Daher diente jedes Oligonucleotid als Matrize für das andere.
Die PCRs wurden über 18 Cyclen durchgeführt, und danach wurden die drei resultierenden DNA-Fragmente, die den drei aufeinanderfolgenden Segmenten von VH entsprachen und als VH1, VH2 und VH3 bezeichnet wurden, einer Elektrophorese in einem Agarose- Gel unterzogen und durch elektrische Elution gereinigt.
Die Reihenfolge der drei VH-DNA-Fragmente, die Restriktionsstellen für die Klonierung und die Multiklonierungsstellen- Karte für den verwendeten Klonierungsvektor, pSV. Sport, waren wie folgt:
Fragment Restriktionsstellen PCR-Primer
VH&sub1; EcoRI______________ Spel B2474CC + B2419CC
VH&sub2; SpeI________________ XbaI B2420CC + B2475CC
VH&sub3; EcoRI/XbaI___________ SalIlApaI/SstI B2477CC + B2479CC

Multiklonierungsstellen von pSV. Sport

PstI/KpnI/RsrII/EcoRI/SmaI/SalI/SstI/SpeI/NotI/Xbal/BamHI/HindIII/SnaBI/MluI
Fragment VH1 wurde mit den Enzymen EcoRI und SpeI gespalten und in den Vektor pSV. Sport einkloniert. Anschließend wurde Fragment VH2 in pSV. Sport durch gerichtete Insertion an der SpeI- und der XbaI-Stelle mit VH1 verknüpft. Fragment VH3 wurde als EcoRI/XbaI-SalI/ApaI/SstI-Fragment getrennt in pSV. Sport einkloniert. Die drei Fragmente wurden durch DNA- Sequenzierung bestätigt.
Die volle Länge der VH-cDNA des nicht verwandten Antikörpers wurde zusammengesetzt, indem man zuerst VH&sub3; mit einer genomischen DNA des konstanten Bereichs der γ4-H-Kette (CH) verknüpfte und dann das VH3-CH-Fragment an dem VH1-VH2-Fragment befestigte, wie unten ausführlicher beschrieben wird.
Um die Synthese und Sekretion der schweren Kette zu erleichtern, wurde eine codierende Sequenz für ein Leitpeptid in die DNA eingesetzt. Die Aminosäure- und die Nucleotidsequenz dieses Leitpeptids sind diejenigen des Leitpeptids der Anti- CAMPATH-1-Antikörper (Reichmann et al., loc. cit.).
Um DNA aufzubauen, die die volle Länge einer H-Kette des Antikörpers codiert, wurde die synthetische VH-cDNA mit genomischer DNA des konstanten Bereichs von Human-γ4 (ATCC 57413) kombiniert, wobei ApaI-Restriktionsspaltung und Ligasierung verwendet wurden. Dieses Verfahren wurde eingeleitet, indem man das Plasmid pSV. Sport, das VH3 enthielt, mit NotI spaltete und anschließend mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) behandelte, so daß glatte Enden entstanden. Die resultierende DNA wurde mit Ethanol gefällt, resuspendiert und mit Apal gespalten. Diese restriktionsgespaltene Plasmid-DNA wurde mit dem ApaI/SmaI-Restriktionsfragment der genomischen DNA des konstanten Bereichs von γ4 ligasiert.
Dann wurde das Fragment VH3/genomische CH-DNA als XbaI/ HindIIL-Fragment herausgeschnitten und in pSV. Sport, das bereits VH1-VH2 enthielt, eingesetzt, so daß der Aufbau der vollen Länge der DNA der schweren Kette vollendet wurde.
Bei anschließenden Manipulationen wurde eine cDNA des konstanten Bereichs von Human-γ4 entworfen und aufgebaut, um die genomische DNA zu ersetzen. Dies wurde unter Verwendung von sechs Oligonucleotid-PCR-Primern erreicht, die nach Standardverfahren synthetisiert wurden. Die Bezeichnungen dieser Oligonucleotide und die entsprechenden SEQ-ID-Nummern, die ihre Sequenzen definieren, waren wie folgt:
Die Primer B2491CC, B2499CC und B2598CC entsprachen dem Plus- Strang der cDNA des konstanten Bereichs von γ4. Die Primer B2498CC, B2597CC und B2656CC entsprachen dem Minus-Strang. Unter Verwendung von genomischer Human-γ4-DNA als Matrize wurden drei aufeinanderfolgende doppelsträngige DNA-Fragmente durch PCR erzeugt, die die gesamte, den konstanten Bereich von γ4 codierende cDNA umfaßten.
Die drei CH-DNA-Segmente, die Restriktionsstellen für die Klonierung und die verwendeten Primer waren wie folgt:

Seqiment Restriktionsstellen PCR-Primer

CH A. SalI___________ EcoRI B2491CC + B2498CC
CH B. EcoRI_____________ XhoI/SalI B2499CC + B2500CC
CH C. SalI/XhoI____________ NotI B2598CC + B2656CC
Segment A wurde als SalI/EcoRI-Restriktionsfragment in pUCl9 einkloniert. Segment C wurde als SalI/XhoI-NotI-Restriktionsfragment in pSV. Sport einkloniert. Segment B wurde als EcoRI- XhoI/SalI-Fragment in pSV. Sport, das bereits Segment C enthielt, einkloniert. Alle drei Segmente wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Die γ4-cDNA wurde zusammengesetzt, indem man Segment A mit PstI und EcoRI herausschnitt und dieses Fragment in pSV. Sport, das bereits die Segmente B und C enthielt, einklonierte. Die Restriktionskarte der Human-γ4-CH-cDNA und ihre relative Position innerhalb der pSV. Sport-Multiklonierungsstellen sind wie folgt:
Die γ4-CH-cDNA wurde als SalI-HindIII-Fragment herausgeschnitten, um das genomische γ4-Fragment in dem zuvor beschriebenen Konstrukt für die volle Länge der H-Kette zu ersetzen. Das Endprodukt war der pSVSPORT-1-Vektor, der wie oben beschrieben gespalten wurde.
Dann wurde das Plasmid pAS6 mit PstI linearisiert und mit BstEII innerhalb der IgG4-Sequenz partiell abgebaut. Ein Fragment, das ein Segment der codierenden Sequenzen des variablen Bereichs ab der PstI-Stelle (Aminosäurereste 81-121) und die IgG4-cDNA bis zur BstEII-Stelle (Reste 122-191) enthielt, wurde isoliert und zwischen der PstI- und der BstEII-Stelle in pSV. Sport, der die IgG4-cDNA enthielt, subkloniert. Das als pAS7 bezeichnete Konstrukt umfaßte die Reste 81-121 des variablen Bereichs, die mit der gesamten IgG4-cDNA verknüpft waren, flankiert von einer 5'-PstI-Stelle und einer 3'-XbaI-Stelle.
Das Plasmid pAS7 wurde mit PstI und XbaI gespalten, und das Fragment (das die Reste 81-121 des variablen Bereichs und die cDNA des konstanten Bereichs von IgG4 enthielt) wurde zwischen der PstI- und der XbaI-Stelle in den Vektor pBSl-2 (der das Fragment 1-2 enthielt) subkloniert. Dieser als pDA5 bezeichnete Vektor wurde dann mit Sacl linearisiert und mit T4-DNA- Polymerase unter solchen Bedingungen behandelt, daß glatte Enden zurückblieben. Nach SalI-Abbau wurde der gesamte codierende Bereich der schweren Kette h25D2H-1 isoliert und mit dem Vektor pSRS ligasiert, der zuvor mit SalI und SmaI gespalten worden war. Das endgültige Plasmid wurde als pSh25D2H-1 bezeichnet.
Vier Varianten der schweren Kette h25D2H-1 (als h25D2-2 bis h25D2-5 bezeichnet) wurden aufgebaut. Die in die vier Varianten eingebauten Aminosäureänderungen sind in Fig. 1 angegeben, in der die Aminosäurereste unter Verwendung von Standard- Einbuchstaben-Abkürzungen gezeigt sind, und die Sequenzen innerhalb der CDRs 1, 2 und 3 des Antikörpers 25D2 und der Varianten sind mit denen des Antikörpers LAY passend ausgerichtet. Nicht gezeigte Reste waren die der entsprechenden Position im Antikörper LAY.
Alle zusätzlichen Varianten der schweren Kette wurden aufgebaut, indem man DNA-Restriktions-Endonuclease-Fragmente aus dem Plasmid pDA5 durch doppelsträngige Oligonucleotidcassetten ersetzte, die die gewünschten Mutationen enthielten. In jeder Cassette wurden bei den zum Codieren der Proteinsequenz gewählten Nucleotidsequenzen die Codons beibehalten, die in der ursprünglichen Version verwendet wurden, außer daß einige Codons abgeändert wurden, um die Aminosäureänderungen einzubauen, und auch, um eine einmalige Restriktions-Endonuclease- Spaltstelle für die Selektion positiver Transformanten einzuführen.
Zum Aufbau von h25D2H-2 wurde eine Oligonucleotidcassette verwendet, die als 3112 (SEQ ID NO: 55) und 3116 (SEQ ID NO: 56) bezeichnete Oligonucleotide umfaßte, die eine "stille" NheI-Stelle enthielten, um das BamHI/SmaI-DNA-Fragment in pDA5 zu ersetzen, und das neue Plasmid wurde als pKM21 bezeichnet. Zur Erzeugung von h25D2H-3 wurde die DNA von pKM21 mit NheI und SmaI gespalten, wodurch CDR 1 freigesetzt wird. Dieses NheI/SmaI-CDR-1-DNA-Fragment wurde dann durch eine Oligonucleotidcassette ersetzt, die die Oligonucleotide 3117 (SEQ ID NO: 57) und 3118 (SEQ ID NO: 58) umfaßte, wobei pKM23 entstand, das die h25D2H-3-Sequenz enthielt.
Die Vektoren pKM21 und pKM23 wurden mit Sall und SmaI gespalten, und die Fragmente, die die veränderten CDR-1-Sequenzen enthielten, wurden isoliert und anschließend verwendet, um das entsprechende CDR-1-DNA-Fragment im Vektor pSh25H-1 zu ersetzen. Die resultierenden Expressionsvektoren, die die schweren Ketten h25D2H-2 und h25D2H-3 codierten, wurden als pSh25H-2 bzw. pSh25H-3 bezeichnet.
Zum Aufbau der h25D2H-4-codierenden Sequenz wurde das Plasmid pKM23 mit MscI und PstI gespalten, so daß ein DNA-Fragment freigesetzt wurde, das CDR 2 umfaßte. Das Plasmid pKM21 wurde in ähnlicher Weise mit MscI und PstI präpariert, um die h25D2H-5-codierende Sequenz aufzubauen. Eine Oligonucleotidcassette, die die Oligonucleotide 3119 (SEQ ID NO: 59) und 3120 (SEQ ID NO: 60) umfaßte, die das abgeänderte CDR 2 umfaßten, wurde in beide Plasmide zwischen der MscI- und der Pstl- Stelle eingesetzt, wobei h25D2H-4 bzw. h25D2H-5 entstand.
Die resultierenden Plasmide wurden mit SacI gespalten und mit T4-DNA-Polymerase unter solchen Bedingungen behandelt, daß glatte Enden zurückblieben. Die codierenden Bereiche für die schweren Ketten h25D2H-4 und h25D2H-5 wurden nach Sall- Spaltung isoliert und in den Vektor pSRS subkloniert, der zuvor mit Sall und SmaI gespalten worden war. Die endgültigen Vektoren wurden als pSh25H-4 bzw. pSh25H-5 bezeichnet.

Expression und Reinigung der humanisierten Antikörper

Alle DNAs der humanisierten Antikörper wurden durch Elektroporation in COS-7-Zellen transfiziert, und das Medium wurde vier Stunden nach der Transfektion durch serumfreies Medium ersetzt. Die Zellen wurden 3 Tage lang in serumfreiem Medium vermehrt, und dann wurde das Medium entnommen. Um größere Mengen der humanisierten Antikörper zu erhalten, wurden stabile CHO-Zellinien etabliert, die die Antikörper h25D2-1 und h25D2-4 erzeugten.
Das geeignete Plasmid für die schwere Kette (pSh25H-1 bzw. pSh25H-4) wurde mit dem Plasmid pKM20 für die leichte Kette in einem Verhältnis von 10 : 1 in CHO-DXB11-Zellen cotransfiziert. Von ungefähr 40 Klonen, die anhand der Resistenz gegen Hypoxanthin- und Thymidinmangel selektiert worden waren, ergaben mehr als 50% in einem Human-IgG4-ELISA einen positiven Test auf h25D2-1-Antikörper-Expression.
Zwölf der Klone, die die größte Menge an Antikörper h25D2-1 erzeugten, wurden einer Methotrexat-vermittelten DNA-Amplifikation unterzogen. Sechs dieser Klone (als h25D2-1 #1, #7, #15, #17, #18 und #21 bezeichnet) wurden anhand des Wachstums in Gegenwart von 100-250 nM Methotrexat selektiert. Die Mengen der von diesen Klonen exprimierten Antikörper wurde auf der Basis von ELISA auf etwa 200-700 ng/106 Zellen/Tag geschätzt. Klon #17 wurde in einer Rollflaschenkultur expandiert, um größere Mengen des h25D2-1-Antikörpers für die Reinigung und Charakterisierung zu erhalten.
Ungefähr 40 Klone, die mit den h25D2-4-Plasmiden transfiziert worden waren, wurden ebenfalls anhand der Resistenz gegen Hypoxanthin- und Thymidinmangel selektiert. Etwa 30% dieser Klone ergaben in einem Human-IgG4-ELISA einen positiven Test auf Antikörperexpression. Die positiven Klone wurden in Gegenwart von 5 nM Methotrexat gezüchtet. Die Antikörpermenge eines der h25D2-4-Klone (als Klon #7A bezeichnet) wurde durch IgG4- ELISA auf etwa 50-100 ng/106 Zellen/Tag geschätzt. Dieser Klon wurde in einer Rollflaschenkultur expandiert, um größere Mengen des Antikörpers h25D2-4 für die Reinigung und Charakterisierung zu erhalten.
Serumfreies konditioniertes Medium, das durch CHO-Zellklone in Rollflaschenkultur erzeugte Antikörper enthielt, wurde kontinuierlich entnommen, wie es oben beschrieben ist. Antikörper in dem konditionierten Medium wurden durch Protein-G- SEPHAROSE®-Chromatographie partiell gereinigt. Eine Analyse der Antikörper durch reduzierendes SDS-PAGE zeigte einen hohen Reinheitsgrad (wenigstens etwa 90%). Eine Analyse der Antikörper durch eine Reihe von ELISA-Assays zeigte, daß sie konstante Bereiche sowohl von Human-κ als auch von Human-γ4 enthielten.

Beispiel III. Antikörger-Charakterisierung

Affinitätskonstanten

Alle fünf Varianten des Gens der humanisierten schweren Kette wurden unabhängig mit dem Vektor pKM20 für die leichte Kette in COS-7-Zellen cotransfiziert. Das serumfreie konditionierte Medium wurde nach 72 Stunden entnommen und konzentriert. Die Affinitätskonstanten wurden so bestimmt, wie es oben beschrieben ist, wobei man die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse erhielt. Tabelle 3
* COS-CM = COS-Zellen-konditioniertes Medium
Wie in Tabelle 3 gezeigt, waren die Affinitäten der humanisierten Antikörper h25D2-1, h25D2-3 und h25D2-4 in bezug auf die Bindung an Human-IL-4 ähnlich denen des nativen Ratten- 25D2-Antikörpers. Die Affinitäten der Antikörper h25D2-2 und h25D2-5 waren geringer.

Kompetitive Bindungsanalyse

Um die humanisierten Antikörpervarianten h25D2-1 und h25D2-4 weiter zu charakterisieren, wurden kompetitive Bindungsassays mit den humanisierten Antikörpern und dem Ratten-Antikörper 25D2 wie oben beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, daß der Antikörper h25D2-1 bei Raumtemperatur bei der Konkurrenz mit dem Antikörper 25D2 um die Bindung an 125I-hIL-4 3mal weniger effektiv war als der Antikörper 25D2. Der Antikörper h25D2-4 war in demselben Assay etwa 100mal weniger effektiv als der Antikörper 25D2. Wenn die gleichen Assays jedoch bei 4ºC durchgeführt wurden, war der humanisierte Antikörper h25D2-1 im kompetitiven Assay genauso effektiv wie der native Antikörper, und der Antikörper h25D2-4 war nur 2mal weniger effektiv.

Hemmung der Rezeptorbindung

Die humanisierten Antikörper h25D2-1 und h25D2-4 wurden wie oben beschrieben auf die Fähigkeit getestet, die Bindung von radioaktiv markiertem hIL-4 an auf der Jijoye-CJ-Zellinie exprimierte rekombinante hIL-4-Rezeptoren zu hemmen. Bei einer konstanten Konzentration des radioaktiv markierten hIL-4 wurde die zur Bewirkung einer 50%igen Hemmung der Rezeptorbindung erforderliche Konzentration an den Antikörpern h25D2-1 und h25D2-4 (ICSO) zu 0,5-1,0 bzw. 1,0-2,0 nM berechnet. Das IC&sub5;&sub0; für den nativen 25D2-Antikörper wurde zu 0,5-1,0 nM berechnet.

Hemmung der Keimlinie-&epsi;-Promotor-Aktivität

Jijoye-C&sub1;&sub2;-Zellen enthalten mehrfache endogene Kopien eines Human-Wachstumshormon-Reporter-Gens, das operabel mit einem Keimlinie-&epsi;-Transcript-Promotor verknüpft ist. Dieser Promotor ist durch IL-4 induzierbar [Rothman et al., J. Exp. Med. 168: 2385 (1988)].
Um zu bestimmen, ob die Antikörper h25D2-1 und h25D2-4 die Induktion des Keimlinie-&epsi;-Promotors durch Human-IL-4 blockieren können, wurden Assays unter Verwendung von Jijoye-C12- Zellen durchgeführt, wie sie oben beschrieben sind. Für die Antikörper h25D2-1 und h25D2-4 wurden IC&sub5;&sub0;-Werte von etwa 120 bzw. 600 pM gefunden, im Vergleich zu einem Bereich von 20-40 pM, den man für den Wildtyp-Antikörper 25D2 beobachtet.

Beispiel IV. Humanisierte Antikörper mit hoher Affinität

Strategie

Die oben beschriebene leichte und schwere Kette des humanisierten Antikörpers h25D2-1 wurden für eine weitere Modifikation ausgewählt, um einen merklich überlegenen humanisierten monoklonalen Antikörper aufzubauen, der als h25D2-9 bezeichnet wird. Die leichte und die schwere Kette des Ausgangsantikörpers werden oben als h25D2L-1 bzw. h25D2H-1 bezeichnet und sollen auch im folgenden so bezeichnet werden.
Zunächst wurden als h25D2-7 und h25D2-8 bezeichnete humanisierte Antikörperversionen entworfen, die unter anderem eine Modifikation der schweren Kette h25D2H-1 enthielten, bei der der Alaninrest auf Position 97 (siehe SEQ ID NO: 32) durch einen Valinrest ersetzt war, der im Nager-Antikörper auf dieser Position vorhanden ist. Diese modifizierte schwere Kette in den Versionen h25D2-7 und h25D2-8 wurde mit den leichten Ketten h25D2L bzw. h25D2L-1 kombiniert. Die gewünschten Leistungsfähigkeiten wurden mit diesen Antikörpern jedoch nicht erhalten.
Zur Herstellung des Antikörpers h25D2-9 wurden die Gerüstbereiche der Stammsequenzen der schweren und leichten Kette von LAY für die Untergruppe III der schweren Kette und die Untergruppe I der leichten κ-Kette, wie sie von Kabat, loc. cit., definiert wurden, auf Reste untersucht, die sich von den Human-Consensus-Resten unterschieden.
Diese Analyse unterschied sich von dem von Adair et al. (Internationale Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer WO 91/09967) eingesetzten Verfahren dadurch, daß (a) alle Positionen, auf denen die Sequenz unter Bildung von h25D2-1 zum Nager-Rest abgeändert worden war, aus der weiteren Betrachtung ausgeschlossen wurden und (b) Consensus-Reste einer Untergruppe anstelle von Gesamt-Consensus-Resten berücksichtigt wurden.
Unter Verwendung von Informationen, die bei den Untersuchungen der Gerüstsequenz erhalten wurden, wurde der humanisierte Antikörper h25D2-9 entworfen, indem man mehrere der Nicht- Consensus-h25D2-1-Reste entweder zum entsprechenden 25D2- Nager-Antikörperrest oder zum Human-Consensus-Rest abänderte, wobei das Verfahren von Adair et al., loc. cit., das wie oben beschrieben modifiziert war, verwendet wurde. So wurden bei der Gestaltung des Antikörpers h25D2-9 neun Reste der schweren und fünf Reste der leichten Kette des Antikörpers h25D2-1 geändert.
Eine Zusammenfassung der vorgenommenen Veränderungen einschließlich der relevanten Kabat-Positionen und der Reste in den verschiedenen Konstrukten, dem Antikörper LAY und dem ursprünglichen Nager-Antikörper 25D2, ist in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
Zur Darstellung der Aminosäurereste wurden Standard- Einbuchstaben-Abkürzungen verwendet.
Die Grundlage für die Aufnahme des Human-Consensus- oder des Nager-Restes ist ebenfalls in Tabelle 4 angegeben. Man beachte, daß vier Reste der schweren Kette (Kabat-Positionen 1, 49, 72 und 87) und keine Reste der leichten Kette als Nager-Reste aufgenommen wurden. Fünf Reste der schweren Kette (Kabat- Positionen 5, 82B, 83, 86 und 89) und fünf Reste der leichten Kette (Kabat-Positionen 13, 42, 73, 83 und 106) wurden als Human-Consensus-Reste aufgenommen. Auf den Positionen 1, 5, 72, 82B, 83, 86 und 87 der schweren Kette und auf den Positionen 13 und 73 der leichten Kette waren der Nager- und der Human-Consensus-Rest identisch. Die Grundlage für die Aufnahme in h25D2-9 war für alle diese Positionen der Consensus-Rest, mit der Ausnahme von Position 1, 72 und 87 der schweren Kette, die als Nager-Reste aufgenommen wurden.

Aufbau

Leichte Kette

Ein Bluescribe-Plasmid, das das EcoRI/KpnI-Fragment 1 enthielt (das beim oben beschriebenen Aufbau der leichten Kette h25D2L verwendet wurde), das zwischen die EcoRI- und die KpnI-Stelle eingesetzt war, diente als Ausgangsplasmid. Vier Oligonucleotidcassetten, die acht gepaarte synthetische Oligonucleotide umfaßten, wurden nacheinander in den Vektor eingesetzt, so daß ein als h25D2-9 VL bezeichnetes Plasmid entstand.
Die Bezeichnungen dieser Oligonucleotide (wie in den Cassetten gepaart gezeigt), denen in Klammern die entsprechenden Sequenzidentifikationsnummern folgen, waren wie folgt:
3866 (SEQ ID NO: 61)
3867 (SEQ ID NO: 62)
3944 (SEQ ID NO: 63)
3945 (SEQ ID NO: 64)
3966 (SEQ ID NO: 65)
3967 (SEQ ID NO: 66)
3979 (SEQ ID NO: 67)
3980 (SEQ ID NO: 68)
Während des Aufbaus wurden zur Identifizierung rekombinanter Plasmide stille Restriktions-Endonuclease-Spaltstellen zu den Cassetten hinzugefügt. Zunächst wurde ein EcoRI/BstEII- Fragment im Ausgangsplasmid durch die Cassette ersetzt, die das Oligonucleotidpaar 3866/3867 umfaßte. Das Ergebnis war ein Ersatz des Valinrestes auf Position 13 der leichten Kette h25D2-1 (siehe SEQ ID NO: 27) durch einen Alaninrest und die Einführung einer stillen HindIll-Stelle, und das Konstrukt wurde als pKM45 bezeichnet.
Dann wurde die Cassette, die das Oligonucleotidpaar 3944/3945 umfaßte, zwischen die Kpnl- und die XbaI-Stelle von pKM45 eingesetzt. Das resultierende, als pKM47 bezeichnete Konstrukt enthielt einen Lysinrest auf Position 42 anstelle des Leucinrestes, der in der leichten Kette h25D2L-1 auf dieser Position vorhanden ist, sowie eine stille XhoI-Stelle.
Dann wurde die Cassette, die das Oligonucleotidpaar 3966/3967 umfaßte, zwischen die XbaI- und die PstI-Stelle von pKM47 eingesetzt, wobei pKM49 entstand, das einen Leucinrest auf Position 73 anstelle des Phenylalaninrestes, der in der leichten Kette h25D2L-1 auf dieser Position vorhanden ist, sowie eine stille XmnI-Stelle enthielt.
Schließlich wurde die Cassette, die das Oligonucleotidpaar 3979/3980 umfaßte, zwischen die PstI- und die SphI-Stelle von pKM49 eingesetzt, was pKM50 ergab. Das Plasmid pKM50 enthielt einen Phenylalaninrest auf Position 83 anstelle des Isoleucinrestes auf dieser Position in h25D2L-1 sowie eine stille SnaßI-Stelle. Es enthielt auch eine MscI-Stelle, um weitere Klonierungsmanipulationen zu erleichtern.
Das Konstrukt wurde weiterhin so modifiziert, daß es auf Position 105 einen Isoleucinrest anstelle des Valinrestes, der in h25D2L-1 auf dieser Position vorhanden ist, enthielt. Um diese Änderung vorzunehmen, wurde der Bluescript-Vektor, der die h25D2L-1-codierende Sequenz enthielt, einer Einzelstrang- Mutagenese unterzogen (Sambrook et al., 1989, in Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Press; Vol. I, S. 4.48, und Vol. II, S. 15.63-15.65), wobei ein als 3974 bezeichnetes Oligonucleotid (Sequenz durch SEQ ID NO: 69 definiert) verwendet wurde. Dieses Oligonucleotid ergab die gewünschte Substitution und führte zu einer Deletion zweier Styl-Stellen, wodurch die Selektion der mutanten Plasmide erleichtert wurde. Das resultierende Plasmid wurde als pKM51 bezeichnet.
Das SalI-MscI-Fragment von pKM51 wurde durch das entsprechende Fragment aus pKM50 ersetzt, was Plasmid pKM52 ergab. Dieses Plasmid enthielt den gesamten codierenden Bereich der leichten Kette von h25D2-9 und umfaßte, zusammengefaßt, die folgenden Veränderungen in bezug auf die leichte Kette von h25D2-1: V13A, L42K, F73L, I83F und V105I.
Die vollständige Sequenz des variablen Bereichs der leichten Kette ist in SEQ ID NO: 70 des Sequenzlistings zusammen mit der Sequenz eines sekretorischen Leitpeptids gezeigt.
Zum Aufbau eines Säuger-Expressionsvektors wurde das Plasmid pKM52, das die Sequenz der leichten Kette von h25D2-9 enthielt, am 3'-Ende mit SpeI gespalten und mit dem Klenow- Fragment von DNA-Polymerase unter Bedingungen behandelt, bei denen glatte Enden zurückbleiben. Nach Spaltung am 5'-Ende mit Sall wurde das h25D2-9-DNA-Fragment erhalten und an den Vektor pDSRS ligasiert, der zuvor mit Sall und SmaI gespalten worden war. Der als pKM53 bezeichnete fertige Expressionsvektor enthielt den gesamten codierenden Bereich für die leichte Kette von h25D2L-9 einschließlich des Signalpeptids und des Human-κ-konstanten Bereichs.

Schwere Kette

Ausgehend von dem oben beschriebenen Plasmid pDAS wurde die schwere Kette h25D2-1 des Antikörpers h25D2-1 (siehe SEQ ID NO: 32) durch Restriktionsspaltung und die aufeinanderfolgende Einführung von vier Oligonucleotidcassetten, die acht gepaarte synthetische Oligonucleotide umfaßten, modifiziert. Zur Identifizierung rekombinanter Plasmide wurden stille Restriktions- Endonuclease-Spaltstellen zu den Cassetten hinzugefügt.
Die Bezeichnungen dieser Oligonucleotide (wie in den Cassetten gepaart gezeigt), denen in Klammern die entsprechenden Sequenzidentifikationsnummern folgen, waren wie folgt:
3592 (SEQ ID NO: 71)
3593 (SEQ ID NO: 72)
3850 (SEQ ID NO: 73)
3851 (SEQ ID NO: 74)
3711 (SEQ ID NO: 75)
3712 (SEQ ID NO: 76)
3848 (SEQ ID NO: 77)
3849 (SEQ ID NO: 78)
Die Modifikation der schweren Kette h25D2-1 des Antikörpers h25D2-1 wurde eingeleitet, indem man das MscI/PstI-Fragment von pDA5 durch eine Cassette ersetzte, die das Oligonucleotidpaar 3592/3593 umfaßte. Dies beinhaltete eine N73D- und N77S-Änderung sowie eine stille XbaI-Stelle. Das resultierende Plasmid wurde als pKM37 bezeichnet. Ein SalI/KpnI-Fragment (das die Aminosäurereste 1-113 umfaßte) wurde aus pKM37 isoliert und in einen Bluescript-Vektor subkloniert, um weitere Klonierungsmanipulationen zu erleichtern. Dieser Vektor wurde als pKM39 bezeichnet.
Die Oligonucleotidcassette, die das Oligonucleotidpaar 3850/3851 umfaßte, wurde zwischen die BamHI- und die SacII- Stelle (SacII im Vektor befindlich) von pKM39 eingesetzt. Das resultierende, als pKM44 bezeichnete Plasmid enthielt die Veränderungen LSV, N73D und N77S.
Das Plasmid pKM39 diente als Ausgangsplasmid für den Einbau der letzten beiden Cassetten. Zunächst wurde ein SmaI-Fragment, das eine PstI-Stelle in dem Vektor umfaßte, aus pKM39 entfernt, um die Klonierung zu erleichtern. Die Cassette, die das Oligonucleotidpaar 3711/3712 umfaßte, wurde verwendet, um das entsprechende Fragment im VH-Bereich des Vektors zu ersetzen. Das endgültige Konstrukt wurde als pKM41 bezeichnet und enthielt die Veränderung A97 V sowie eine stille NruI-Stelle, die bei anschließenden Klonierungsmanipulationen verwendet wurde.
Dann wurde die Cassette, die das Oligonucleotidpaar 3848/3849 umfaßte, zwischen die PstI- und die NruI-Stelle von pKM41 eingesetzt. Das als pKM43 bezeichnete resultierende Konstrukt enthielt die Veränderung A97 V sowie die Veränderungen G85S, Q87R, V90D, S91T und I93 V. Das KpnI/MscI-Fragment von pKM43 wurde isoliert und verwendet, um das entsprechende Fragment von pKM44 zu ersetzen (pKM44 enthielt die Veränderungen N73D, N77S und L5V). Das als pKM46 bezeichnete resultierende Plasmid enthielt den vollständigen VH-Bereich von h25D2-9.
Die vollständige Seguenz des variablen Bereichs der schweren Kette ist in SEQ ID NO: 79 des Sequenzlistings zusammen mit der Sequenz eines sekretorischen Leitpeptids gezeigt.
Ein SalI/KpnI-Fragment (das die Aminosäurereste 1-113 der schweren Kette umfaßte) diente dazu, das entsprechende Fragment im Expressionsvektor pSh25D2H-1 zu ersetzen, und der endgültige Expressionsvektor für die schwere Kette von h25D2-9 wurde als pSh25D2H-9 bezeichnet.
Die vollständigen Aminosäuresequenzen der leichten und der schweren Kette des Antikörpers h25D2-9 sind im Sequenzlisting durch SEQ ID NO: 80 bzw. SEQ ID NO: 81 definiert. Die Sequenzen zeigen die vermuteten aminoterminalen Reste für die reifen Formen der Antikörperketten, die nach der Abspaltung der sekretorischen Leitpeptide entstehen. Wiederum hätten auch viele andere wohlbekannte Leitpeptide anstelle der zur Veranschaulichung dieser Erfindung tatsächlich eingesetzten verwendet werden können.

Antikörper-Expressionsniveaus

COS-Zellen wurden wie oben beschrieben mit jeweils 10 ug entweder der Plasmide pKM53 (für die leichte Kette des Antikörpers h25D2-9) und pSh25D2H-9 (für die schwere Kette des Antikörpers h25D2-9) oder der Plasmide pKM20 (für die leichte Kette des Antikörpers h25D2-1) und pSh25D2H-1 (für die schwere Kette des Antikörpers h25D2-1) transfiziert. Nach einer viertägigen Inkubation in Medium, das 1% Kälberfetusserum enthielt, um die Sekretion des Antikörpers zu ermöglichen, wurden Proben von Medium von den COS-Zellen im wesentlichen so, wie es oben beschrieben ist, einem ELISA unterzogen, um die Expressionsniveaus der humanisierten Antikörper h25D2-1, des besten der humanisierten Antikörper des Standes der Technik hinsichtlich der Leistungsfähigkeit, und h25D2-9 zu bestimmen.
Dabei wurde gefunden, daß der humanisierte Antikörper h25D2-1 auf einem Niveau von 10-20 ng/ml Medium erzeugt wurde. Dagegen wurde der Antikörper h25D2-9 auf einem Niveau von 100 ng/ml erzeugt, was einer fünf- bis zehnfachen Erhöhung gegenüber h25D2-1 entspricht.

Kompetitiver Assay

Ein kompetitiver Plattenassay wurde wie oben beschrieben unter Verwendung von ¹²&sup5;I-hIL-4, immobilisiertem Ratten-Antikörper 25D2 und variierenden Mengen der freien Antikörper 25D2, h25D2-1 oder h25D2-9 durchgeführt. Die Ergebnisse dieses Assays, der sowohl bei 4ºC als auch bei Raumtemperatur (etwa 22ºC) durchgeführt wurde, sind in Fig. 2 gezeigt.
Wie man anhand von Fig. 2 erkennt, waren beide humanisierten Antikörper bei der Konkurrenz um die Bindung an 125I-hIL-4 bei 4ºC etwa so effektiv wie der Nager-Antikörper 25D2. Bei Raumtemperatur war jedoch eine Konzentration an Antikörper h25D2-1, die mehr als doppelt so groß war wie die von Antikörper h25D2-9, erforderlich, um eine vergleichbare 50%ige Hemmung der Bindung des ¹²&sup5;I-hIL-4 an den immobilisierten Antikörper zu erhalten. Antikörper h25D2-1 war also bei der höheren Temperatur weniger aktiv als Antikörper h25D2-9.

Bioassay

Um die Fähigkeiten des Nager-Antikörpers 25D2 und der humanisierten Antikörper h25D2-1 und h25D2-9 zur Hemmung der Induktion des Human-Wachstumshormons im Keimlinie-&epsi;-Reporter-Assay miteinander zu vergleichen, wurde der oben beschriebene Assay unter Verwendung der Jijoye-C12-Zellinie mit verschiedenen Mengen aller drei Antikörper durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt, wo offensichtlich ist, daß die Antikörper 25D2 und h25D2-9 zwar eine ähnliche Aktivität hatten, daß aber eine ungefähr fünfmal höhere Konzentration an Antikörper h25D2-1 erforderlich war, um in dem Assay eine vergleichbare 50%ige Hemmung zu erhalten.

Hybridom-Hinterlequng

Das Hybridom MP4.25D2.11 wurde am 1. September 1988 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), unter der Zugriffsnummer ATCC HB 9809 hinterlegt. Diese Hinterlegung erfolgte unter den Bedingungen, wie sie die ATCC- Übereinkunft für die Hinterlegung von Kulturen für Patentzwekke vorsieht und die gewährleisten, daß die Hinterlegung dem US Commissioner of Patents and Trademarks gemäß 35 USC 122 und 37 CFR 1.14 zugänglich gemacht wird und nach Erteilung eines US- Patents der Öffentlichkeit zugänglich gemacht wird, und die erfordern, daß die Hinterlegung aufrechterhalten wird. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Stammes ist nicht als eine Lizenz zur praktischen Durchführung der Erfindung in Zuwiderhandlung gegen die unter der Autorität irgendeiner Regierung gemäß ihren Patentgesetzen gewährten Rechte anzusehen.
Die hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen werden nur beispielhaft angegeben, und die Erfindung wird nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt.

Sequenzlisting

(1) Allgemeine Informationen:

(i) Anmelder < für alle benannten Staaten außer den USA):
(A) Name: Schering Corporation
(B) Straße: 2000, Galloping Hill Road
(C) Stadt: Kenilworth
(D) Staat: New Jersey
(E) Land: USA
(F) Postcode (ZIP): 07033-0530
(G) Telefon: 908-298-2906
(H) Telefax: 908-298-5388
(I) Telex:
(i) Anmelder (nur für die USA):
Dalie, Barbara
Miller, Kenneth
Murgolo, Nicholas
Tindall, Stephen
(ii) Titel der Erfindung: Humanisierte monoklonale Antikörper gegen Human-Interleukin-4
(iii) Anzahl der Sequenzen: 81
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: Schering-Plough Corporation
(B) Straße: 2000, Galloping Hill Road
(C) Stadt: Kenilworth
(D) Staat: New Jersey
(E) Land: USA
(F) ZIP: 07033-0530
(v) Computerlesbare Form:
(A) Art des Mediums: Diskette
(B) Computer: Apple Macintosh
(C) Betriebssystem: Macintosh 6.0.5
(D) Software: Microsoft Word 5.1a
(vi) Daten zur aktuellen Anmeldung:
(A) Anmeldungsnummer:
(B) Einreichungsdatum:
(C) Klassifizierung:
(vii) Daten zu früheren Anmeldungen:
(A) Anmeldungsnummer: US 08/208886
(viii) Informationen zum Anwalt/Vertreter:
(A) Name: Dulak, Norman C.
(B) Registrierungsnummer: 31,608
(C) Bezugszeichen/Aktenzeichen: JB0429K
(ix) Telekommunikationsinformationen:
(A) Telefon: (908) 298-2906
(B) Telefax: (908) 298-5388
(C) Telex:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 1:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 363 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1:

(2) Informationen für SEQ ID NO: 2:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 321 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 2:

(2) Informationen für SEQ ID NO: 3:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 3:
CGATGCACAA GTGCGAT 17
(2) Informationen für SEQ ID NO: 4:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 4:
ATCGCACTTG TGCAT 15
(2) Informationen für SEQ ID NO: 5:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 46 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 5:
GCACTAGTTC TAGAAGGCCA AGAGGGGCCA CTGACTCTGG GGTCAT 46
(2) Informationen für SEQ ID NO: 6:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 51 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 6:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 7:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 51 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 7:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 8:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 33 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 8:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 9:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 9:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 10;
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 10:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 11:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 11:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 12:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 12:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 13:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 13:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 14:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 14:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 15:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 15:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 16:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 390 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 16:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 17:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 72 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 17:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 18:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 73 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 18:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 19:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 105 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 19:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 20:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 36 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 20:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 21:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 80 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 21:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 22:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 84 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 22:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 23:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 68 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 23:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 24:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 74 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 24:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 25:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 33 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 25:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 26:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 59 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 26:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 27:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 3ß3 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 27:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 28:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 39 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 28:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 29:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 29:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 30:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 45 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 30:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 31:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 31:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 32:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 435 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 32:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 33:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 84 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 33:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 34:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 84 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 34:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 35:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 35:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 36:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 80 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 36:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 37:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 79 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 37:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 38:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 78 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 38:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 39:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 84 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 39:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 40:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 60 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 40:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 41:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 36 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 41:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 42:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 60 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 42:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 43:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 102 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 43:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 44:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 102 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 44:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 45:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 86 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 45:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 46:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 73 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 46:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 47:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 104 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 47:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 48:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 99 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 48:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 49:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 70 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 49:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 50:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 79 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 50:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 51:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 68 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 51:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 52:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 51 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 52:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 53:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 38 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 53:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 54:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 40 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 54:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 55:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 76 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 55:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 56:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 72 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 56:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 57:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 52 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 57:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 58:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 48 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 58:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 59:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 100 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 59:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 60:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 96 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 60:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 61:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 123 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 61:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 62:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 124 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 62:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 63:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 70 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 63:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 64:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 78 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 64:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 65:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 58 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 65:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 66:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 50 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 66:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 67:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 66 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 67:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 68:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 66 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 68:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 69:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 38 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 69:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 70:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 393 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 70:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 71:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 100 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 71:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 72:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 96 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 66:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 73:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 120 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 73:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 74:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 126 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 74:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 75:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 99 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 75:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 76:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 99 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 76:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 77:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 48 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 77:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 78:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 52 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 78:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 79:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 435 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Doppelstrang
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 79:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 80:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 232 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 80:
(2) Informationen für SEQ ID NO: 81:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 467 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 81:

Claims

1. Polypeptid, das einen variablen Bereich eines humanisierten monoklonalen Antikörpers umfaßt, der spezifisch an Human-IL-4 bindet, wobei der variable Bereich eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine reife Form einer Sequenz umfaßt, die in SEQ ID NO: 70 oder SEQ ID NO: 79 gezeigt ist.

2. Humanisierter monoklonaler Antikörper oder Fragment davon, der bzw. das spezifisch an Human-IL-4 bindet, wobei der humanisierte Antikörper oder das Fragment davon einen variablen Bereich einer leichten oder schweren Kette mit einer Aminosäuresequenz umfaßt, die eine reife Form einer Sequenz umfaßt, die in SEQ ID NO: 70 bzw. SEQ ID NO: 79 gezeigt ist.

3. Antikörper gemäß Anspruch 2, der durch leichte und schwere Ketten mit einer Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist, die eine reife Form der Sequenzen umfaßt, die in SEQ ID NO: 80 bzw. SEQ ID NO: 81 gezeigt sind.

4. Nucleinsäure, die ein Polypeptid codiert, das eine reife Form einer Aminosäuresequenz umfaßt, die in SEQ ID NO: 70 oder SEQ ID NO: 79 gezeigt ist, wobei diese reifen Sequenzen einem variablen Bereich einer leichten Kette bzw. einer schweren Kette eines humanisierten monoklonalen Antikörpers entsprechen, der spezifisch an Human-IL-4 bindet.

5. Rekombinanter Vektor, der eine Nucleinsäure gemäß Anspruch 4 umfaßt.

6. Wirtszelle, die einen rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 5 umfaßt.

7. Wirtszelle gemäß Anspruch 6, bei der es sich um eine COS- Zelle handelt.

8. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 6 unter Bedingungen, bei denen die Nucleinsäure exprimiert wird, umfaßt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Wirtszelle eine COS-Zelle ist.

10. Komplex, der den Antikörper oder das Fragment gemäß Anspruch 2 oder 3 umfaßt, der bzw. das an IL-4 gebunden ist.

11. Anti-idiotypischer Antikörper oder Fragment davon, der bzw. das an einen variablen Bereich einer leichten oder schweren Kette des humanisierten monoklonalen Antikörpers oder des Fragments gemäß Anspruch 2 oder 3 bindet.

12. Anti-idiotypischer Antikörper oder Fragment gemäß Anspruch 11, bei dem es sich um einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon handelt.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen physiologisch annehmbaren Träger und den humanisierten monoklonalen Antikörper oder das Fragment gemäß Anspruch 2 oder 3 umfaßt.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen physiologisch annehmbaren Träger und den Komplex gemäß Anspruch 10 umfaßt.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen physiologisch annehmbaren Träger und den anti-idiotypischen Antikörper gemäß Anspruch 11 umfaßt.

16. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das das Mischen eines physiologisch annehmbaren Trägers mit einem monoklonalen Antikörper oder Fragment gemäß Anspruch 2 oder 3, einem Komplex gemäß Anspruch 10 oder einem anti-idiotypischen Antikörper oder Fragment gemäß Anspruch 11 umfaßt.