CN104395332B - 甲基巴多索隆的2，2‑二氟丙酰胺衍生物、其多晶型物及使用方法 - Google Patents

甲基巴多索隆的2，2‑二氟丙酰胺衍生物、其多晶型物及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明大体上涉及以下化合物：N‑((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)‑11‑氰基‑2,2,6a,6b,9,9,12a‑七甲基‑10,14‑二氧代‑1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b‑十八氢苉‑4a‑基)‑2,2‑二氟丙酰胺、其多晶型物、其制备和使用方法、其药物组合物以及其试剂盒和制品。

Description

甲基巴多索隆的2，2-二氟丙酰胺衍生物、其多晶型物及使用 方法
本申请要求在2013年3月13日提交的美国临时申请号61/780,444、在2013年3月8日提交的美国临时申请号61/775,288以及在2012年4月27日提交的美国临时申请号61/687,669的优先权的权益；这些申请中的每一件的全部内容均以引用方式并入本文中。
依照37C.F.R.1.821(c)，并此递交呈ASCII兼容的文本文件形式的序列表，该文本文件的名称为“REATP0073WO_ST25”，是在2013年4月24日创建的并且具有约6千字节的大小。上述文件的内容在此以引用方式整体并入本文。
技术领域
本发明大体上涉及以下化合物：
N-((4aS，6aR，6bS，8aR，12aS，14aR，14bS)-11-氰基-2，2，6a，6b，9，9，12a-七甲基-10，14-二氧代-1，2，3，4，4a，5，6，6a，6b，7，8，8a，9，10，12a，14，14a，14b-十八氢苉-4a-基)-2，2-二氟丙酰胺，其在本文中也被称作RTA 408、63415或PP415。本发明还涉及其多晶型物、其制备方法和使用方法、其药物组合物以及其试剂盒和制品。
背景技术
天然存在的三萜系化合物齐墩果酸的抗炎和抗增殖活性已通过化学修饰而得到提高。举例来说，已研发出2-氰基-3，12-二氧代齐墩果-1，9(11)-二烯-28-酸(CDDO)和相关化合物。参见Honda等人，1997；Honda等人，1998；Honda等人，1999；Honda等人，2000a；Honda等人，2000b；Honda等人，2002；Suh等人，1998；Suh等人，1999；Place等人，2003；Liby等人，2005；以及美国专利8,129,429、7,915,402、8,124,799和7,943,778，所有这些文献均以引用方式并入本文中。已在II期和III期临床试验中在治疗和预防糖尿病性肾病和慢性肾病方面对甲酯甲基巴多索隆(bardoxolone methyl，CDDO-Me)进行了评价。参见Pergola等人，2011，该文献以引用方式并入本文中。
齐墩果酸的合成三萜系化合物类似物也已被证实为细胞炎性过程的抑制剂，所述细胞炎性过程例如在小鼠巨噬细胞中IFN-γ对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和COX-2的诱导。参见Honda等人(2000a)；Honda等人(2000b)；Honda等人(2002)；以及美国专利8,129,429、7,915,402、8,124,799和7,943,778，这些文献均以引用方式并入本文中。衍生自齐墩果酸的化合物已被证实能影响多种蛋白质靶标的功能并且因此调节与氧化应激、细胞周期控制和炎症相关的多条重要的细胞信号传导通路的活性(例如Dinkova-Kostova等人，2005；Ahmad等人，2006；Ahmad等人，2008；Liby等人，2007a；以及美国专利8,129,429、7,915,402、8,124,799和7,943,778)。
考虑到已知的三萜系化合物衍生物的生物活性谱有所不同，并且鉴于存在多种多样的可用具有强效的抗氧化作用和抗炎作用的化合物治疗或预防的疾病以及在此多种多样的疾病内所表现出的医疗需求在很大程度上未得到满足，期望合成用于治疗或预防一种或多种适应症的具有不同生物活性谱的新化合物。
发明内容
在本发明的一些方面，提供具有下式的化合物(在本文中也被称作RTA408、63415或PP415)：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物呈药学上可接受的盐形式。在一些实施方案中，所述化合物不呈盐形式。
在本发明的另一个方面，提供上述化合物的多晶型物。在一些实施方案中，所述多晶型物具有在约14°2θ处包含晕峰(halo peak)的X射线粉末衍射图谱(CuKα)。在一些实施方案中，所述X射线粉末衍射图谱(CuKα)进一步在约8°2θ处包含肩峰。在一些实施方案中，所述X射线粉末衍射图谱(CuKα)基本上如图59中所示。在一些实施方案中，所述多晶型物具有约150℃到约155℃的Tg，包括例如约153℃的Tg或约150℃的Tg。在一些实施方案中，所述多晶型物具有包含以约150℃到约155℃为中心的吸热的差示扫描量热(DSC)曲线。在一些实施方案中，吸热以约153℃为中心。在一些实施方案中，吸热以约150℃为中心。在一些实施方案中，差示扫描量热(DSC)曲线基本上如图62中所示。
在一些实施方案中，所述多晶型物是具有在约5.6°2θ、7.0°2θ、10.6°2θ、12.7°2θ和14.6°2θ处包含峰的X射线粉末衍射图谱(CuKα)的溶剂化物。在一些实施方案中，所述X射线粉末衍射图谱(CuKα)基本上如图75中的顶部图谱所示。
在一些实施方案中，所述多晶型物是具有在约7.0°2θ、7.8°2θ、8.6°2θ、11.9°2θ、13.9°2θ(双峰)、14.2°2θ和16.0°2θ处包含峰的X射线粉末衍射图谱(CuKα)的溶剂化物。在一些实施方案中，所述X射线衍射图谱(CuKα)基本上如图75中从顶部起的第二个图谱所示。
在一些实施方案中，所述多晶型物是具有在约7.5°2θ、11.4°2θ、15.6°2θ和16.6°2θ处包含峰的X射线粉末衍射图谱(CuKα)的乙腈半溶剂化物。在一些实施方案中，所述X射线衍射图谱(CuKα)基本上如图75中从底部起第二个图谱所示。在一些实施方案中，所述多晶型物具有约196℃的Tg。在一些实施方案中，所述多晶型物具有包含以约196℃为中心的吸热的差示扫描量热(DSC)曲线。在一些实施方案中，差示扫描量热(DSC)曲线基本上如图116中所示。
在一些实施方案中，所述多晶型物是具有在约6.8°2θ、9.3°2θ、9.5°2θ、10.5°2θ、13.6°2θ和15.6°2θ处包含峰的X射线粉末衍射图谱(CuKα)的溶剂化物。在一些实施方案中，所述X射线衍射图谱(CuKα)基本上如图75中的底部图谱所示。
在本发明的另一个方面，提供药物组合物，所述药物组合物包含由上述化合物或其多晶型物(例如本文在上文和下文所述的多晶型物中的任一种)组成的活性成分和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于以如下方式施用：口服、脂肪内、动脉内、关节内、颅内、真皮内、病灶内、肌内、鼻内、眼内、心包内、腹膜内、胸膜内、***内、直肠内、鞘内、气管内、瘤内、脐内、***内、静脉内、膀胱内(intravesicularlly)、玻璃体内、以脂质体方式、局部(locally)、经粘膜、肠胃外、经直肠、结膜下、皮下、舌下、表面局部(topically)、经颊、透皮、经***、以乳膏(crèmes)形式、以液体组合物形式、经由导管、经由灌洗、经由连续输注、经由输注、经由吸入、经由注射、经由局部递送、或经由局部灌注。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于口服、动脉内、静脉内或表面局部施用。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于口服施用。
在一些实施方案中，所述药物组合物被配制成硬胶囊或软胶囊、片剂、糖浆、混悬液、乳液、溶液、固体分散系、糯米纸囊剂(wafer)或酏剂。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物进一步包含提高溶解性和分散性的试剂。(例如，提高溶解性和分散性的试剂包括但不限于PEG、环糊精(cyclodextran)和纤维素衍生物。)在一些实施方案中，将所述化合物或多晶型物悬浮在芝麻油中。
在其它实施方案中，所述药物组合物被配制用于表面局部施用。在其它实施方案中，所述药物组合物被配制成洗剂、乳膏、凝胶、油、软膏、油膏、乳液、溶液或混悬液。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制成洗剂、乳膏或凝胶。在一些实施方案中，活性成分的量是约0.01重量％到约5重量％、约0.01重量％到约3重量％、或0.01重量％、0.1重量％、1重量％或3重量％。
在本发明的另一个方面，提供了治疗或预防有需要的患者的与炎症或氧化应激相关的病况的方法，所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的如上文或下文所述的药物组合物。本发明同样涉及用于治疗或预防与炎症或氧化应激相关的病况的化合物N-((4aS，6aR，6bS，8aR，12aS，14aR，14bS)-11-氰基-2，2，6a，6b，9，9，12a-七甲基-10，14-二氧代-1，2，3，4，4a，5，6，6a，6b，7，8，8a，9，10，12a，14，14a，14b-十八氢苉-4a-基)-2，2-二氟丙酰胺(或RTA 408)或其药学上可接受的盐或该化合物的多晶型物(例如本文在上文或下文所述的多晶型物中的任一种)、或包含任何上述实体和药学上可接受的载体的药物组合物(包括例如上述药物组合物)。本发明还涉及上述化合物、多晶型物或药物组合物用于制备用以治疗或预防与炎症或氧化应激相关的病况的药物的用途。在一些实施方案中，所述病况与炎症相关。在其它实施方案中，所述病况与氧化应激相关。在一些实施方案中，所述病况是皮肤疾病或病症、败血症、皮炎、骨关节炎、癌症、炎症、自身免疫性疾病、炎性肠病、因局部或全身暴露于电离辐射所致的并发症、粘膜炎、急性或慢性器官衰竭、肝病、胰腺炎、眼部病症、肺病或糖尿病。
此外，本发明涉及用于治疗或预防选自以下的病况的化合物N-((4aS，6aR，6bS，8aR，12aS，14aR，14bS)-11-氰基-2，2，6a，6b，9，9，12a-七甲基-10，14-二氧代-1，2，3，4，4a，5，6，6a，6b，7，8，8a，9，10，12a，14，14a，14b-十八氢苉-4a-基)-2，2-二氟丙酰胺(或RTA408)或其药学上可接受的盐、或该化合物的多晶型物(例如本文在上文或下文所述的多晶型物中的任一种)、或包含任何上述实体和药学上可接受的载体的药物组合物(包括例如上述药物组合物)：皮肤疾病或病症、败血症、皮炎、骨关节炎、癌症、炎症、自身免疫性疾病、炎性肠病、因局部或全身暴露于电离辐射所致的并发症、粘膜炎、急性或慢性器官衰竭、肝病、胰腺炎、眼部病症、肺病或糖尿病。因此，本发明涉及上述化合物、多晶型物或药物组合物用于制备用以治疗或预防选自以下的病况的药物的用途：皮肤疾病或病症、败血症、皮炎、骨关节炎、癌症、炎症、自身免疫性疾病、炎性肠病、因局部或全身暴露于电离辐射所致的并发症、粘膜炎、急性或慢性器官衰竭、肝病、胰腺炎、眼部病症、肺病或糖尿病。本发明还涉及治疗或预防有需要的患者的选自以下的病况的方法：皮肤疾病或病症、败血症、皮炎、骨关节炎、癌症、炎症、自身免疫性疾病、炎性肠病、因局部或全身暴露于电离辐射所致的并发症、粘膜炎、急性或慢性器官衰竭、肝病、胰腺炎、眼部病症、肺病或糖尿病，所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的上述化合物、多晶型物或药物组合物。在一些实施方案中，所述病况是皮肤疾病或病症，例如皮炎、热烧伤或化学烧伤、慢性创伤、痤疮、脱发、其它毛囊病症、大疱性表皮松解、晒伤、晒伤并发症、皮肤色素沉着病症、衰老相关性皮肤病况；手术后创伤、因皮肤损伤或烧伤所致的瘢痕、银屑病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的皮肤病学表现、皮肤癌、或牵涉到皮肤细胞过度增殖的病症。在一些实施方案中，所述皮肤疾病或病症是皮炎。在一些实施方案中，所述皮炎是过敏性皮炎、特应性皮炎、因化学暴露所致的皮炎、或辐射诱发的皮炎。在其它实施方案中，所述皮肤疾病或病症是慢性创伤。在一些实施方案中，所述慢性创伤是糖尿病性溃疡、褥疮或静脉曲张性溃疡。在其它实施方案中，所述皮肤疾病或病症是脱发。在一些实施方案中，所述脱发选自秃发或药物诱发的脱发。在其它实施方案中，所述皮肤疾病或病症是皮肤色素沉着病症。在一些实施方案中，所述皮肤色素沉着病症是白癜风。在其它实施方案中，所述皮肤疾病或病症是牵涉到皮肤细胞过度增殖的病症。在一些实施方案中，所述牵涉到皮肤细胞过度增殖的病症是角化过度。
在其它实施方案中，所述病况是自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎、狼疮、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、或银屑病。在其它实施方案中，所述病况是肝病，例如脂肪肝病或肝炎。
在其它实施方案中，所述病况是眼部病症，例如葡萄膜炎、黄斑变性、青光眼、糖尿病性黄斑水肿、睑炎、糖尿病性视网膜病变、角膜内皮疾病或病症、手术后炎症、干眼、过敏性结膜炎或一种形式的结膜炎。在一些实施方案中，所述眼部病症是黄斑变性。在一些实施方案中，所述黄斑变性是干性形式。在其它实施方案中，所述黄斑变性是湿性形式。在一些实施方案中，所述角膜内皮疾病或病症是福斯氏角膜内皮营养不良(Fuchs endothelialcorneal dystrophy)。
在其它实施方案中，所述病况是肺病，例如肺部炎症、肺纤维化、COPD、哮喘、囊肿性纤维化或特发性肺纤维化。在一些实施方案中，所述COPD是由香烟的烟雾所诱发的。
在其它实施方案中，所述病况是败血症。在其它实施方案中，所述病况是因放射疗法或化学疗法所致的粘膜炎。在一些实施方案中，所述粘膜炎存在于口腔中。在其它实施方案中，所述病况与暴露于辐射相关。在一些实施方案中，所述辐射暴露导致皮炎。在一些实施方案中，所述辐射暴露是急性的。在其它实施方案中，所述辐射暴露是分次的(fractionated)。
在其它实施方案中，所述病况是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤或***瘤。在其它实施方案中，所述癌症是膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经***癌、子***、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胆囊癌、生殖器癌、泌尿生殖道癌、头部癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、肌肉组织癌、颈部癌、口腔粘膜癌或鼻粘膜癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌、或甲状腺癌。
在一些实施方案中，在用放射疗法或化学疗法对受试者进行治疗之前施用所述药物组合物或之后立即施用所述药物组合物，其中所述化学疗法不包含RTA 408或其多晶型物。在一些实施方案中，在用放射疗法、化学疗法或这两者对受试者进行治疗之前和之后均施用所述药物组合物。在一些实施方案中，所述治疗减少了放射疗法或化学疗法的副作用。在一些实施方案中，所述副作用是粘膜炎和皮炎。在一些实施方案中，所述治疗提高了放射疗法或化学疗法的功效。在一些实施方案中，所述化学疗法包括对患者施用治疗有效量的5-氟尿嘧啶或多西他赛(docetaxel)。
本公开还考虑了另外的组合治疗疗法。举例来说，在一些实施方案中，治疗受试者的癌症的方法包括对所述受试者施用药学有效量的本公开的化合物，所述方法可进一步包括选自由以下各项组成的组的一种或多种治疗：施用药学有效量的第二药物、放射疗法、免疫疗法、基因疗法和手术。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括(1)在使肿瘤细胞与所述第二药物接触之前使所述肿瘤细胞与所述化合物接触，(2)在使肿瘤细胞与所述化合物接触之前使所述肿瘤细胞与所述第二药物接触，或(3)使肿瘤细胞同时与所述化合物和所述第二药物接触。在某些实施方案中，所述第二药物可为抗生素、抗炎剂、抗肿瘤剂、抗增殖剂、抗病毒剂、免疫调节剂或免疫抑制剂。在其它实施方案中，所述第二药物可为烷基化剂、雄激素受体调节剂、细胞骨架破坏剂、***受体调节剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、异戊二烯蛋白转移酶抑制剂、类视色素受体调节剂、拓扑异构酶抑制剂、或酪氨酸激酶抑制剂。在某些实施方案中，所述第二药物是5-阿扎胞苷(5-azacitidine)、5-氟尿嘧啶、9-顺式-视黄酸、放线菌素D(actinomycin D)、阿利维甲酸(alitretinoin)、全反式视黄酸、安那霉素(annamycin)、阿西替尼(axitinib)、贝利司他(belinostat)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝沙罗汀(bexarotene)、博舒替尼(bosutinib)、白消安(busulfan)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、CD437、西地尼布(cediranib)、西妥昔单抗(cetuximab)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、达沙替尼(dasatinib)、道诺霉素(daunorubicin)、地西他滨(decitabine)、多西他赛、多拉司他汀-10(dolastatin-10)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、多柔比星(doxorubicin)、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、厄洛替尼(erlotinib)、依托泊苷(etoposide)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、伊立替康(irinotecan)、异维甲酸(isotretinoin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、拉帕替尼(lapatinib)、LBH589、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、巯嘌呤、甲氨蝶呤(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、MS-275、来那替尼(neratinib)、尼罗替尼(nilotinib)、亚硝基脲、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、普卡霉素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、司马沙尼(semaxanib)、司莫司汀(semustine)、丁酸钠、苯乙酸钠、链脲霉素(streptozotocin)、辛二酰苯胺异羟肟酸、舒尼替尼(sunitinib)、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、塞替派(thiopeta)、硫鸟嘌呤、托泊替康(topotecan)、TRAIL、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、曲古抑菌素A(trichostatin A)、丙戊酸、戊柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、或长春瑞滨(vinorelbine)。
还考虑了治疗或预防受试者的伴有炎症成分的疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用药学有效量的本公开的化合物。在一些实施方案中，所述疾病可为例如狼疮或类风湿性关节炎。在其它实施方案中，所述疾病可为炎性肠病，例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。在其它实施方案中，伴有炎症成分的疾病可为心血管疾病。在其它实施方案中，伴有炎症成分的疾病可为糖尿病，例如1型糖尿病或2型糖尿病。在其它实施方案中，还可使用RTA 408、它的多晶型物和药物组合物来治疗与糖尿病相关的并发症。所述并发症为本领域技术人员所熟知并且包括但不限于例如肥胖、高血压、动脉粥样硬化、冠心病、中风、外周血管疾病、高血压、肾病、神经病变、肌坏死、视网膜病变和代谢综合征(综合征X)。在其它实施方案中，伴有炎症成分的疾病可为皮肤疾病，例如银屑病、痤疮或特应性皮炎。在所述皮肤疾病的治疗方法中施用RTA 408、它的多晶型物和药物组合物可为但不限于例如表面局部施用或口服施用。
在其它实施方案中，伴有炎症成分的疾病可为代谢综合征(综合征X)。患有这种综合征的患者的特征为有选自下组5种症状中的三种或更多种的症状：(1)腹部肥胖；(2)高甘油三酯血症；(3)高密度脂蛋白胆固醇(HDL)低；(4)高血压；以及(5)空腹血糖升高，如果所述患者还患有糖尿病，那么所述空腹血糖可在2型糖尿病特征性的范围内。这些症状中的每一种均在Third Report of the National Cholesterol Education Program ExpertPanel on Detection，Evaluation and Treatment of High Blood Cholesterol inAdults(国家胆固醇教育计划专家小组关于成人高血胆固醇的检测、评价和治疗的第三次报告)(成人治疗小组III或ATP III)，国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)，2001年，NIH出版号01-3670中加以定义，所述报告以引用方式并入本文中。患有代谢综合征的患者无论是否患有或产生显性糖尿病，他们产生上文所列出的伴随2型糖尿病出现的大血管和微血管并发症(例如动脉粥样硬化和冠心病)的风险都会增大。
本公开的另一种一般方法需要一种治疗或预防受试者的心血管疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用药学有效量的本公开的化合物。在一些实施方案中，所述心血管疾病可为但不限于例如动脉粥样硬化、心肌病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心肌炎、风湿性心脏病、瓣膜疾病、冠状动脉疾病、心内膜炎或心肌梗塞。还考虑将组合疗法用于治疗或预防受试者的心血管疾病的方法。举例来说，所述方法可进一步包括施用药学有效量的一种或多种心血管药物。所述心血管药物可为但不限于例如降胆固醇药、抗高血脂药、钙通道阻断剂、抗高血压药或HMG-CoA还原酶抑制剂。在一些实施方案中，心血管药物的非限制性示例包括氨氯地平(amlodipine)、阿司匹林(aspirin)、依泽替米贝(ezetimibe)、非洛地平(felodipine)、拉西地平(lacidipine)、乐卡地平(lercanidipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)或尼群地平(nitrendipine)。在其它实施方案中，心血管药物的其它非限制性示例包括阿替洛尔(atenolol)、布新洛尔(bucindolol)、卡维地洛(carvedilol)、可乐定(clonidine)、多沙唑嗪(doxazosin)、吲哚拉明(indoramin)、拉贝洛尔(labetalol)、甲基多巴(methyldopa)、美托洛尔(metoprolol)、纳多洛尔(nadolol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、酚苄明(phenoxybenzamine)、酚妥拉明(phentolamine)、吲哚洛尔(pindolol)、哌唑嗪(prazosin)、***(propranolol)、特拉唑嗪(terazosin)、噻吗洛尔(timolol)或妥拉唑林(tolazoline)。在其它实施方案中，所述心血管药物可为例如他汀类药物(statin)，例如阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)或辛伐他汀(simvastatin)。
还考虑了治疗或预防受试者的神经变性疾病的方法，所述方法包括对所述受试者施用药学有效量的本公开的化合物。在一些实施方案中，所述神经变性疾病可例如选自由帕金森氏病(Parkinson′s disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、多发性硬化(MS)、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)和肌萎缩侧索硬化组成的组。在具体实施方案中，所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病。在具体实施方案中，所述神经变性疾病是MS，例如原发进展型MS、复发-缓解型MS、继发进展型MS或进展复发型MS。在一些实施方案中，所述受试者可为例如灵长类动物。在一些实施方案中，所述受试者可为人类。
在治疗或预防受试者的神经变性疾病的方法的具体实施方案中，所述方法包括对所述受试者施用药学有效量的本公开的化合物，所述治疗抑制所述受试者的脑或脊髓中的神经元脱髓鞘。在某些实施方案中，所述治疗抑制炎性脱髓鞘。在某些实施方案中，所述治疗抑制所述受试者的脑或脊髓中的神经元轴突横断。在某些实施方案中，所述治疗抑制所述受试者的脑或脊髓中的神经突横断。在某些实施方案中，所述治疗抑制所述受试者的脑或脊髓中的神经元细胞凋亡。在某些实施方案中，所述治疗刺激所述受试者的脑或脊髓中的神经元轴突的髓鞘再生。在某些实施方案中，所述治疗使MS发作后丧失的功能恢复。在某些实施方案中，所述治疗预防新的MS发作。在某些实施方案中，所述治疗预防因MS发作所致的功能缺陷。
本公开的一个一般方面考虑了一种治疗或预防受试者的特征在于iNOS基因过度表达的病症的方法，所述方法包括对所述受试者施用药学有效量的本公开的RTA 408、多晶型物或药物组合物。
本公开的另一个一般方面考虑了一种抑制受试者的细胞中由IFN-γ诱导的一氧化氮产生的方法，所述方法包括对所述受试者施用药学有效量的本公开的RTA 408、多晶型物或药物组合物。
本公开的又另一种一般方法考虑了一种治疗或预防受试者的特征在于COX-2基因过度表达的病症的方法，所述方法包括对所述受试者施用药学有效量的本公开的RTA 408、多晶型物或药物组合物。
还考虑了治疗受试者的肾/肾脏疾病(RKD)的方法，所述方法包括对所述受试者施用药学有效量的本公开的化合物。参见美国专利8,129,429，其以引用方式并入本文中。所述RKD可由例如毒性损害所致。所述毒性损害可由但不限于例如显像剂或药物所引起。所述药物可为例如化学治疗剂。在某些实施方案中，RKD可由缺血/再灌注损伤所致。在某些实施方案中，RKD由糖尿病或高血压所致。在一些实施方案中，RKD可由自身免疫性疾病所致。RKD可进一步被限定为慢性RKD或急性RKD。
在治疗受试者的肾/肾脏疾病(RKD)的某些方法中，所述方法包括对所述受试者施用药学有效量的本公开的化合物，所述受试者已接受透析或正接受透析。在某些实施方案中，所述受试者已接受肾移植或为接受肾移植的候选者。所述受试者可为灵长类动物。所述灵长类动物可为人类。这种方法或任何其它方法中的受试者可为例如奶牛、马、狗、猫、猪、小鼠、大鼠或豚鼠。
本公开还考虑了一种用于提高受试者的肾小球滤过率或肌酸酐清除率的方法，所述方法包括对所述受试者施用药学有效量的本公开的RTA 408、多晶型物或药物组合物。
在一些实施方案中，以每天单次剂量施用所述药物组合物。在其它实施方案中，以每天超过一次剂量施用所述药物组合物。在一些实施方案中，以药学有效量施用所述药物组合物。
在一些实施方案中，所述剂量为约1mg/kg到约2000mg/kg。在其它实施方案中，所述剂量为约3mg/kg到约100mg/kg。在其它实施方案中，所述剂量为约3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg。
在其它实施方案中，表面局部施用所述药物组合物。在一些实施方案中，所述表面局部施用是对皮肤施用。在其它实施方案中，所述表面局部施用是对眼部施用。
在其它实施方案中，口服施用所述药物组合物。在其它实施方案中，眼内施用所述药物组合物。
根据下文的具体实施方式，本公开的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，尽管具体实施方式和具体实施例表明了本发明的具体实施方案，但它们仅是以例证方式给出，这是因为根据此具体实施方式，落入本发明的精神和范围内的各种变化方案和修改方案对于本领域技术人员来说将变得显而易见。应注意，并不仅仅因为某一化合物被归属于一个特定的通式而意味着它不能同时属于另一个通式。
附图说明
以下附图构成了本说明书的一部分并且被包括在内以进一步表明本公开的某些方面。可在附图中见到一个或多个德语单词，包括和“temperatur”，它们分别意指“质量变化”和“温度”。可参考这些附图中的一个附图，结合本文所呈现的具体实施方案的详细说明来更好地理解本发明。
图1：RTA 408对RAW264.7细胞中由IFNγ诱导的一氧化氮产生和细胞活力的作用。
图2a和图2b：RTA 408对抗氧化反应元件(ARE)活化的作用：(a)NQO1-ARE萤光素酶活性；(b)GSTA2-ARE萤光素酶活性。
图3a-f：在用以下物质进行细胞处理后的相对Nrf2 GST ARE的倍数增加：(a)RTA402；(b)63415(RTA 408)；(c)63170；(d)63171；(e)63179；以及(f)63189。所述图表还示出了如使用WST1细胞增殖试剂并在1小时后测量吸光度所测定的细胞活力。所有药物都是在DMSO中施用并且在384孔板中以10,000个细胞/孔在补充有10％FBS、1％青霉素链霉素和0.8mg/mL遗传霉素(Geneticin)的DMEM(低葡萄糖型)中培养细胞。
图4a-d：RTA 408对HFL1肺成纤维细胞中的Nrf2靶基因表达的作用。(a)NQO1；(b)HMOX1；(c)GCLM；(d)TXNRD1。
图5a-d：RTA 408对BEAS-2B支气管上皮细胞中的Nrf2靶基因表达的作用。(a)NQO1；(b)HMOX1；(c)GCLM；(d)TXNRD1。
图6a和图6b：RTA 408对Nrf2靶蛋白水平的作用。(a)SH-SY5Y细胞；(b)BV2细胞。
图7：RTA 408对RAW264.7细胞中的NQO1酶活性的作用。
图8：RTA 408对AML-12肝细胞细胞系中的总谷胱甘肽水平的作用。
图9：RTA 408对作为NADPH标记物的WST-1吸光度的作用。
图10a-d：RTA 408对参与NADPH合成的基因的表达的作用。(a)H6PD；(b)PGD；(c)TKT；(d)ME1。
图11a和图11b：(a)RTA 408对小鼠NIH3T3细胞系中由TNF-α诱导的NF-κB萤光素酶报告基因活化的作用，该图中叠加有WST1活力和WST1/2活力。(b)小鼠NIH3T3细胞系中由TNF-α诱导的NF-κB萤光素酶报告基因活化。所述图表示出了随RTA 408浓度的对数变化而变的相对变化倍数。
图12：RTA 408对TNF-α诱导的NF-κB萤光素酶报告基因构建体活化的作用。
图13a和图13b：(a)RTA 408对人A549细胞系中由TNF-α诱导的NF-κB萤光素酶报告基因活化的作用，该图中叠加有WST1活力和WST1/2活力。(b)人A549细胞系中由TNF-α诱导的NF-κB萤光素酶报告基因活化。所述图表示出了随RTA 408浓度的对数变化而变的相对变化倍数。
图14：RTA 408对TNF-α诱导的IκBα磷酸化的作用。
图15a-d：RTA 408对以下转氨酶基因的表达的作用：(a)ALT1(GPT1)；(b)ALT2(GPT2)；(c)AST1(GOT1)；(d)AST1(GOT2)。星号指示与对照组具有统计显著性差异(*P＜0.05；**P＜0.01)。
图16：RTA 408对培养的肌细胞中的丙酮酸水平的作用(*P＜0.05)。
图17：63415在LPS介导的肺部炎症模型中的作用(相对于LPS处理的促炎性细胞因子的变化％)。在雌性BALB/c小鼠中于时间第0小时、第24小时和第48小时施用化合物63415(QD×3)，之后在最后一次给予63415后的1小时之时施用LPS。在施用LPS后的20小时之时将动物处死。针对促炎性细胞因子的表达对BALF进行检查。化合物63415以剂量依赖性方式减少促炎性细胞因子，其中TNF-α、IL-6和IL-12的最高减少量在50％-80％的范围。
图18a和图18b：RTA 408对LPS诱发的小鼠肺部炎症的作用。(a)炎性细胞因子；(b)Nrf2靶标。在时间第0小时、第24小时、第48小时、第72小时、第96小时和第120小时对雌性BALB/c小鼠(n＝10)施用RTA 408(QD×6)，之后在第121小时施用LPS，在第141小时将动物处死。测定BALF中的促炎性细胞因子蛋白表达。测定肺中的Nrf2生物标记物。星号指示与盐水对照组具有统计显著性差异(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001)。
图19a和19b：63415对博来霉素(bleomycin)诱发的肺部炎症中的BALF浸润的作用：(a)BAL液细胞计数；(b)体重。在C57BL/6小鼠中在第-10天到第28天施用化合物63415(QD×39)。在第0天给予博来霉素。每日测量体重。在处死时获得BALF细胞计数。观察到炎性浸润显著减少。没有观察到慢性炎症评分、间质性纤维化或纤维化病灶数方面有显著改善。
图20a和20b：RTA 408对博来霉素诱发的大鼠肺纤维化的作用：(a)PMN；(b)羟脯氨酸。星号指示与博来霉素对照组具有统计显著性差异(*P＜0.05)。
图21：RTA 408对来自患有博来霉素诱发的肺纤维化的大鼠的肺中的Nrf2靶酶的作用。星号指示与盐水对照组具有统计显著性差异(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001)。
图22a-e：RTA 408对香烟烟雾诱发的小鼠COPD的作用。(a)KC；(b)IL-6；(c)TNF-α；(d)IFN-γ；(e)RANTES。以3mg/kg(低剂量)、10mg/kg(中剂量)和30mg/kg(高剂量)的剂量水平测试RTA 408(63415)。在同一研究中测试AIM类似物(63355)以用于比较。星号指示与CS对照组具有统计显著性差异。
图23：RTA 408对来自患有香烟烟雾诱发的COPD的小鼠的肺中的Nrf2靶酶的作用。星号指示与盐水对照组具有统计显著性差异(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001)。剑号表示与暴露于香烟烟雾并且接受媒介物(vehicle)施用的小鼠具有统计显著性差异(P＜0.05)。
图24a-d：63415(RTA 408)对BALB/c小鼠败血症模型的体重的作用。在第0天对所有动物施用LPS。(a)体重：63415(RTA 408)；(b)体重：RTA 405；(c)全身性LPS：存活％：63415(RTA 408)；(d)全身性LPS：存活％：RTA 405。在第-2天到第2天施用RTA 405和63415(RTA 408)这两者(QD×5)。化合物63415(RTA 408)提高了存活率。在63415处理BALB/c小鼠中作为时间的函数的体重充当败血症模型。
图25：63415在辐射诱发的口腔粘膜炎模型中的作用。在第-5天到第-1天和第1天到第15天对雄性叙利亚金仓鼠(Syrian Golden Hamster)施用RTA 405或63415(RTA 408)(BID×20)。在第0天进行辐射。粘膜炎评分基于临床表现在0到5分的范围(0分：完全健康；1-2分：轻度到重度红斑；3-5分：不同程度的溃疡)。63415在30mg/kg和100mg/kg改善了粘膜炎，其中使溃疡减少最高达36％。
图26：63415在对C57BL/6小鼠进行的14天小鼠毒性研究中对Nrf2靶基因诱导的作用。在接受经口处理(QD×14)的小鼠的肝中评估Nrf2靶基因的mRNA。观察到多种Nrf2靶基因的mRNA表达显著增加并且与组织暴露一致。
图27a和27b：63415对大鼠肝中的Nrf2靶基因诱导的作用：(a)靶基因；(b)负调节物。在接受经口处理(QD×14)的大鼠的肝中评估Nrf2靶基因的mRNA。
图28a和28b：63415对猴组织中的Nrf2靶基因的作用：(a)肝；(b)肺。使用Panomics2.0Plex技术在接受经口处理(QD×14)的猴中评估Nrf2靶基因的mRNA。
图29a和29b：63415对小鼠肝中的Nrf2靶酶活性的作用：(a)NQO1活性；(b)GST活性。在接受经口处理(QD×14)的小鼠的肝中评估Nrf2靶酶活性。以剂量依赖性方式诱导了NQO1和GST的酶活性。
图30a和30b：63415对大鼠肝中的Nrf2靶酶活性的作用：(a)NQO1活性；(b)GST活性。在接受经口处理(QD×14)的大鼠的肝中评估Nrf2靶酶活性。以剂量依赖性方式诱导了NQO1和GST的酶活性。
图31a和图31b：63415对食蟹猴的不同组织中的Nrf2靶酶活性诱导的作用：(a)NQO1活性；(b)GSR活性。
图32a和图32b：在14天的每天经口施用后RTA 408在小鼠肝、肺和脑中的浓度以及在小鼠肝中的NQO1活性。(a)在14天的每天经口施用后RTA 408在小鼠中的组织分布。数据表示在所述研究的末次给药后的4小时之时收集的组织中RTA 408浓度的平均值±SD。误差棒上方的数字表示平均值。(b)小鼠肝RTA 408含量与NQO1酶活性的相关性。相对于来自这一报告的单个酶活性来标绘单个小鼠肝RTA 408肝含量。
图33a和图33b：在14天的每天经口施用后RTA 408在大鼠血浆、肝、肺和脑中的浓度以及在大鼠肝中的NQO1活性。(a)在14天的每天经口施用后RTA 408在大鼠中的组织分布。数据表示在所述研究的末次给药后的4小时之时收集的组织中RTA 408浓度的平均值±SD。误差棒上方的数字表示平均值。*这两个值由于是异常值而被排除在平均值计算以外，所述异常值被定义为使数据组未能通过夏皮洛-威尔克正态性检验(Shapiro-Wilknormality test)的值。(b)大鼠肝RTA 408含量与NQO1酶活性的相关性。相对于来自这一报告的单个酶活性来标绘单个大鼠肝RTA 408含量。在第6天收集来自100mg/kg RTA 408剂量组的组织，并且在这一组中所观察到的毒性使得不可能对肝NQO1酶活性进行评价。
图34a和图34b：63415处理对猴PBMC中的Nrf2活化的作用：(a)PBMC NQO1相对于血浆浓度；(b)肺NQO1相对于PBMC NQO1。
图35：63415的14天猴毒性研究的概要。所有剂量均被良好耐受而没有不利的临床体征。临床化学数据表明没有明显的毒性。
图36：给药时间对在表面局部眼部施用和经口施用后RTA 408的血浆浓度的作用。还在5天的每天表面局部眼部施用RTA 408后测量RTA 408的血浆浓度并且测得所述血浆浓度与在第一天后获得的测量结果保持相对一致。
图37a和图37b：猴血浆中对RTA 408的暴露与PBMC中NQO1和SRXN1的mRNA表达的相关性：(a)NQO1；(b)SRXN1。
图38：在5天的表面局部眼部给药后随时间而变的RTA 408在眼内不同的组织或液体中的浓度。还在表面局部眼部施用后测量了血浆中的RTA408浓度。
图39：对于不同浓度的表面局部施用的RTA 408，RTA 408对由急性辐射暴露引起的3级皮炎的发生率的作用。
图40：对于不同浓度的表面局部施用的RTA 408，经过30天处理过程RTA 408对由急性辐射暴露引起的2级皮炎的发生率的作用。
图41：对于不同浓度的经口施用的RTA 408，经过28天处理过程RTA408对由急性辐射暴露引起的2级皮炎的发生率的作用。
图42a和图42b：(a)不同对照组中的每一组随时间而变的皮炎临床评分的曲线下面积分析，所述组包括所述测试中所用的所有动物。(b)不同对照组中的每一组随皮炎临床评分的持续时间而变的该评分的曲线下面积分析，所述组仅包括所述试验中完成整个30天的动物。
图43：在未处理、未处理且没有暴露于辐射、单独媒介物和三种口服量(3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)的RTA 408的情况下随时间而变的急性辐射性皮炎的平均第1盲法评分。所述皮炎评分基于以下量表：0分是完全健康的，1-2分表示轻度到中度的红斑伴有最小程度到轻微的脱皮，3-4分表示中度到重度的红斑和脱皮，并且5分表示明显的溃疡。
图44：在未处理、未处理且没有暴露于辐射、单独媒介物和三种口服量(3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)的RTA 408的情况下从第4天到第30天每隔一天测量的随时间而变的急性辐射性皮炎的平均评分。所述皮炎评分基于以下量表：0分是完全健康的，1-2分表示轻度到中度的红斑伴有最小程度到轻微的脱皮，3-4分表示中度到重度的红斑和脱皮，并且5分表示明显的溃疡。
图45：在未处理、未处理且没有暴露于辐射、单独媒介物和三种表面局部量(0.01％、0.1％和1％)的RTA 408的情况下从第4天到第30天每隔一天测量的随时间而变的急性辐射性皮炎的平均评分。所述皮炎评分基于以下量表：0分是完全健康的，1-2分表示轻度到中度的红斑伴有最小程度到轻微的脱皮，3-4分表示中度到重度的红斑和脱皮，并且5分表示明显的溃疡。
图46：对于每个测试组所绘制的分次辐射性皮炎的临床评分与时间的关系曲线以及皮炎评分的变化。所述皮炎评分基于以下量表：0分是完全健康的，1-2分表示轻度到中度的红斑伴有最小程度到轻微的脱皮，3-4分表示中度到重度的红斑和脱皮，并且5分表示明显的溃疡。
图47：示出了每个测试组在整个观察期内的皮炎评分(严重程度×天数)的AUC分析的图表。从所述研究的第4天到第30天每两天评估所述皮炎评分。
图48a和图48b：(a)被处理的***癌细胞系LNCaP在595nm的吸光度的图表，示出了相对于单独的RTA 408对用化学治疗剂和RTA 408处理的细胞的相对细胞毒性作用。(b)被处理的***癌细胞系DU-145在595nm的吸光度的图表，示出了相对于单独的RTA 408对用化学治疗剂和RTA408处理的细胞的相对细胞毒性作用。
图49：示出了以下三只小鼠的肿瘤的萤光素酶活性的被成像小鼠的彩色照片的黑白版本：没有接受处理的对照动物、仅经受电离辐射(单次剂量，18Gy)的动物和给予电离辐射(单次剂量，18Gy，第0天)与RTA 408(17.5mg/kg，腹膜内，在第-3天到第-1天每天一次，然后在第1天、第3天和第5天给予单次剂量)的动物。由箭头指示的颜色指示强度，其中所述强度按最高强度到最低强度的顺序以红色、黄色、绿色和蓝色表示。
图50：与(0.1％***(dexamethasone))和马普拉科拉特(mapracorat)(浅色条柱)的文献值相比，在穿刺术诱导后在RTA 408的不同制剂(深色条柱)的情况下房水蛋白浓度的降低。
图51：63415在体内对NO的剂量依赖性抑制作用。通过经口灌胃对CD-1小鼠(n＝6)给予DMSO或AIM。在24小时后施用LPS(5mg/kg)。在施用LPS后的24小时之时，收集全血用于NO测定。通过格里斯反应(Griess Reaction)用还原的脱蛋白血浆来确定NO抑制作用。
图52：63415(RTA 408)在小鼠组织中的广泛分布。对小鼠经口给予(QD×3)25mg/kg 63415(RTA 408)或25mg/kg RTA 405。在最后一次给药后的6小时之时收集血液(血浆和全血)和组织(脑、肝、肺和肾)。进行药物含量的半定量分析。在CNS中观察到显著水平。
图53：63415对小鼠肝、肺和肾中的NQO1活性的诱导。以25mg/kg对小鼠经口给予(QD×3)。在最后一次给药后的6小时之时收集组织，并且进行NQO1活性的分析。在多种组织中观察到有意义的NQO1活化。
图54：63415的14天小鼠毒性研究的概要。对C57BL/6小鼠经口给药(QD×14)。终点包括存活率、体重和临床化学。所有动物都存活到第14天。相比于媒介物组，没有出现显著的体重变化，并且基于临床化学在任何剂量都没有毒性迹象。
图55：来自14天小鼠毒性研究的63415在C57BL/6小鼠中的组织分布。在末次给药后的4小时之时收集脑、肺和肝样品并且使用灵敏的LC/MS/MS方法对63415含量进行定量。在10mg/kg和100mg/kg下在肺中的暴露分别是NO诱导的体外IC50的55倍和1138倍。在10mg/kg和100mg/kg下在脑中的暴露分别是NO诱导的体外IC50的29倍和541倍。
图56：63415在斯普拉格-道利(Sprague Dawley)大鼠中的组织分布。在第14天或第6天进行末次给药(100mg/kg)后的4小时之时收集组织，进行提取，并且使用灵敏的LC/MS/MS方法对63415含量进行定量。化合物63415良好地分布到靶组织中。在10mg/kg下在肺和脑中的暴露分别是NO抑制的体外IC50的294倍和240倍。
图57：化合物63415在食蟹猴中的靶组织分布。在第14天进行末次给药后的4小时之时收集组织。对化合物63415含量进行提取并且使用灵敏的LC/MS/MS方法进行定量。
图58：对应于非晶形形式(类别1)的样品PP415-P1的FT-拉曼(Raman)光谱(3400-50cm-1)。
图59：对应于非晶形形式(类别1)的样品PP415-P1的PXRD(1.5°-55.5°2θ)图谱。
图60：对应于非晶形形式(类别1)的样品PP415-P1的TG-FTIR温谱图(25℃-350℃)。
图61：对应于非晶形形式(类别1)的样品PP415-P1在DMSO-d6中的1H-NMR谱。
图62：对应于非晶形形式(类别1)的样品PP415-P1的DSC温谱图。
图63：对应于非晶形形式(类别1)的样品PP415-P1的DVS等温线。
图64：在DVS测量后对应于非晶形形式(类别1)的样品PP415-P1的FT-拉曼光谱(顶部)相比于在DVS测量前该物质的FT-拉曼光谱(底部)无变化。已将所述光谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图65：在DVS测量后对应于非晶形形式(类别1)的样品PP415-P1的PXRD图谱(顶部)相比于在DVS测量前该物质的PXRD图谱(底部)无变化。未将所述图谱按比例缩放，但将其在y轴方向上偏移以进行比较。
图66：样品PP415-P40的PXRD图谱(顶部)对应于溶剂化物形式(类别2)(底部，样品PP415-P19)的图谱。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图67：在一周后对应于非晶形形式(类别1)的稳定性样品PP415-P2a(顶部)、PP415-P3a(从顶部起第二个)、PP415-P4a(中间)和PP415-P5a(从底部起第二个)的PXRD图谱未显示出与起始物质(底部，样品PP415-P1)在时间点t0的PXRD图谱相比有差异。未将所述图谱按比例缩放，但将其在y轴方向上偏移以进行比较。
图68：在两周后对应于非晶形形式(类别1)的稳定性样品PP415-P2b(顶部)、PP415-P3b(从顶部起第二个)、PP415-P4b(中间)和PP415-P5b(从底部起第二个)的PXRD图谱未显示出与起始物质(底部，样品PP415-P1)在时间点t0的PXRD图谱相比有差异。未将所述图谱按比例缩放，但将其在y轴方向上偏移以进行比较。
图69：在四周后对应于非晶形形式(类别1)的稳定性样品PP415-P2c(顶部)、PP415-P3c(从顶部起第二个)、PP415-P4c(中间)和PP415-P5c(从底部起第二个)的PXRD图谱未显示出与起始物质(底部，样品PP415-P1)在时间点t0的PXRD图谱相比有差异。未将所述图谱按比例缩放，但将其在y轴方向上偏移以进行比较。
图70：溶剂化物形式(类别2)的样品(PP415-P7：顶部；PP415-P8：从顶部起第二个；PP415-P9：从顶部起第三个；PP415-P10：从顶部起第四个；PP415-P11：中间；PP415-P15：从底部起第四个；PP415-P17：从底部起第三个；PP415-P21：从底部起第二个；PP415-P24：底部)的FT-拉曼光谱(2400-50cm-1)。已将所述光谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图71：溶剂化物形式(类别2)(PP415-P7：顶部)的FT-拉曼光谱(1750-1000cm-1)明显不同于非晶形形式(类别1)(PP415-P1：底部)的光谱。已将所述光谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图72：类别2(样品PP415-P19：顶部)、类别3(样品PP415-P6：从顶部起第二个)、类别4(样品PP415-P13：从底部起第二个)和类别5(样品PP415-P14：底部)的FT-拉曼光谱(1750-1000cm-1)彼此显著不同。已将所述光谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图73：溶剂化物形式(类别2)的样品(PP415-P7：顶部；PP415-P8：从顶部起第二个；PP415-P10：从顶部起第三个；PP415-P15：从顶部起第四个；PP415-P17：中间；PP415-P18：从底部起第四个；PP415-P19：从底部起第三个；PP415-P21：从底部起第二个；PP415-P24：底部)的PXRD图谱(2°-32°2θ)。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图74：溶剂化物形式(类别2)的一些样品(PP415-P7：顶部；PP415-P8：从顶部起第二个；PP415-P10：中间；PP415-P21：从底部起第二个；PP415-P24：底部)的PXRD图谱(11°-21°2θ)。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图75：类别2(样品PP415-P19：顶部)、类别3(样品PP415-P6：从顶部起第二个)、类别4(样品PP415-P13：从底部起第二个)和类别5(样品PP415-P14：底部)的PXRD图谱(2°-32°2θ)是截然不同的。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图76：对应于溶剂化物形式(类别2)的样品PP415-P7的TG-FTIR温谱图。
图77：对应于溶剂化物形式(类别2)的样品PP415-P21的TG-FTIR温谱图。
图78：对应于溶剂化物形式(类别2)的样品PP415-P24的TG-FTIR温谱图。
图79：对应于溶剂化物形式(类别2)的样品PP415-P29的TG-FTIR温谱图。
图80：对应于溶剂化物形式(类别2)的样品PP415-P47的TG-FTIR温谱图。
图81：对应于溶剂化物形式(类别2)的样品PP415-P48的TG-FTIR温谱图。
图82：溶剂化物形式(类别2)(底部，样品PP415-P7)和干燥的溶剂化物形式(类别2)(顶部，样品PP415-P30)的FT-拉曼光谱(1800-700cm-1)是类似的并且仅显示出在所述图表内几乎不能辨别的小差异。将所述光谱按比例缩放以进行比较。
图83：干燥的溶剂化物形式(类别2)的样品PP415-P30的PXRD图谱(顶部)与溶剂化物形式(类别2)的样品PP415-P7的图谱(底部)的比较。未将所述图谱按比例缩放，但将其在y轴方向上偏移以进行比较。
图84：对应于溶剂化物形式(类别2)的干燥样品PP415-P30的TG-FTIR温谱图。
图85：干燥样品PP415-P18(浅灰色)的FT-拉曼光谱与原始样品PP415-P15(深灰色)的光谱相似并且仅显示出在所述图表内几乎不能辨别的小差异。已将所述光谱按比例缩放以进行比较。
图86：干燥样品PP415-P18的PXRD图谱(顶部)显示出与原始样品PP415-P15的图谱(底部)存在小差异，尽管它们都是溶剂化物形式(类别2)。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图87：对应于溶剂化物形式(类别2)的样品PP415-P18的TG-FTIR温谱图。
图88：样品PP415-P17(顶部)的FT-拉曼光谱与干燥样品PP415-P19(中间)和PP415-P32(底部)的光谱几乎相同并且仅显示出在所述图表内几乎不能辨别的小差异。已将所述光谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图89：干燥样品PP415-P19(中间)的PXRD图谱不同于原始样品PP415-P17(顶部)的图谱，但仍对应于类别2形式。进一步干燥的样品PP415-P32(底部)的图谱显示出具有更低S/N比率的更宽的峰。所述物质虽然更低程度结晶，但仍对应于类别2形式。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图90：对应于溶剂化物形式(类别2)的样品PP415-P19的TG-FTIR温谱图。
图91：对应于溶剂化物形式(类别2)的样品PP415-P32A的TG-FTIR温谱图。
图92：样品PP415-P21(顶部)的FT-拉曼光谱与干燥样品PP415-P28(中间)和PP415-P34(底部)的光谱相同。已将所述光谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图93：干燥样品PP415-P28(中间)和PP415-P34(底部)的PXRD图谱与原始样品PP415-P21(顶部)的图谱相比显示出具有更低S/N比率的更宽的峰，指示所述样品的结晶度更低。所述图谱略有不同，但仍对应于类别2形式。已将它们按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图94：对应于溶剂化物形式(类别2)的干燥样品PP415-P28的TG-FTIR温谱图。
图95：对应于溶剂化物形式(类别2)的干燥样品PP415-P34的TG-FTIR温谱图。
图96：溶剂化物形式(类别3)的样品(PP415-P6：顶部；PP415-P12：中间；PP415-P20：底部)的FT-拉曼光谱(2400-50cm-1)。已将所述光谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图97：溶剂化物形式(类别3)的样品(PP415-P6：顶部；PP415-P12：从顶部起第二个；PP415-P20：从底部起第二个)的FT-拉曼光谱(1750-1000cm-1)彼此非常类似，仅有小的差异，例如在约1690cm-1处，但明显不同于类别1(PP415-P1：底部)的FT-拉曼光谱。已将所述光谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图98：溶剂化物形式(类别3)的样品(PP415-P6：顶部；PP415-P12：中间；PP415-P20：底部)的PXRD图谱(2°-32°2θ)。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图99：溶剂化物形式(类别3)的样品(PP415-P6：顶部；PP415-P12：中间；PP415-P20：底部)的PXRD图谱(13.5°-18.5°2θ)显示出小的差异。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图100：对应于溶剂化物形式(类别3)的样品PP415-P6的TG-FTIR温谱图。
图101：对应于溶剂化物形式(类别3)的样品PP415-P12的TG-FTIR温谱图。
图102：干燥的溶剂化物形式(类别3)的样品PP415-P25的TG-FTIR温谱图。
图103：进一步干燥的溶剂化物形式(类别3)的样品PP415-P33的TG-FTIR温谱图。
图104：溶剂化物形式(类别3)(顶部，样品PP415-P6)、干燥的溶剂化物形式(类别3)(中间，样品PP415-P25)和进一步干燥的溶剂化物形式(类别3)(底部，样品PP415-P33)的FT-拉曼光谱(1800-700cm-1)是相同的。已将所述光谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图105：溶剂化物形式(类别3)(顶部，样品PP415-P6)、干燥的溶剂化物形式(类别3)(中间，样品PP415-P25)和进一步干燥的溶剂化物形式(类别3)(底部，样品PP415-P33)的PXRD图谱(4°-24°2θ)。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图106：对应于乙腈溶剂化物形式(类别4)的样品PP415-P13的TG-FTIR温谱图。
图107：乙腈溶剂化物形式(类别4)(深灰色，样品PP415-P13)和乙腈溶剂化物形式(类别4)的干燥物质(浅灰色，样品PP415-P26)的FT-拉曼光谱(1800-700cm-1)是相同的并且完全重叠。已将所述光谱按比例缩放以进行比较。
图108：干燥的乙腈溶剂化物形式(类别4)的样品PP415-P26(底部)的PXRD图谱与乙腈溶剂化物形式(类别4)的样品PP415-P13(顶部)的参考图谱的比较。未将所述图谱按比例缩放，但将其在y轴方向上偏移以进行比较。
图109：干燥的乙腈溶剂化物形式(类别4)的样品PP415-P26的TG-FTIR温谱图。
图110：乙腈溶剂化物形式(类别4)(顶部，样品PP415-P35)和干燥的乙腈溶剂化物形式(类别4)(中间：样品PP415-P36，和底部：样品PP415-P37)的FT-拉曼光谱(1800-700cm-1)彼此对应。已将所述光谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图111：乙腈溶剂化物形式(类别4)(顶部，样品PP415-P35)和干燥的乙腈溶剂化物形式(类别4)(中间：样品PP415-P36，和底部：样品PP415-P37)的PXRD图谱(4°-24°2θ)彼此一致。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图112：干燥的乙腈溶剂化物形式(类别4)的样品PP415-P36的TG-FTIR温谱图。
图113：干燥的乙腈溶剂化物形式(类别4)的样品PP415-P37的TG-FTIR温谱图。
图114：去溶剂化的乙腈溶剂化物形式(类别4)(样品PP415-P37)的DVS等温线。
图115：在DVS测量后样品PP415-P37(乙腈溶剂化物形式(类别4))的PXRD图谱(底部)相比于在DVS测量前该物质的PXRD图谱(顶部)无变化。未将所述图谱按比例缩放，但将其在y轴方向上偏移以进行比较。
图116：去溶剂化的乙腈溶剂化物形式(类别4)(样品PP415-P37)的DSC温谱图。
图117：非晶形形式(类别1)的样品PP415-P1与去溶剂化的乙腈溶剂化物形式(类别4)的样品PP415-P36的约1∶1混合物的DSC温谱图。
图118：非晶形形式(类别1)的样品PP415-P1与去溶剂化的乙腈溶剂化物形式(类别4)的样品PP415-P36的约1∶1混合物(实验编号：PP415-P39)的DSC温谱图。将加热扫描(步骤1)在173℃停止30分钟(步骤2)，然后继续进行(步骤3)。
图119：对应于THF溶剂化物形式(类别5)的样品PP415-P14的TG-FTIR温谱图。
图120：THF溶剂化物形式(类别5)(短划线，样品PP415-P14)、THF溶剂化物形式(类别5)的干燥物质(点线，样品PP415-P27)和非晶形形式(类别1)(实线，样品PP415-P1)的FT-拉曼光谱(1800-1100cm-1)。已将所述光谱按比例缩放以进行比较并且这些光谱在量值上显示出小的变化，但在谱形上几乎没有显示出相应的变化。
图121：干燥的THF溶剂化物形式(类别5)的样品PP415-P27(顶部)的PXRD图谱与THF溶剂化物形式(类别5)的样品PP415-P14(底部)的图谱的比较。未将所述图谱按比例缩放，但将其在y轴方向上偏移以进行比较。
图122：对应于干燥的THF溶剂化物(类别5)的样品PP415-P27的TG-FTIR温谱图。
图123：样品PP415-P41(顶部)的PXRD图谱对应于THF溶剂化物形式(类别5)(中间，样品PP415-P14)的图谱且不对应于庚烷溶剂化物形式(类别2)(底部，样品PP415-P19)的图谱。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图124：样品PP415-P45(顶部)的PXRD图谱对应于THF溶剂化物形式(类别5)(中间，样品PP415-P14)的图谱且不对应于庚烷溶剂化物形式(类别2)(底部，样品PP415-P19)的图谱。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图125：样品PP415-P41(顶部)的PXRD图谱对应于THF溶剂化物形式(类别5)。在将样品PP415-P41干燥1天后(从顶部起第二个，样品：PP415-P44)，所述物质主要为非晶形的。保留一些具有低强度的宽峰。在进一步干燥过夜后(从底部起第二个，样品PP415-P44a)，这些宽峰的强度进一步降低。非晶形形式(类别1)被示为参考(底部，样品：PP415-P42)。未将所述图谱按比例缩放，但将其在y轴方向上偏移以进行比较。
图126：对应于非晶形形式(类别1)的样品PP415-P44a的TG-FTIR温谱图。
图127：样品PP415-P45(顶部)的PXRD图谱对应于THF溶剂化物形式(类别5)。在将样品PP415-P45干燥1天后(从顶部起第二个，样品PP415-P46)，所述物质主要为非晶形的。保留一些具有低强度的宽峰。在干燥总共4天后(从底部起第二个，样品PP415-P46a)，图谱保持不变。非晶形形式(类别1)被示为参考(底部，样品PP415-P42)。未将所述图谱按比例缩放，但将其在y轴方向上偏移以进行比较。
图128：对应于非晶形形式(类别1)的样品PP415-P46a的TG-FTIR温谱图。
图129：样品PP415-P42(顶部)的PXRD图谱对应于非晶形形式(类别1)(底部，样品PP415-P1)的图谱。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图130：样品PP415-P43(顶部)的PXRD图谱对应于同构的溶剂化物形式(类别2)(底部，样品PP415-P19)的图谱且不对应于THF溶剂化物形式(类别5)(中间，样品PP415-P14)的图谱。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图131：样品PP415-P47(顶部)和PP415-P48(中间)的PXRD图谱基本上对应于同构的溶剂化物形式(类别2)(底部，样品PP415-P19)的图谱，但仍有一些差异。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
图132：样品PP415-P49(顶部)的PXRD图谱对应于非晶形形式(类别1)(底部，样品PP415-P1)的图谱。已将所述图谱按比例缩放并且在y轴方向上偏移以进行比较。
具体实施方式
在一个方面，本发明提供以下化合物：
N-((4aS，6aR，6bS，8aR，12aS，14aR，14bS)-11-氰基-2，2，6a，6b，9，9，12a-七甲基-10，14-二氧代-1，2，3，4，4a，5，6，6a，6b，7，8，8a，9，10，12a，14，14a，14b-十八氢苉-4a-基)-2，2-二氟丙酰胺，其在本文中也被称作RTA 408、63415或PP415。在其它非限制性方面，本发明还提供其多晶型物，包括其溶剂化物。在其它非限制性方面，本发明还提供其药学上可接受的盐。在其它非限制性方面，还提供这些化合物和其多晶型物的制备方法、药物组合物以及试剂盒和制品。
I.定义
当在化学基团的情况下使用时：“氢”意指-H；“羟基”意指-OH；“氧代”意指＝O；“羰基”意指-C(＝O)-；“羧基”意指-C(＝O)OH(还被写成-COOH或-CO2H)；“卤代”独立地意指-F、-Cl、-Br或-I；“氨基”意指-NH2；“羟基氨基”意指-NHOH；“硝基”意指-NO2；亚氨基意指＝NH；“氰基”意指-CN；“异氰酸酯基”意指-N＝C＝O；“叠氮基”意指-N3；在单价的情况下，“磷酸酯基”意指-OP(O)(OH)2或其去质子化形式；在二价的情况下，“磷酸酯基”意指-OP(O)(OH)O-或其去质子化形式；“巯基”意指-SH；并且“硫代”意指＝S；“磺酰基”意指-S(O)2-；并且“亚磺酰基”意指-S(O)-。本申请中所示结构的原子上任何未限定的化合价均隐含地表示键合到所述原子的氢原子。
在本公开的上下文中，下式：
表示相同的结构。当在碳上绘有点时，所述点表示连接到该碳的氢原子是从该页面的平面向外伸出。
所用的词语“a”或“an”，当在权利要求书和/或说明书中结合术语“包含”使用时，可意指“一个(种)”，但它还与“一个(种)或多个(种)”、“至少一个(种)”和“一个(种)或多于一个(种)”的含义一致。
在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括用于测定所述值的装置、方法的误差的固有变异、或研究受试者之间存在的变异。当在X射线粉末衍射的情况下使用时，术语“约”用于指示报告值±0.2°2θ的值，优选报告值±0.1°2θ的值。当在差示扫描量热或玻璃转化温度的情况下使用时，术语“约”用于指示相对于峰的最大值±10℃的值，优选相对于峰的最大值±2℃的值。当在其它情况下使用时，术语“约”用于指示报告值±10％的值，优选报告值±5％的值。应当理解的是，每当使用术语“约”时，也包括对所示的确切数值的具体提及。
术语“包含(comprise)”、“具有(have)”和“包括(include)”是开放式连系动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”，也是开放式的。举例来说，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法并不限于仅具有那一个或多个步骤并且还涵盖其它未列出的步骤。
当术语“有效的”在本说明书和/或权利要求书中使用时，所述术语意指足以实现期望的、预期的或想要的结果。当在用化合物治疗患者或受试者的情况下使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”意指所述化合物在对受试者或患者施用以治疗疾病时足以实现所述对疾病的治疗作用的量。
在X射线粉末衍射的情况下，术语“晕峰”将意指宽峰，它在X射线粉末衍射图中常常跨越＞10°2θ，通常为非晶形固体或***的特征。
术语“水合物”在被用作化合物的修饰语时，意指所述化合物具有少于一个(例如半水合物)、一个(例如一水合物)或多于一个(例如二水合物)与每个化合物分子(例如固体形式的所述化合物)缔合的水分子。
如本文所使用的术语“IC50”是指获得最大反应的50％的抑制剂量。该定量量度指示将给定的生物过程、生物化学过程或化学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半所需的某一药物或其它物质(抑制剂)的量。
第一化合物的“异构体”是每个分子均含有与所述第一化合物相同的构成原子、但那些原子的三维构型不同的另外的化合物。
如本文所使用的术语“患者”或“受试者”是指活的哺乳动物生物体，例如人类、猴、奶牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，患者或受试者是非人类动物。在某些实施方案中，患者或受试者是灵长类动物。在某些实施方案中，患者或受试者是人类。人类受试者的非限制性示例是成人、青少年、婴儿和胎儿。
如本文所一般使用的“药学上可接受的”是指那些在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触而无过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症、与合理的效益/风险比相称的化合物、物质、组合物和/或剂型。
“药学上可接受的盐”意指如上文所定义的药学上可接受的并且具有期望的药理学活性的本发明化合物的盐。所述盐包括与例如以下的无机酸形成的酸加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与例如以下的有机酸形成的酸加成盐：1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4，4′-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、乙酸、脂族单羧酸和脂族二羧酸、脂族硫酸、芳族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟基萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、邻-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对-氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对-甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。药学上可接受的盐还包括可在存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应时形成的碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等。应当认识到，形成本发明的任何盐的一部分的具体阴离子或阳离子并不重要，只要所述盐总体上是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐和它们的制备方法与使用方法的另外的示例呈现于Handbook ofPharmaceutical Salts：Properties，and Use(《药用盐手册：性质和使用》)(P.H.Stahl和C.G.Wermuth编辑，Verlag Helvetica Chimica Acta，2002)中。
“预防(prevention/preventing)”包括：(1)抑制受试者或患者的疾病发作，所述受试者或患者可能有患所述疾病的风险和/或易患所述疾病，但尚未经历或表现出所述疾病的任何或所有病状或症状；和/或(2)减缓受试者或患者的疾病的病状或症状发作，所述受试者或患者可能有患所述疾病的风险和/或易患所述疾病，但尚未经历或表现出所述疾病的任何或所有病状或症状。
“前药”意指可在体内以代谢方式转化成本发明的抑制剂的化合物。前药本身也可能对或可能不对给定的靶蛋白具有活性。举例来说，包含羟基的化合物可以以通过在体内水解而转化成羟基化合物的酯的形式施用。可在体内转化成羟基化合物的合适的酯包括乙酸酯、柠檬酸酯、乳酸酯、磷酸酯、酒石酸酯、丙二酸酯、草酸酯、水杨酸酯、丙酸酯、琥珀酸酯、富马酸酯、马来酸酯、亚甲基-双-β-羟基萘甲酸酯、龙胆酸酯、羟乙磺酸酯、二-对-甲苯酰基酒石酸酯、甲磺酸酯、乙磺酸酯、苯磺酸酯、对-甲苯磺酸酯、环己基氨基磺酸酯、奎尼酸酯(quinate)、氨基酸酯等。类似地，包含胺基的化合物可以以通过在体内水解而转化成胺化合物的酰胺形式施用。
“立体异构体”或“旋光异构体”是给定化合物的以下异构体，在所述异构体中，相同的原子键合到相同的其它原子上，但那些原子的三维构型不同。“对映体”是给定化合物的像左手和右手一样互为镜像的立体异构体。“非对映体”是给定化合物的并非对映体的立体异构体。手性分子含有手性中心，也被称作立构中心或立体异构源性(stereogenic)中心，所述中心是带有基团的分子中使得任何两个基团的互换产生立体异构体的任何点，但不一定为原子。在有机化合物中，手性中心通常为碳原子、磷原子或硫原子，但在有机化合物和无机化合物中，其它原子也可能为立构中心。分子可具有多个立构中心，从而使其具有许多立体异构体。在立体异构现象归因于四面体立体异构源性中心(例如四面体碳)的化合物中，假设可能的立体异构体的总数将不超过2n，其中n是四面体立构中心的数目。具有对称性的分子通常具有少于最大可能数目的立体异构体。对映体的50∶50混合物被称作外消旋混合物。或者，对映体的混合物可以是对映体富集的，使得一种对映体以大于50％的量存在。通常，可使用本领域已知的技术来拆分或分离对映体和/或非对映体。考虑到的是，对于尚未确定立体化学的任何立构中心或手性轴来说，该立构中心或手性轴可以它的R型、S型或所述R型和S型的混合物形式存在，包括外消旋混合物和非外消旋混合物。如本文所使用的短语“基本上不含其它立体异构体”意指所述组合物含有≤15％、更优选≤10％、甚至更优选≤5％、或最优选≤1％的另外的一种或者多种立体异构体。
“治疗(treatment/treating)”包括(1)抑制正经历或表现出疾病的病状或症状的受试者或患者的所述疾病(例如，阻止所述病状和/或症状进一步发展)，(2)改善正经历或表现出疾病的病状或症状的受试者或患者的所述疾病(例如，逆转所述病状和/或症状)，和/或(3)使正经历或表现出疾病的病状或症状的受试者或患者的所述疾病出现任何可测量的减轻。
上述定义取代以引用方式并入本文中的任何参考文献中的任何冲突性定义。然而，对某些术语加以定义的事实不应当被认为表示未被定义的任何术语是不确定的。而是，所使用的所有术语均被认为对本发明进行描述以使得本领域普通技术人员可了解本发明的范围并实施本发明。
II.RTA 408和合成方法
RTA 408可根据下文的实施例部分中所述的方法制备。这些方法可进一步使用本领域技术人员所应用的有机化学的原理和技术加以改良和优化。所述原理和技术在例如March’s Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure(《马奇高等有机化学：反应、机理和结构》)(2007年)中有教导，该出版物以引用方式并入本文中。
应当认识到，形成本发明的任何盐的一部分的具体阴离子或阳离子并不重要，只要所述盐总体上是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐和它们的制备方法与使用方法的另外的示例呈现于Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，and Use(《药用盐手册：性质和使用》)(2002年)中，该出版物以引用方式并入本文中。
RTA 408还可以前药形式存在。因为已知前药可提高众多合意的药物品质，例如溶解度、生物利用度、制造等，所以如果需要，一些本发明方法中所用的化合物可以前药形式递送。因此，本发明考虑了本发明化合物的前药以及递送前药的方法。本发明中所用的化合物的前药可通过以如下的方式修饰存在于所述化合物中的官能团来制备：所述修饰在常规操作中或在体内会被裂解而形成母体化合物。因此，前药包括例如其中羟基、氨基或羧基键合到下述任何基团的本文所述的化合物，当对患者施用所述前药时，所述任何基团裂解而分别形成羟基、氨基或羧酸。
RTA 408可含有一个或多个不对称取代的碳原子或氮原子，并且可以旋光形式或外消旋形式分离。因此，除非明确地指示具体的立体化学或异构形式，否则结构的所有手性形式、非对映形式、外消旋形式、差向异构形式以及所有几何异构形式都是想要的。RTA 408可以外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、非对映体混合物和单个非对映体的形式存在。在一些实施方案中，获得单一非对映体。根据本发明的RTA 408的手性中心可具有S构型或R构型。
另外，构成本发明的RTA 408的原子意图包括所述原子的所有同位素形式。如本文所使用的同位素包括那些具有相同原子序数但质量数不同的原子。作为一般的示例而非限制地，氢的同位素包括氚和氘，并且碳的同位素包括13C和14C。类似地，考虑到本发明化合物的一个或多个碳原子可被一个或多个硅原子置换。此外，考虑到RTA 408的一个或多个氧原子可被一个或多个硫原子或硒原子置换。
RTA 408和其多晶型物还可具有以下优点：它们可比现有技术中已知用于本文所述适应症中的化合物更为有效，毒性更小，作用时间更长，更强效，产生更少的副作用，更容易被吸收，和/或具有更好的药物代谢动力学特征(例如更高的口服生物利用度和/或更低的清除率)，和/或具有其它有用的药理学、物理学或化学优点。
III.RTA 408的多晶型物
在一些实施方案中，本发明提供RTA 408的不同固体形式，包括其溶剂化物。进行预配制和初步多晶型现象研究，并且发现RTA 408具有高度的形成溶剂化物的倾向。类别2、3、4和5的晶形与溶剂化物一致。关于对所述类别的说明，参见下表1。将类别2和3(两组同构的溶剂化物)干燥的尝试未获成功，这与紧密结合的溶剂分子一致。在一些实施方案中，将类别4固体(乙腈溶剂化物)干燥产生了同构的去溶剂化形式。在一些实施方案中，将类别5固体(THF溶剂化物)干燥产生了非晶形形式类别1。RTA 408的非溶剂化形式包括非晶形形式(类别1)和类别4的结晶的去溶剂化的溶剂化物(与类别4的乙腈溶剂化物同构)。在一些实施方案中，所述非晶形形式具有Tg为约153℃的高玻璃转化(ΔCp＝0.72J/g℃)并且仅略有吸湿性(Δm＝+0.4％50％→85％相对湿度)。在一些实施方案中，所述非晶形形式在高温和高湿度条件(即，在40℃/约75％相对湿度开放或在80℃闭合)下在至少4周内保持稳定。在一些实施方案中，非晶形形式(类别1)是用类别2物质通过两步法(转化成类别5，随后将类别5干燥以获得所述非晶形形式)以及直接一步法(在冷水浴中从丙酮溶液中沉淀)成功制备的。类别4的结晶的去溶剂化的溶剂化物(与类别4溶剂化物同构)略有吸湿性(从50％相对湿度到85％相对湿度，质量增加约0.7重量％)并且具有196.1℃(ΔH＝29.31J/g)的可能熔点。
通过FT-拉曼光谱法、PXRD、TG-FTIR、卡尔费歇尔滴定(Karl Fischertitration)、1H-NMR、DSC和DVS(另外的细节参见实施例部分)来表征63415的非晶形形式类别1的样品。发现所述样品含有约0.9重量％的EtOH与痕量的H2O(根据TG-FTIR)。通过卡尔费歇尔滴定测得0.5重量％的水含量。DSC显示Tg为约153℃的高玻璃转化温度(ΔCp＝0.72J/g℃)。根据DVS，所述物质略有吸湿性(Δm＝+0.4％50％→85％相对湿度)。在DSC或DVS实验中没有观察到结晶。
在时间点6小时、24小时、2天和7天时以1mg/mL的浓度研究所述非晶形形式在包括丙酮、EtOAc、MeOH和MeCN在内的有机溶剂以及不同的水性介质(例如1％的水性Tween 80、1％的水性SDS、1％的水性CTAB)中的化学稳定性。仅对在MeCN中的溶液(在7天后)以及对在1％的水性Tween 80介质中的悬浮液(在254nm处的所有时间点，以及在242nm处的24小时、2天和7天后)观察到≥1％的分解。
另外，通过在高温和高湿度条件(在25℃/62％相对湿度和40℃/75％相对湿度开放以及在60℃和80℃闭合)下储存来研究所述非晶形形式的稳定性。在1周、2周和4周后，通过PXRD分析储存的样品。所述样品中无一者与非晶形的起始物质有差异。
进行超过30次的结晶和干燥实验，包括悬浮液平衡、缓慢冷却、蒸发和沉淀。除了非晶形形式(类别1)外，还获得了4种新的晶形(类别2、3、4和5)。
通过FT-拉曼光谱法、PXRD和TG-FTIR来表征这4种新的形式(类别2、3、4和5)。所有形式均对应于溶剂化物(表1)。在真空或N2流下进行干燥实验，目的在于获得63415的结晶的非溶剂化形式。
表1.获得的类别的概要
类别2：所进行的大多数结晶实验产生类别2的固体物质(参见下文的实施例部分)。它的成员可对应于具有紧密结合的溶剂分子的同构的非化学计量的(＜0.5当量)溶剂化物(庚烷、环己烷、异丙醚、1-丁醇、三乙胺和可能的其它溶剂例如己烷、其它醚等的溶剂化物)。这一类别内的拉曼光谱和PXRD图谱彼此非常类似，因此结构可能基本上相同，其中由于被并入的溶剂不同而仅有小的差异。
对类别2样品进行的干燥实验并未产生结晶的非溶剂化形式。即使高温(80℃)和高真空(＜1×10-3毫巴)仍不能完全去除紧密结合的溶剂分子；始终保留＞2重量％的溶剂含量。这些部分干燥的样品的结晶度降低，但既没有观察到转化成不同的结构，也没有观察到显著的非晶化。
类别3：类别3的固体物质可通过数次结晶获得(参见下文的实施例部分)。类别3的样品可能是具有紧密结合的溶剂分子的2PrOH、EtOH和可能的丙酮的同构溶剂化物。它们可能对应于溶剂含量为约0.5当量的化学计量的半溶剂化物或非化学计量的溶剂化物。如同类别2那样，这一类别内的拉曼光谱和PXRD图谱彼此非常类似，指示并入不同溶剂的类似结构。
类似于类别2，干燥实验未获成功。非常紧密结合的溶剂分子仅可被部分地去除(即在1×10-3毫巴和80℃在最长达3天后去除约5.4重量％到约4.8重量％)。PXRD图谱保持不变。
类别4可用7∶3MeCN/H2O溶剂***获得(参见下文的实施例部分)。它最有可能对应于结晶的乙腈半溶剂化物。通过干燥(在真空或N2流下在高温下)，可去除大部分溶剂分子而不改变或破坏晶体结构(PXRD保持不变)。因此，获得了结晶的非溶剂化形式(或更确切地说，去溶剂化的溶剂化物)。它略有吸湿性(从50％相对湿度到85％相对湿度，质量增加约0.7重量％)并且具有196.1℃(ΔH＝29.31J/g)的可能熔点。
类别5可用约1∶1的THF/H2O溶剂***获得。类别5含有结合的THF(以及可能的H2O)。由于这两种组分的含量不能容易地单独被定量，因此尚未确定这一结晶的溶剂化物的确切性质。
将类别5干燥引起显著的去溶剂化以及向非晶形形式(类别1)的方向转化。在一些实施方案中，RTA 408的非晶形形式可通过将类别2庚烷溶剂化物悬浮于1∶1的THF/H2O中以形成类别5固体，之后进行干燥和非晶化来制备。
使用类别2起始物质进行实验，目的在于制备非晶形形式(类别1)。主要呈非晶形的物质(类别1)是用类别2物质为起始物质在两步法中经由类别5在100mg和3g的规模上(在100毫巴、80℃干燥数天)制备的。发现有可能通过使非晶形形式(类别1)在冷水浴中从类别2物质的丙酮溶液中直接沉淀而在避免溶剂THF的一步法中制备完全非晶形的物质(类别1)。
IV.与炎症和/或氧化应激相关的疾病
炎症是提供对感染性或寄生性生物体的抗性和修复受损组织的生物过程。炎症的特征通常在于局部血管舒张、发红、肿胀和疼痛，白细胞被募集到感染或损伤部位，产生炎性细胞因子，例如TNF-α和IL-1，以及产生活性氧簇或活性氮簇，例如过氧化氢、超氧化物和过氧亚硝酸盐。在炎症的后期，组织重构、血管生成和瘢痕形成(纤维化)可作为创伤愈合过程的一部分发生。在正常情况下，炎性反应是受调节的、暂时的，并且在感染或损伤已被妥善处理后以协调方式消退。然而，如果调节机制失效，则急性炎症可变得过度并危及生命。或者，炎症可变成慢性的并引起累积性组织损害或全身性并发症。至少基于本文所呈现的证据，RTA 408可用于治疗或预防炎症或与炎症相关的疾病。
许多严重且难治的人类疾病牵涉到炎性过程的失调，包括例如癌症、动脉粥样硬化和糖尿病等疾病，这些疾病并不被视为传统意义上的炎性病况。在癌症的情况下，炎性过程与包括肿瘤的形成、进展、转移和对疗法的抗性在内的过程相关。在一些实施方案中，RTA408可用于治疗或预防癌症，包括癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤或***瘤、或膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经***癌、子***、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胆囊癌、生殖器癌、泌尿生殖道癌、头部癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、肌肉组织癌、颈部癌、口腔粘膜癌或鼻粘膜癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌、或甲状腺癌。长期被视为脂质代谢障碍的动脉粥样硬化现在被理解为主要是一种炎性病况，其中活化的巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块的形成和最终破裂中起重要作用。炎性信号传导通路的活化也已被证实在胰岛素抵抗的产生中以及在与糖尿病性高血糖相关的外周组织损害中起作用。例如超氧化物、过氧化氢、一氧化氮和过氧亚硝酸盐等活性氧簇和活性氮簇的过量产生是炎性病况的标志。已报道了在多种多样的疾病中过氧亚硝酸盐产生失调的证据(Szabo等人，2007；Schulz等人，2008；Forstermann，2006；Pall，2007)。
例如类风湿性关节炎、狼疮、银屑病和多发性硬化等自身免疫性疾病牵涉到受侵害组织中炎性过程的不当的和长期的活化，这是由免疫***中自身相对于非自身识别和反应机制的功能障碍所引起。在例如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病的神经变性疾病中，神经损害与小神经胶质细胞的活化和例如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的促炎性蛋白的水平升高具有相关性。例如肾衰竭、心力衰竭、肝衰竭和慢性阻塞性肺病的慢性器官衰竭与导致纤维化的产生和器官功能的最终丧失的慢性氧化应激和炎症的存在密切相关。衬于大血管和小血管中的血管内皮细胞中的氧化应激可导致内皮功能障碍并且被认为是产生全身性心血管疾病、糖尿病并发症、慢性肾病和其它形式的器官衰竭以及许多其它衰老相关性疾病(包括中枢神经***和视网膜的变性疾病)的重要促成因素。
许多其它病症牵涉到受侵害组织中的氧化应激和炎症，包括炎性肠病；炎性皮肤疾病；与放射疗法和化学疗法相关的粘膜炎和皮炎；眼病，例如葡萄膜炎、青光眼、黄斑变性和各种形式的视网膜病变；移植失败和排斥；缺血-再灌注损伤；慢性疼痛；骨和关节的变性病况，包括骨关节炎和骨质疏松症；哮喘和囊肿性纤维化；癫痫发作病症；以及神经精神病况，包括精神***症、抑郁、双相型障碍、创伤后应激障碍、注意力缺陷障碍、自闭症谱系障碍(autism-spectrum disorder)和进食障碍，例如神经性厌食。炎性信号传导通路失调被认为是包括肌营养不良的肌肉萎缩疾病和各种形式的恶病质的病状的主要因素。
多种危及生命的急性病症也牵涉到炎性信号传导失调，包括累及胰腺、肾、肝或肺的急性器官衰竭、心肌梗塞或急性冠状动脉综合征、中风、败血症性休克、创伤、严重烧伤和过敏反应。
感染性疾病的许多并发症也牵涉到炎性反应失调。虽然炎性反应可杀死侵入的病原体，但过度的炎性反应也可具有相当的破坏性并且在一些情况下可为受感染组织中损害的主要原因。此外，过度的炎性反应还可导致因例如TNF-α和IL-1的炎性细胞因子的过量产生所致的全身性并发症。这被认为是严重流感、严重急性呼吸道综合征和败血症导致死亡的一个因素。
iNOS或环加氧酶-2(COX-2)的异常或过度表达已牵涉到许多疾病过程的发病机理。举例来说，明确的是，NO是一种强效的诱变剂(Tamir和Tannebaum，1996)，并且一氧化氮还可活化COX-2(Salvemini等人，1994)。此外，在致癌物氧化偶氮甲烷诱发的大鼠结肠肿瘤中iNOS显著增加(Takahashi等人，1997)。齐墩果酸的一系列合成三萜系化合物类似物已被证实为细胞炎性过程的强有力抑制剂，所述细胞炎性过程例如在小鼠巨噬细胞中IFN-γ对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和COX-2的诱导。参见Honda等人(2000a)；Honda等人(2000b)；和Honda等人(2002)，这些文献均以引用方式并入本文中。
在一个方面，本文所公开的RTA 408的部分特征在于它能够抑制巨噬细胞源性RAW264.7细胞中因暴露于γ-干扰素所诱发的一氧化氮的产生。RTA 408的特征进一步在于能够诱导例如NQO1等抗氧化蛋白的表达，并且减少例如COX-2和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等促炎性蛋白的表达。这些性质与一系列广泛的牵涉到氧化应激和炎性过程失调的疾病和病症的治疗相关，所述疾病和病症包括癌症、因局部或全身暴露于电离辐射所致的并发症、因放射疗法或化学疗法所致的粘膜炎和皮炎、自身免疫性疾病、心血管疾病(包括动脉粥样硬化)、缺血-再灌注损伤、急性和慢性器官衰竭(包括肾衰竭和心力衰竭)、呼吸道疾病、糖尿病和糖尿病并发症、严重过敏、移植排斥、移植物抗宿主病、神经变性疾病、眼和视网膜的疾病、急性和慢性疼痛、变性骨病(包括骨关节炎和骨质疏松症)、炎性肠病、皮炎和其它皮肤疾病、败血症、烧伤、癫痫发作病症和神经精神病症。
在另一个方面，RTA 408可用于治疗患有例如眼病等病况的受试者。举例来说，葡萄膜炎、黄斑变性(干性形式与湿性形式这两者)、青光眼、糖尿病性黄斑水肿、睑炎、糖尿病性视网膜病变、角膜内皮的疾病和病症(例如福斯氏角膜内皮营养不良)、手术后炎症、干眼、过敏性结膜炎和其它形式的结膜炎是可用RTA 408治疗的眼病的非限制性示例。
在另一个方面，RTA 408可用于治疗患有例如皮肤疾病或病症等病况的受试者。举例来说，皮炎，包括过敏性皮炎、特应性皮炎、因化学暴露所致的皮炎和辐射诱发的皮炎；热烧伤或化学烧伤；慢性创伤，包括糖尿病性溃疡、褥疮和静脉曲张性溃疡；痤疮；脱发，包括秃发和药物诱发的脱发；其它毛囊病症；大疱性表皮松解；晒伤和其并发症；皮肤色素沉着病症，包括白癜风；衰老相关性皮肤病况；手术后创伤愈合；因皮肤损伤、手术或烧伤所致的瘢痕形成的预防或减少；银屑病；自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的皮肤表现；皮肤癌的预防或治疗；牵涉到皮肤细胞过度增殖的病症，例如角化过度是可用RTA 408治疗的皮肤疾病的非限制性示例。
不受理论所束缚，认为抗氧化/抗炎性Keap1/Nrf2/ARE通路的活化牵涉到本文所公开的化合物的抗炎性质和抗癌性质这两者。
在另一个方面，RTA 408可用于治疗患有由一种或多种组织中氧化应激水平升高所引起的病况的受试者。氧化应激由异常高或持续水平的活性氧簇，例如超氧化物、过氧化氢、一氧化氮和过氧亚硝酸盐(通过一氧化氮与超氧化物的反应形成)所引起。氧化应激可伴有急性或慢性炎症。氧化应激可由以下因素引起：线粒体功能障碍；例如巨噬细胞和嗜中性粒细胞等免疫细胞的活化；急性暴露于外部因素(external agent)，例如电离辐射或细胞毒性化学治疗剂(例如多柔比星)；创伤或其它急性组织损伤；缺血/再灌注；循环不良或贫血；局部或全身性的缺氧或高氧症；炎性细胞因子和其它炎症相关蛋白的水平升高；和/或其它异常生理状态，例如高血糖或低血糖。
在许多此类病况的动物模型中，刺激诱导型血红素加氧酶(HO-1)(Nrf2通路的靶基因)表达已被证实具有显著的治疗作用，包括在心肌梗塞、肾衰竭、移植失败和排斥、中风、心血管疾病和自身免疫性疾病的模型中(例如Sacerdoti等人，2005；Abraham和Kappas，2005；Bach，2006；Araujo等人，2003；Liu等人，2006；Ishikawa等人，2001；Kruger等人，2006；Satoh等人，2006；Zhou等人，2005；Morse和Choi，2005；Morse和Choi，2002)。这种酶将游离的血红素分解成铁、一氧化碳(CO)和胆绿素(其随后转化成强效的抗氧化分子胆红素)。
在另一个方面，RTA 408可用于预防或治疗因由炎症所加剧的氧化应激所致的急性和慢性组织损害或器官衰竭。落入这一类别的疾病的示例包括心力衰竭、肝衰竭、移植失败和排斥、肾衰竭、胰腺炎、纤维化肺病(尤其为囊肿性纤维化、COPD和特发性肺纤维化)、糖尿病(包括并发症)、动脉粥样硬化、缺血-再灌注损伤、青光眼、中风、自身免疫性疾病、自闭症、黄斑变性和肌营养不良。举例来说，在自闭症的情况下，研究表明中枢神经***中增加的氧化应激可导致所述疾病产生(Chauhan和Chauhan，2006)。
还有证据将氧化应激和炎症与中枢神经***的许多其它病症的产生和病理学关联起来，所述其他病症包括精神病症，例如精神病、严重抑郁和双相型障碍；癫痫发作病症，例如癫痫；疼痛和感觉综合征，例如偏头痛、神经性疼痛或耳鸣；和行为综合征，例如注意力缺陷障碍。参见例如Dickerson等人，2007；Hanson等人，2005；Kendall-Tackett，2007；Lencz等人，2007；Dudhgaonkar等人，2006；Lee等人，2007；Morris等人，2002；Ruster等人，2005；McIver等人，2005；Sarchielli等人，2006；Kawakami等人，2006；Ross等人，2003，这些文献均以引用方式并入本文中。举例来说，炎性细胞因子(包括TNF-α、干扰素-γ和IL-6)的水平升高与严重精神疾病相关(Dickerson等人，2007)。小神经胶质细胞活化也已与严重精神疾病具有相关性。因此，下调炎性细胞因子和抑制小神经胶质细胞的过度活化可有益于患有精神***症、严重抑郁、双相型障碍、自闭症谱系障碍和其它神经精神病症的患者。
因此，在牵涉到单独的氧化应激或由炎症加剧的氧化应激的病状中，治疗可包括对受试者施用治疗有效量的本发明化合物，例如上文或本说明书通篇所述的那些。可在可预测的氧化应激状态(例如器官移植或对癌症患者施用放射疗法)之前预防性地施予治疗，或可在牵涉到已形成的氧化应激和炎症的背景下治疗性地施予治疗。在一些实施方案中，当将本发明的化合物用于治疗接受放射疗法和/或化学疗法的患者时，本发明的化合物可在所述放射疗法或化学疗法之前、同时和/或之后施用，或所述化合物可与其它疗法组合施用。在一些实施方案中，本发明的化合物可预防与放射疗法或化学疗法(使用不同药剂)相关的副作用和/或降低所述副作用的严重程度，而不会降低所述放射疗法或化学疗法的抗癌作用。因为所述副作用对于放射疗法和/或化学疗法来说可能具有剂量限制性，所以在一些实施方案中，本发明的化合物可用于允许更高和/或更频繁地给予所述放射疗法和/或化学疗法，从而例如产生更大的治疗功效。在一些实施方案中，当与放射疗法和/或化学疗法组合施用时，本发明的化合物可提高给定剂量的放射疗法和/或化学疗法的功效。在一些实施方案中，当与放射疗法和/或化学疗法组合施用时，本发明的化合物可提高给定剂量的放射疗法和/或化学疗法的功效并且减少(或至少不增加)所述放射疗法和/或化学疗法的副作用。在一些实施方案中且不受理论所束缚，这一组合功效可由本发明的化合物对促炎性转录因子NF-κB的活性的抑制产生。NF-κB通常在癌细胞中被长期活化，并且所述活化与对疗法的抗性和促进肿瘤进展相关(例如Karin，2006；Aghajan等人，2012)。在一些实施方案中，本发明的化合物还可抑制促进炎症和癌症的其它转录因子，例如STAT3(例如He和Karin，2011；Grivennikov和Karin，2010)。
RTA 408可用于治疗或预防炎性病况，例如败血症、皮炎、自身免疫性疾病和骨关节炎。RTA 408还可用于例如通过诱导Nrf2和/或抑制NF-κB来治疗或预防炎性疼痛和/或神经性疼痛。
RTA 408还可用于治疗或预防例如以下的疾病：癌症、炎症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化、自闭症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、狼疮、克罗恩氏病和银屑病)、炎性肠病、发病机理被认为牵涉到一氧化氮或***素的过量产生的所有其它疾病、以及牵涉到单独的氧化应激或由炎症加剧的氧化应激的病状。RTA 408可用于治疗或预防癌症，包括癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤或***瘤、或膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经***癌、子***、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胆囊癌、生殖器癌、泌尿生殖道癌、头部癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、肌肉组织癌、颈部癌、口腔粘膜癌或鼻粘膜癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌、或甲状腺癌。
炎症的另一个方面是产生炎性***素，例如***素E。RTA 408可用于促进血管舒张、血浆外渗、局部疼痛、温度升高和其它炎症症状。酶COX-2的可诱导形式与它们的产生相关，并且在发炎的组织中存在高水平的COX-2。因此，抑制COX-2可减轻许多炎症症状，并且许多重要的抗炎药物(例如布洛芬(ibuprofen)和塞来考昔(celecoxib))通过抑制COX-2活性起作用。已证明一类环戊烯酮***素(cyPG)(例如15-脱氧***素J2，又名PGJ2)在刺激炎症的协调消退中发挥作用(例如Rajakariar等人，2007)。COX-2还与环戊烯酮***素的产生相关。因此，抑制COX-2可干扰炎症的完全消退，潜在地促进组织中活化的免疫细胞持续存在并导致慢性“郁积性(smoldering)”炎症。这一作用可导致长期使用选择性COX-2抑制剂的患者的心血管疾病的发生率增加。
在一个方面，RTA 408可用于通过选择性地活化调节氧化还原敏感性转录因子活性的蛋白质上的调节性半胱氨酸残基(RCR)来控制细胞内促炎性细胞因子的产生。cyPG对RCR的活化已被证实引起如下的促消退程序，在所述程序中抗氧化性和细胞保护性转录因子Nrf2的活性被强效地诱导并且促氧化和促炎性转录因子NF-κB和STAT的活性被抑制。在一些实施方案中，RTA 408可用于增加抗氧化性和还原性的分子(NQO1、HO-1、SOD1、γ-GCS)的产生并且减少氧化应激以及促氧化和促炎性分子(iNOS、COX-2、TNF-α)的产生。在一些实施方案中，RTA 408可用于通过促进炎症消退并限制对宿主的过度组织损害来使作为炎性事件宿主的细胞恢复到非炎性状态。
A.癌症
在一些实施方案中，本公开的RTA 408、多晶型物和方法可用于诱导肿瘤细胞的细胞凋亡，诱导细胞分化，抑制癌细胞增殖，抑制炎性反应，和/或在化学预防能力中发挥功能。举例来说，本发明提供具有以下性质中的一种或多种的新型多晶型物：(1)能够诱导细胞凋亡并且使恶性细胞与非恶性细胞这两者分化，(2)在亚微摩尔或纳摩尔水平作为许多恶性细胞或恶化前细胞增殖的抑制剂的活性，(3)能够抑制炎性酶诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的从头合成，(4)能够抑制NF-κB活化，和(5)能够诱导血红素加氧酶-1(HO-1)的表达。
iNOS和COX-2的水平在某些癌症中升高且已牵涉到致癌作用，并且COX-2抑制剂已被证实能降低人类原发性结肠腺瘤的发生率(Rostom等人，2007；Brown和DuBois，2005；Crowel等人，2003)。iNOS在骨髓源性抑制细胞(MDSC)中表达(Angulo等人，2000)并且癌细胞中的COX-2活性已被证实会导致***素E2(PGE2)产生，所述***素E2已被证实在MDSC中诱导精氨酸酶表达(Sinha等人，2007)。精氨酸酶和iNOS是利用L-精氨酸作为底物并且分别产生L-鸟氨酸和尿素以及L-瓜氨酸和NO的酶。已证实MDSC使精氨酸从肿瘤微环境中耗尽联同NO和过氧亚硝酸盐的产生一起抑制了T细胞的增殖并诱导其细胞凋亡(Bronte等人，2003)。对COX-2和iNOS的抑制已被证实减少了MDSC的积聚，恢复了肿瘤相关T细胞的细胞毒性活性，并且延迟了肿瘤生长(Sinha等人，2007；Mazzoni等人，2002；Zhou等人，2007)。
对NF-κB和JAK/STAT信号传导通路的抑制已被暗示为一种抑制上皮癌细胞增殖并诱导它们细胞凋亡的策略。STAT3和NF-κB的活化已被证实会引起对癌细胞的细胞凋亡的抑制以及对增殖、侵袭和转移的促进。许多参与这些过程的靶基因已被证实在转录上受NF-κB与STAT3这两者的调节(Yu等人，2007)。
除了在上皮癌细胞中的直接作用外，NF-κB和STAT3还在肿瘤微环境内存在的其它细胞中具有重要的作用。在动物模型中进行的实验已证明在癌细胞与造血细胞这两者中均需要NF-κB来扩大炎症对癌症发生和进展的影响(Greten等人，2004)。在癌细胞和骨髓细胞中抑制NF-κB分别使所得肿瘤的数目和尺寸减小。癌细胞中的STAT3的活化导致抑制肿瘤相关树突细胞(DC)成熟的多种细胞因子(IL-6、IL-10)产生。此外，树突细胞本身中的这些细胞因子会使STAT3活化。在小鼠癌症模型中抑制STAT3恢复了DC成熟，促进了抗肿瘤免疫性，并且抑制了肿瘤生长(Kortylewski等人，2005)。在一些实施方案中，RTA 408和它的多晶型物可用于治疗癌症，包括例如***癌。在一些实施方案中，RTA 408和它的多晶型物可在组合疗法中用于治疗癌症，包括例如***癌。参见例如下文的实施例H。
B.多发性硬化和其它神经变性病况
在一些实施方案中，本发明的RTA 408、多晶型物和方法可用于治疗患者的多发性硬化(MS)或其它神经变性病况，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或肌萎缩侧索硬化。已知MS为中枢神经***的炎性病况(Williams等人，1994；Merrill和Benvenist，1996；Genain和Nauser，1997)。基于多项研究，有证据表明炎性机制、氧化机制和/或免疫机制参与阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)和MS的发病机理(Bagasra等人，1995；McGeer和McGeer，1995；Simonian和Coyle，1996；Kaltschmidt等人，1997)。流行病学数据表明长期使用阻断***素由花生四烯酸合成的NSAID会显著地降低产生AD的风险(McGeer等人，1996；Stewart等人，1997)。因此，阻断NO和***素形成的药剂可用于预防和治疗神经变性疾病的方法中。用于治疗所述疾病的成功的治疗性候选物通常需要能够穿透血脑屏障。参见例如美国专利公开2009/0060873，其以引用方式并入本文中。
C.神经炎症
在一些实施方案中，本发明的RTA 408、多晶型物和方法可用于治疗患有神经炎症的患者。神经炎症涵盖以下观念：小神经胶质细胞和星形细胞在中枢神经***中的反应和作用具有在根本上呈炎症样的特征，并且这些反应对于多种多样神经病症的发病机理和进展至关重要。这些观念已从阿尔茨海默氏病延伸到其它神经变性疾病(Eikelenboom等人，2002；Ishizawa和Dickson，2001)、缺血性/中毒性疾病(Gehrmann等人，1995；Touzani等人，1999)、肿瘤生物学(Graeber等人，2002)，甚至延伸到正常脑发育。神经炎症合并了众多复杂的细胞反应，包括小神经胶质细胞和星形细胞的活化以及细胞因子、趋化因子、补体蛋白、急性期蛋白、氧化损伤和相关分子过程的诱导，并且所述事件可对神经元功能具有有害作用，从而导致神经元损伤、进一步的神经胶质活化和最终神经变性。
D.肾脏疾病
在一些实施方案中，RTA 408以及其多晶型物可用于基于例如由US8,129,429教导的方法治疗患有肾脏疾病和病症(包括肾衰竭和慢性肾病(CKD))的患者，所述专利以引用方式并入本文中。肾衰竭会导致来自血液的代谢废物的清除不充分和血液中电解质浓度异常，是全世界、尤其是发达国家所面临的重大医学问题。糖尿病和高血压是引起慢性肾衰竭(也被称为慢性肾病(CKD))的最重要原因之一，但它也与例如狼疮的其它病况相关。急性肾衰竭可起因于暴露于某些药物(例如醋氨酚(acetaminophen))或毒性化学品，或起因于与休克或手术程序(例如移植)相关的缺血-再灌注损伤，并且可导致慢性肾衰竭。在许多患者中，肾衰竭发展到患者需要定期透析或肾移植以继续生活的阶段。这两种程序均是高度有创性的并且与显著的副作用和生活质量问题相关。虽然对于肾衰竭的一些并发症(例如甲状旁腺功能亢进和高磷酸盐血症)有了有效治疗，但尚未有可用的治疗被证实能终止或逆转肾衰竭的潜在进展。因此，可改善受损的肾功能的药剂将代表了在肾衰竭治疗方面的显著进步。
炎症显著地导致CKD的病状。在氧化应激与肾功能障碍之间也有强的机制联系。NF-κB信号传导通路在CKD的进展中起重要作用，这是因为NF-κB调节MCP-1的转录，MCP-1是一种引起单核细胞/巨噬细胞募集、从而导致最终损伤肾的炎性反应的趋化因子(Wardle，2001)。
Keap1/Nrf2/ARE通路控制编码抗氧化酶(包括血红素加氧酶-1(HO-1))的多种基因的转录。切除雌性小鼠中的Nrf2基因导致狼疮样肾小球肾炎产生(Yoh等人，2001)。此外，多项研究已证明响应于肾损害和炎症而诱导HO-1表达并且这种酶和它的产物(胆红素和一氧化碳)在肾中起保护作用(Nath等人，2006)。
急性肾损伤(AKI)可在缺血-再灌注、用例如顺铂和雷帕霉素(rapamycin)等某些药理学药剂治疗以及静脉内注射用于医学成像中的放射造影介质后发生。如在CKD中那样，炎症和氧化应激导致AKI的病状。对于放射造影剂诱发的肾病(RCN)的潜在分子机制并未完全了解；然而，包括长时间的血管收缩、受损的肾脏自身调节和造影介质的直接毒性在内的事件的组合很可能都会导致肾衰竭(Tumlin等人，2006)。血管收缩导致肾血流减少并且引起缺血-再灌注和活性氧簇的产生。HO-1在这些条件下被强烈地诱导并且已被证明会防止若干不同的器官(包括肾)中的缺血-再灌注损伤(Nath等人，2006)。具体地说，对HO-1的诱导已被证实在RCN的大鼠模型中具有保护性(Goodman等人，2007)。再灌注还部分地通过活化NF-κB信号传导来诱导炎性反应(Nichols，2004)。靶向NF-κB已被提出作为预防器官损害的治疗策略(Zingarelli等人，2003)。
E.心血管疾病
在一些实施方案中，本发明的RTA 408、多晶型物和方法可用于治疗患有心血管疾病的患者。CV疾病的病因是复杂的，但大部分原因与关键器官或组织的血液供应不足或被完全破坏有关。通常，所述病况起因于一个或多个动脉粥样硬化斑块的破裂，从而导致阻塞关键血管中的血流的血栓形成。
在一些情况下，动脉粥样硬化可能在关键血管中如此广泛以致于产生狭窄(动脉变窄)并且流向关键器官(包括心脏)的血流长期不足。所述慢性缺血可导致多种的终末器官损害，包括与充血性心力衰竭相关的心脏肥大。
当动脉内衬(内皮)的物理缺陷或损伤触发牵涉到血管平滑肌细胞增殖和白细胞浸润到受侵害区域中的炎性反应时，发生动脉粥样硬化，这是导致许多形式的心血管疾病的潜在缺陷。最终，可形成被称为动脉粥样硬化斑块的复杂病灶，所述病灶由上述细胞与带胆固醇的脂蛋白和其它物质的沉积物的组合构成(例如Hansson等人，2006)。虽然现行的治疗性处理提供了显著的益处，但心血管疾病所致的死亡率仍然很高并且治疗心血管疾病的需求仍然未得到明显满足。
对HO-1的诱导已被证实在心血管疾病的多种模型中是有益的，并且低水平的HO-1表达已在临床上与CV疾病升高的风险相关联。因此，本发明的RTA 408、多晶型物和方法可用于治疗或预防多种心血管病症，包括但不限于动脉粥样硬化、高血压、心肌梗塞、慢性心力衰竭、中风、蛛网膜下腔出血和再狭窄。在一些实施方案中，本发明的RTA 408、多晶型物和方法可与其它已知的心血管疗法作为组合疗法使用，所述其它已知的心血管疗法例如但不限于抗凝剂、溶栓剂、链激酶、组织纤溶酶原激活剂、手术、冠状动脉旁路移植、球囊血管成形术、使用支架、抑制细胞增殖的药物、或降低胆固醇水平的药物。
F.糖尿病
在一些实施方案中，RTA 408以及其多晶型物可用于基于例如由US8,129,429教导的方法治疗患有糖尿病的患者，所述专利以引用方式并入本文中。糖尿病是一种特征在于身体无法调节葡萄糖的循环水平的复杂疾病。这一失调可能起因于胰岛素的缺乏，胰岛素是调节各种组织中葡萄糖的产生和吸收的肽激素。胰岛素缺乏会损害肌肉组织、脂肪组织和其它组织适当吸收葡萄糖的能力，从而导致高血糖(血液中葡萄糖的水平异常高)。最常见地，所述胰岛素缺乏起因于胰腺的胰岛细胞中的产生不足。在大部分情况下，这起因于这些细胞被自身免疫性破坏，即一种被称为1型或青少年发作型糖尿病的病况，但还可归因于身体创伤或一些其它原因。
当肌肉细胞和脂肪细胞对于胰岛素的反应变得较低并且不适当地吸收葡萄糖，从而导致高血糖时，也可能发生糖尿病。这一现象被称为胰岛素抵抗，并且所产生的病况被称为2型糖尿病。2型糖尿病是最常见的类型，与肥胖和高血压高度相关。肥胖与脂肪组织的炎性状态相关，所述炎性状态被认为在胰岛素抵抗的产生中起主要作用(例如Hotamisligil，2006；Guilherme等人，2008)。
糖尿病与对许多组织的损害相关，这主要是因为高血糖(和低血糖，其可起因于过量的或时机不当的胰岛素给药)是氧化应激的显著来源。因为本发明的RTA 408、多晶型物和方法能够防止氧化应激，特别是通过诱导HO-1表达来防止氧化应激，所以它们可用于治疗糖尿病的许多并发症。如上文所述(Cai等人，2005)，肝中的慢性炎症和氧化应激被怀疑是产生2型糖尿病的主要促成因素。此外，例如噻唑烷二酮的PPARγ激动剂能够减少胰岛素抵抗并且已知可有效治疗2型糖尿病。在一些实施方案中，本发明的RTA408、多晶型物和方法可与例如噻唑烷二酮的PPARγ激动剂作为组合疗法使用。
G.关节炎
在一些实施方案中，本发明的RTA 408、多晶型物和方法可用于治疗患有某种形式的关节炎的患者。在一些实施方案中，可用本发明的RTA 408和多晶型物治疗的关节炎形式是类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎(PsA)、脊椎关节病(SpA)(包括强直性脊柱炎(AS)、反应性关节炎(ReA)和肠病性关节炎(EA))、青少年类风湿性关节炎(JRA)和早期炎性关节炎。
对于类风湿性关节炎来说，最初体征通常出现在滑膜内衬层中，滑膜成纤维细胞增殖并且它们附着到关节边缘处的关节表面(Lipsky，1998)。随后，巨噬细胞、T细胞和其它炎性细胞被募集到关节中，它们在这里产生许多介体，包括以下细胞因子：导致慢性后遗症、从而造成骨和软骨破坏的白细胞介素-1(IL-1)以及在炎症中起作用的肿瘤坏死因子(TNF-α)(Dinarello，1998；Arend和Dayer，1995；van den Berg，2001)。IL-1在血浆中的浓度在RA患者中显著高于健康个体，并且值的注意的是，血浆IL-1水平与RA疾病活动性具有相关性(Eastgate等人，1988)。此外，IL-1的滑液水平与RA的各种射线照相特征和组织学特征具有相关性(Kahle等人，1992；Rooney等人，1990)。
其它形式的关节炎包括银屑病关节炎(PsA)，其为特征在于关节炎与银屑病相结合的慢性炎性关节病。研究已显示PsA与其它脊椎关节病(SpA)共有许多遗传学特征、发病特征和临床特征，所述其它脊椎关节病(SpA)是一组包括强直性脊柱炎、反应性关节炎和肠病性关节炎的疾病(Wright，1979)。PsA属于SpA组的观点最近已得到成像研究的进一步支持，所述成像研究证明在PsA中存在广泛的起止点炎，而在RA中则并不存在(McGonagle等人，1999；McGonagle等人，1998)。更具体地说，起止点炎已被认为是SpA中出现的最早期的事件之一，其导致脊柱中的骨重建和关节强直，以及在发炎的起止点靠近外周关节时导致关节滑膜炎。已报道在银屑病的皮肤(Ettehadi等人，1994)与滑液(Partsch等人，1997)这两者中TNF-α的量增加。最近的试验已证实抗-TNF治疗在PsA(Mease等人，2000)与强直性脊柱炎(Brandt等人，2000)这两者中的积极益处。
青少年类风湿性关节炎(JRA)是用于儿童最普遍的关节炎形式的术语，适用于特征在于滑膜的慢性炎症和肥大的一族疾病。所述术语与在欧洲被称作青少年慢性关节炎和/或青少年特发性关节炎的一族疾病有重叠，但并不完全同义。
多关节JRA是特征在于多个(4个或更多个)关节(包括手的小关节)中的炎症和滑膜增生的一种独特的临床亚型(Jarvis，2002)。这一JRA亚型可能是严重的，因为它累及多个关节并且能够随时间而快速进展。虽然在临床上是独特的，但多关节JRA并不是同样的，并且患者在疾病表现、发病年龄、预后和治疗反应方面不同。这些差异很可能反映了在这一疾病中可能出现的在免疫性质和炎性攻击的一系列变化(Jarvis，1998)。
强直性脊柱炎(AS)是脊椎关节病的较宽泛疾病分类内的一个疾病子集。罹患不同子集的脊椎关节病的患者的疾病病因往往非常不同，范围从细菌感染到遗传因素。然而，在所有亚群中，所述疾病过程的最终结果均为中轴关节炎。
AS是存在或不存在骨外表现的中轴骨骼的慢性全身性炎性风湿性病症。主要侵害骶髂关节和脊柱，但也可能累及髋关节和肩关节，以及较不常见地累及外周关节或某些关节外结构，例如眼、脉管***、神经***和胃肠***。对于所述疾病的病因尚未完全了解(Wordsworth，1995；Calin和Taurog，1998)。所述病因与主要组织相容性I类(MHC I)HLA-B27等位基因强相关(Calin和Taurog，1998)。AS在个体壮年时期对其造成侵害并且由于AS可能引起肌腱、韧带、关节和骨的慢性疼痛和不可逆损害而令人担忧(Brewerton等人，1973a；Brewerton等人，1973b；Schlosstein等人，1973)。
H.溃疡性结肠炎
在一些实施方案中，本发明的RTA 408、多晶型物和方法可用于治疗患有溃疡性结肠炎的患者。溃疡性结肠炎是在大肠的内衬中引起炎症和被称为溃疡的疮疡的疾病。所述炎症通常发生于直肠和结肠下部，但它可侵害整个结肠。溃疡性结肠炎还可被称为结肠炎或直肠炎。所述炎症频繁地使结肠排空，从而引起腹泻。溃疡形成于其中炎症已杀死内衬于结肠中的细胞的部位，并且所述溃疡出血并产生脓液。
溃疡性结肠炎是一种炎性肠病(IBD)，炎性肠病是在小肠和结肠中引起炎症的疾病的通用名称。溃疡性结肠炎可难以诊断，这是因为它的症状类似于其它肠道病症和另一类型的IBD，即克罗恩氏病。克罗恩氏病不同于溃疡性结肠炎，这是因为它在肠壁内引起更深的炎症。此外，克罗恩氏病通常发生于小肠中，但所述疾病还可发生于嘴、食道、胃、十二指肠、大肠、阑尾和***中。
I.克罗恩氏病
在一些实施方案中，本发明的RTA 408、多晶型物和方法可用于治疗患有克罗恩氏病的患者。克罗恩氏病的症状包括肠炎以及产生肠狭窄和肠瘘；神经病变通常伴随这些症状。通常开抗炎药物，例如5-氨基水杨酸盐(例如美沙拉嗪(mesalamine))或皮质类固醇，但这些药物并非始终有效(在Botoman等人，1998中进行了综述)。利用环孢霉素进行免疫抑制有时有益于对皮质类固醇具有抗性或不耐受皮质类固醇的患者(Brynskov等人，1989)。
在克罗恩氏病的活动性病例中，升高浓度的TNF-α和IL-6被分泌到血液循环中，并且粘膜细胞局部过量产生TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8(同上；Funakoshi等人，1998)。这些细胞因子可对生理***具有广泛作用，包括骨发育、造血作用以及肝、甲状腺和神经精神功能。此外，已在克罗恩氏病患者中观察到促炎性IL-1β占优势的IL-1β/IL-1ra比率的失衡(Rogler和Andus，1998；Saiki等人，1998；Dionne等人，1998；但参见Kuboyama，1998)。
已被建议用于克罗恩氏病的治疗包括使用各种细胞因子拮抗剂(例如IL-1ra)、抑制剂(例如IL-1β转化酶抑制剂和抗氧化剂)和抗细胞因子抗体(Rogler和Andus，1998；vanHogezand和Verspaget，1998；Reimund等人，1998；Lugering等人，1998；McAlindon等人，1998)。具体地说，已在克罗恩氏病的治疗中尝试抗TNF-α单克隆抗体并获得一些成功(Targan等人，1997；Stack等人，1997；van Dullemen等人，1995)。这些化合物可与本公开的RTA 408、多晶型物和方法用于组合疗法中。
J.全身性红斑狼疮
在一些实施方案中，本发明的RTA 408、多晶型物和方法可用于治疗患有SLE的患者。全身性红斑狼疮(SLE)是特征在于自身抗体和免疫复合物在组织中沉积、从而导致组织损伤的自身免疫性风湿性疾病(Kotzin，1996)。与例如MS和1型糖尿病等自身免疫性疾病相比，SLE潜在地直接累及多个器官***，并且它的临床表现是多样的和可变的(由Kotzin和O′Dell，1995综述)。举例来说，一些患者可能主要表现出皮疹和关节疼痛，显示出自发性缓解并且几乎不需要药物治疗。在范围的另一端为表现出严重的和进行性的肾脏受累而需要用高剂量的类固醇和例如环磷酰胺的细胞毒性药物治疗的患者(Kotzin，1996)。
由SLE产生的抗体之一，即IgG抗-dsDNA，在狼疮性肾小球肾炎(GN)的产生中起主要作用(Hahn和Tsao，1993；Ohnishi等人，1994)。肾小球肾炎是净化肾脏血液的肾小球的毛细血管壁由于肾小球基底膜的上皮侧上的增生而变厚的严重病况。所述疾病通常是慢性的和进行性的并且可导致最终的肾衰竭。
K.肠易激综合征
在一些实施方案中，本发明的RTA 408、多晶型物和方法可用于治疗患有肠易激综合征(IBS)的患者。IBS是特征在于腹痛和排便习惯发生改变的功能性障碍。这一综合征可开始于成年早期并且可与显著的功能缺陷相关。这一综合征并非同样的病症。而是，已基于主要症状，即腹泻、便秘或疼痛对IBS的亚型进行了描述。在不存在例如发烧、体重减轻和胃肠道出血等“警报”症状时，需要进行有限的处理。
有越来越多的关于IBS起源的证据表明感染性肠炎与随后IBS的产生之间的关系。炎性细胞因子可能起作用。在对有确诊的细菌性肠胃炎病史的患者的调查(Neal等人，1997)中，25％报告有排便习惯持续性的改变。症状的持续性可归因于急性感染时的心理压力(Gwee等人，1999)。
最近的数据表明小肠中的细菌过度生长也可能在IBS症状中具有作用。在一项研究(Pimentel等人，2000)中，被安排进行氢呼吸测试的202名IBS患者中有157名(78％)具有细菌过度生长呈阳性的测试结果。在有随访测试的47名受试者中，25名(53％)报告了抗生素治疗对症状(即腹痛和腹泻)有改善。
L.舍格伦氏综合征(Syndrome)
在一些实施方案中，本发明的RTA 408、多晶型物和方法可用于治疗患有舍格伦氏综合征的患者。原发性舍格伦氏综合征(SS)是一种缓慢进展的慢性全身性自身免疫性疾病，它主要侵害中年妇女(女性与男性的比率为9∶1)，尽管可在包括儿童期在内的所有年龄阶段中见到该疾病(Jonsson等人，2002)。所述疾病的特征在于外分泌腺被淋巴细胞浸润和被破坏，所述外分泌腺被包括CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞和B细胞在内的单核细胞浸润(Jonsson等人，2002)。另外，在1/3患者中见到腺外(全身性)表现(Jonsson等人，2001)。
在例如RA的其它全身性自身免疫性疾病中，已鉴别出对于异位生发中心(GC)至关重要的因子。具有GC的类风湿滑膜组织被证实会产生趋化因子CXCL13、CCL21和淋巴毒素(LT)-β(在滤泡中心和外套层B细胞上检测到)。这些分析物的多变量回归分析将CXCL13和LT-β鉴别为在类风湿滑膜炎中预测GC的孤立性细胞因子(Weyand和Goronzy，2003)。最近，唾液腺中的CXCL13和CXCR5已被证实通过募集B细胞和T细胞，从而促进SS中的淋巴新生和异位GC形成而在炎性过程中起重要作用(Salomonsson等人，2002)。
M.银屑病
在一些实施方案中，本发明的RTA 408、多晶型物和方法可用于治疗患有银屑病的患者。银屑病是脱皮和炎症的慢性皮肤疾病，它侵害2％到2.6％或580万到750万人的美国人口。在皮肤细胞有机会成熟之前，当它们从其位于皮肤表面下方的起点快速上升并在表面上堆积时，发生银屑病。通常这一移动(也被称为代谢转换(turnover))耗时约一个月，但在银屑病中，代谢转换可仅在几天内发生。在银屑病的典型形式中，它产生被银色鳞屑覆盖的发红(发炎)的厚皮肤斑。这些斑，有时被称作斑块，通常发痒或感觉疼痛。所述斑块最通常出现于肘、膝、腿的其它部分、头皮、下背、面部、掌和足底上，但它们还可出现于身体上任何部位处的皮肤上。所述疾病还可侵害指甲、趾甲以及生殖器和嘴内侧的软组织。
银屑病是一种由免疫***驱使的皮肤病症，尤其牵涉到被称为T细胞的白细胞类型。通常，T细胞帮助保护身体抵抗感染和疾病。在银屑病的情况下，T细胞错误地开始起作用并且变得如此活跃以使得它们触发其它免疫应答，从而导致炎症和皮肤细胞的快速代谢转换。
N.感染性疾病
在一些实施方案中，本公开的RTA 408、多晶型物和方法可用于治疗感染性疾病，包括病毒感染和细菌感染。如上文所述，所述感染可与严重的局部或全身性炎性反应相关。举例来说，流感可引起严重的肺部炎症并且细菌感染可引起全身性过度炎性反应，包括多种炎性细胞因子的过量产生，这是败血症的标志。另外，本发明的化合物可用于直接抑制病毒病原体的复制。先前的研究已证明例如CDDO的相关化合物可抑制HIV在巨噬细胞中的复制(Vazquez等人，2005)。其它研究已表明抑制NF-κB信号传导可抑制流感病毒复制，并且环戊烯酮***素可抑制病毒复制(例如Mazur等人，2007；Pica等人，2000)。
本发明涉及使用化合物RTA 408或其药学上可接受的盐、或该化合物的多晶型物(例如本文在上文或下文所述的多晶型物中的任一种)、或包含任一种上述实体和药学上可接受的载体的药物组合物(包括例如上述药物组合物)治疗或预防上文在第1V部分中提到的疾病/病症/病况中的每一种。
V.药物制剂和施用途径
RTA 408可通过多种方法施用，例如口服或通过注射(例如皮下、静脉内、腹膜内等)施用。根据施用途径，可以某种材料包被活性化合物以保护所述化合物免于可使所述化合物失活的酸和其它天然条件的作用。它们还可通过对疾病或创伤部位连续灌注/输注来施用。
为了通过除肠胃外施用以外的方式施用RTA 408，可能有必要用防止其失活的物质包被所述化合物，或共同施用所述化合物与所述物质。举例来说，可在例如脂质体或稀释剂的适当载体中对患者施用治疗性化合物。药学上可接受的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规脂质体(Strejan等人，1984)。
RTA 408还可肠胃外、腹膜内、脊柱内或脑内施用。可在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中以及在油中制备分散液。在通常的储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物的生长。
可根据需要通过将所需量的RTA 408与上文所列举的一种成分或成分的组合一起并入到适当的溶剂中、之后进行过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，分散液是通过将治疗性化合物并入到含有基本分散介质和上文所列举的那些成分中的所需其它成分的无菌载体中来制备的。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其用先前经过无菌过滤的溶液获得活性成分(即治疗性化合物)加上任何另外期望成分的粉末。
可使用直接喷雾干燥程序使RTA 408成为完全非晶形的。RTA 408可利用例如惰性稀释剂或可同化的可食用载体口服施用。还可将治疗性化合物和其它成分包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制成片剂，或直接并入到患者的饮食中。对于口服治疗性施用来说，治疗性化合物可与例如赋形剂一起并入且以下列形式使用：可摄取片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊(包括硬胶囊或软胶囊)、酏剂、乳液、固体分散系、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂等。当然，治疗性化合物在所述组合物和制剂中的百分比可变化。治疗性化合物在所述治疗上有用的组合物中的量使得将获得合适剂量。
尤其有利的是，为了易于施用和剂量均匀，以单位剂型配制肠胃外组合物。如本文所用的单位剂型是指适合作为单位剂量用于所要治疗的患者的物理离散单位，每个单位含有经计算与所需的药物载体联合产生期望治疗作用的预定量的治疗性化合物。本发明的单位剂型的规格决定于且直接取决于以下因素：(a)治疗性化合物的独特特征和所要实现的特定治疗作用，和(b)调配所述治疗性化合物以治疗患者的所选病况的技术内固有的限制。
RTA 408还可被表面局部地施用到皮肤、眼或粘膜。在一些实施方案中，所述化合物可被制备成洗剂、乳膏、凝胶、油、软膏、油膏、溶液、混悬液或乳液。或者，如果期望局部递送到肺，则治疗性化合物可以干粉或气溶胶制剂的形式通过吸入施用。
RTA 408通常将以足以治疗与给定患者相关的病况的治疗有效剂量施用。举例来说，可在可预测在治疗人类疾病方面的功效的动物模型***(例如实施例和附图中所示的模型***)中评价化合物的功效。
对患者施用的RTA 408或包含RTA 408的组合物的实际剂量可根据身体因素和生理因素来确定，所述身体因素和生理因素例如年龄、性别、体重、病况的严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时进行的治疗干预、所述患者的特发病和施用途径。这些因素可由本领域技术人员确定。负责施用的从业人员通常将确定组合物中活性成分的浓度和用于单个患者的适当剂量。如果发生任何并发症，则所述剂量可由单个医师进行调整。
有效量通常将在约0.001mg/kg到约1000mg/kg、约0.01mg/kg到约750mg/kg、约100mg/kg到约500mg/kg、约1.0mg/kg到约250mg/kg、约10.0mg/kg到约150mg/kg范围内变动，每天以一剂或多剂施用，持续一天或数天(当然，这取决于施用方式和上文所论述的因素)。其它合适的剂量范围包括每天1mg到10000mg、每天100mg到10000mg、每天500mg到10000mg和每天500mg到1000mg。在一些具体的实施方案中，所述量小于每天10,000mg，在每天750mg到9000mg范围内。
所述有效量可小于1毫克/公斤/天、小于500毫克/公斤/天、小于250毫克/公斤/天、小于100毫克/公斤/天、小于50毫克/公斤/天、小于25毫克/公斤/天、或小于10毫克/公斤/天。或者，其可在1毫克/公斤/天到200毫克/公斤/天的范围内。在一些实施方案中，所述量可为10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg或150mg/kg，被配制成于芝麻油中的混悬液，如下文于实施例C1中所述。在一些实施方案中，所述量可为3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg，每天经由经口灌胃施用，如下文于实施例C2和C3中所述。在一些实施方案中，所述量可为10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg，口服施用，如下文于实施例C6中所述。举例来说，对于糖尿病患者的治疗，单位剂量可为将血糖相比于未接受治疗的患者降低至少40％的量。在另一个实施方案中，单位剂量是将血糖降低到非糖尿病患者的血糖水平±10％的水平的量。
在其它非限制性示例中，剂量还可包含每次施用每公斤体重约1μg、每公斤体重约5μg、每公斤体重约10μg、每公斤体重约50μg、每公斤体重约100μg、每公斤体重约200μg、每公斤体重约350μg、每公斤体重约500μg、每公斤体重约1mg、每公斤体重约5mg、每公斤体重约10mg、每公斤体重约50mg、每公斤体重约100mg、每公斤体重约200mg、每公斤体重约350mg、每公斤体重约500mg到每公斤体重约1000mg或更高，以及可从其中导出的任何范围。在可从本文所列出的数字导出的范围的非限制性示例中，可基于上述数字施用每公斤体重约5mg到每公斤体重约100mg、每公斤体重约5μg到每公斤体重约500mg等的范围。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物可包含例如至少约0.01％的RTA 408。在其它实施方案中，RTA 408可例如占所述单位重量的约0.01％到约75％或约0.01％到约5％，以及可从其中导出的任何范围。在一些实施方案中，RTA 408可以例如0.01％、0.1％或1％的于芝麻油中的混悬液的制剂形式使用，如下文于实施例F和G中所述。在一些实施方案中，RTA 408可使用药学上合适的载体或以混悬液、乳液或溶液的形式以约0.01％到10％范围内的浓度配制用于对皮肤或眼表面局部施用。在一些实施方案中，所述浓度在约0.1％到约5％范围内。最佳浓度可根据靶器官、具体制剂和要治疗的病况而变化。
考虑了单剂或多剂的包含RTA 408的药剂。递送多剂的所需时间间隔可由本领域普通技术人员仅采用常规实验来确定。作为示例，可以约12小时间隔对患者每天施用两次剂量。在一些实施方案中，所述药剂每天施用一次。所述药剂可按照常规的时间表施用。如本文所用的常规时间表是指预定的指定时间段。常规时间表可涵盖相同或时间长度不同的时间段，只要所述时间表是预定的即可。举例来说，常规时间表可包括每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每周一次、每月一次或其间任何设定的天数或周数一次施用。或者，预定的常规时间表可包括第一周按每天两次施用，之后数月按每天一次施用等。在其它实施方案中，本发明规定，所述药剂可口服并且给药时间取决于或不取决于食物摄入。因此，例如，所述药剂可在每天早晨和/或每天夜晚服用，而不管是在患者已经进食时还是将要进食时。
VI.组合疗法
除用作单一疗法外，本发明中所述的RTA 408和多晶型物还可用于组合疗法中。有效的组合疗法可利用包括两种药剂的单一组合物或药理学制剂或利用同时施用的两种不同组合物或制剂来实现，其中一种组合物包括RTA 408或它的多晶型物，并且另一种组合物包括第二药剂。该另一治疗方式可在施用RTA 408或它的多晶型物之前、同时或之后施用。使用RTA408或它的多晶型物的疗法可与在之后或之前其它药剂的施用相隔数分钟到数周范围内的时间间隔。在分开施用另一药剂与RTA 408或它的多晶型物的实施方案中，一般将确保在每次递送的时间之间有效的时间段尚未到期，使得每种药剂仍将能够发挥有利组合的作用。在所述情况下，考虑了通常会在彼此相隔约12-24小时内、更优选在彼此相隔约6-12小时内施用RTA 408或多晶型物与另一治疗剂，其中仅约12小时的延迟时间是最优选的。然而，在一些情况下，可能期望显著延长治疗的时间段，其中在对应的施用之间相隔数天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)到数周(1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周)。
还可以设想的是，将期望施用RTA 408或它的多晶型物或另一药剂超过一次。在这一点上，可采用各种组合。作为说明，倘若RTA 408或它的多晶型物是“A”并且另一药剂是“B”，则基于总共3次和4次施用的以下排列是示例性的：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B。
同样考虑了其它组合。可用于本发明中的药理学药剂的非限制性示例包括已知在癌症治疗中有益的任何药理学药剂。在一些实施方案中，考虑了RTA 408或它的多晶型物与癌症靶向免疫疗法、基因疗法、放射疗法、化学治疗剂或手术的组合。还考虑了RTA 408或它的多晶型物与上述方法中的超过一种的组合，上述方法包括超过一种类型的特异性疗法。在一些实施方案中，免疫疗法可为其它癌症靶向抗体，例如但不限于曲妥珠单抗阿仑单抗(alemtuzumab)贝伐单抗西妥昔单抗和帕尼单抗(panitumumab)或缀合抗体，例如替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)托西莫单抗(tositumomab)布妥昔单抗(brentuximab vedotin)阿恩曲珠单抗(ado-trastuzumab emtansine)(KadcylaTM)或地尼白介素2(denileukin dititox)此外，在一些实施方案中，设想将RTA 408或它的多晶型物与基于树突细胞的免疫疗法(例如Sipuleucel-T)或过继性T细胞免疫疗法用于组合疗法中。
此外，考虑了将RTA 408或它的多晶型物与化学治疗剂组合使用，所述化学治疗剂例如但不限于蒽环类抗生素、紫杉烷、甲氨蝶呤、米托蒽醌、雌氮芥、多柔比星、依托泊苷、长春碱、卡铂、长春瑞滨、5-氟尿嘧啶、顺铂、托泊替康、异环磷酰胺、环磷酰胺、表柔比星、吉西他滨、长春瑞滨、伊立替康、依托泊苷、长春碱、培美曲塞(pemetrexed)、美法仑、卡培他滨和奥沙利铂。在一些实施方案中，将RTA 408或它的多晶型物与放射疗法组合使用，所述放射疗法包括但不限于使用电离辐射。在一些实施方案中，癌症治疗剂的作用通过与RTA 408和它的多晶型物一起施用而被协同增强。在一些实施方案中，将包括RTA 408的组合疗法用于治疗癌症，包括例如***癌。参见例如下文的实施例H。
在一些实施方案中，所述方法可进一步包括(1)在使肿瘤细胞与第二化学治疗剂接触之前使所述肿瘤细胞与所述化合物接触，(2)在使肿瘤细胞与所述化合物接触之前使所述肿瘤细胞与第二化学治疗剂接触，或(3)使肿瘤细胞同时与所述化合物和所述第二化学治疗剂接触。在某些实施方案中，第二化学治疗剂可为抗生素、抗炎剂、抗肿瘤剂、抗增殖剂、抗病毒剂、免疫调节剂或免疫抑制剂。在其它实施方案中，第二化学治疗剂可为烷基化剂、雄激素受体调节剂、细胞骨架破坏剂、***受体调节剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、异戊二烯蛋白转移酶抑制剂、类视色素受体调节剂、拓扑异构酶抑制剂、或酪氨酸激酶抑制剂。在某些实施方案中，第二化学治疗剂为5-阿扎胞苷、5-氟尿嘧啶、9-顺式-视黄酸、放线菌素D、阿利维甲酸、全反式维甲酸、安那霉素、阿西替尼、贝利司他、贝伐单抗、贝沙罗汀、博舒替尼、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、CD437、西地尼布、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、道诺霉素、地西他滨、多西他赛、多拉司他汀-10、去氧氟尿苷、多柔比星、多柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗奥佐米星、六甲蜜胺、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康、异维甲酸、伊沙匹隆、拉帕替尼、LBH589、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、MS-275、来那替尼、尼罗替尼、亚硝基脲、奥沙利铂、紫杉醇、普卡霉素、丙卡巴肼、司马沙尼、司莫司汀、丁酸钠、苯乙酸钠、链脲霉素、辛二酰苯胺异羟肟酸、舒尼替尼、他莫昔芬、替尼泊苷、塞替派、硫鸟嘌呤、托泊替康、TRAIL、曲妥珠单抗、维甲酸、曲古抑菌素A、丙戊酸、戊柔比星、凡德他尼、长春碱、长春新碱、长春地辛或长春瑞滨。
另外，考虑了利用本公开的RTA 408、多晶型物和药物组合物治疗心血管疾病的组合疗法。举例来说，除了本公开的RTA 408、多晶型物和药物组合物之外，所述方法还可进一步包括施用药学有效量的一种或多种心血管药物。所述心血管药物可为但不限于例如降胆固醇药、抗高血脂药、钙通道阻断剂、抗高血压药或HMG-CoA还原酶抑制剂。在一些实施方案中，心血管药物的非限制性示例包括氨氯地平、阿司匹林、依泽替米贝、非洛地平、拉西地平、乐卡地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平、尼索地平或尼群地平。在其它实施方案中，心血管药物的其它非限制性示例包括阿替洛尔、布新洛尔、卡维地洛、可乐定、多沙唑嗪、吲哚拉明、拉贝洛尔、甲基多巴、美托洛尔、纳多洛尔、氧烯洛尔、酚苄明、酚妥拉明、吲哚洛尔、哌唑嗪、***、特拉唑嗪、噻吗洛尔或妥拉唑林。在其它实施方案中，心血管药物可为例如他汀类药物，例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀或辛伐他汀。
VII.实施例
包括以下实施例以表明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当了解，以下实施例中所公开的技术代表了本发明人发现的在实施本发明中良好地发挥作用的技术，并且因此可被视为构成实施本发明的优选方式。然而，本领域技术人员根据本公开应当了解，可在不脱离本发明精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案作出许多改变，并且仍然获得相同或类似的结果。
A.RTA 408(63415)的合成
试剂和条件：(a)(PhO)2PON3(DPPA)、Et3N、甲苯，在0℃持续5分钟，然后在室温过夜，约94％；(b)苯，在80℃持续2小时；(c)HCl、CH3CN，在室温持续1小时；(d)CH3CF2CO2H、DCC、DMAP、CH2Cl2，在室温过夜，从RTA401开始(4个步骤)，73％。
化合物1：在搅拌下向反应器中的甲苯溶液(400mL)中添加RTA 401(其可根据例如由Honda等人，1998；Honda等人，2000b；Honda等人，2002；Yates等人，2007；以及美国专利6,326,507和6,974,801教导的方法制备，这些文献以引用方式并入本文中)(20.0g，40.6mmol)和Et3N(17.0mL，122.0mmol)并且冷却到0℃。在搅拌下在0℃经过5分钟添加二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)(13.2mL，61.0mmol)并且在室温下将所述混合物连续搅拌过夜(HPLC-MS检查显示无RTA 401剩余)。将反应混合物直接加到于硅胶柱上并且通过柱色谱(硅胶，含0％到5％EtOAc的CH2Cl2)纯化，得到呈白色泡沫状的化合物1(19.7g，约94％，部分转化成化合物2)。
化合物2：将化合物1(19.7g，约38.1mmol)和苯(250mL)添加到反应器中并且在搅拌下加热到80℃，持续2小时(HPLC-MS检查显示无化合物1剩余)。将反应混合物在减压下浓缩，得到呈固体残余物形式的粗化合物2，所述粗化合物2未经纯化即用于下一步骤。
化合物3：在搅拌下将粗化合物2(≤38.1mmol)和CH3CN(200mL)添加到反应器中并且冷却到0℃。在0℃经过1分钟添加HCl(12N，90mL)并且在室温下将所述混合物连续搅拌1小时(HPLC-MS检查显示无化合物2剩余)。将反应混合物冷却到0℃并且在搅拌下添加10％NaOH(约500mL)。然后，在搅拌下添加饱和NaHCO3(1L)。通过EtOAc(2×500mL)对水相进行萃取。通过H2O(200mL)、饱和NaCl(200mL)洗涤合并的有机相，经Na2SO4干燥并且浓缩，得到呈浅黄色泡沫状的粗化合物3(16.62g)，所述粗化合物3未经纯化即用于下一步骤。
RTA 408：在搅拌下在室温下将粗胺3(16.62g，35.9mmol)、CH3CF2CO2H(4.7388g，43.1mmol)和CH2Cl2(360mL)添加到反应器中。然后，添加二环己基碳化二亚胺(DCC)(11.129g，53.9mmol)和4-(二甲基氨基)-吡啶(DMAP)(1.65g，13.64mmol)并且在室温下将所述混合物连续搅拌过夜(HPLC-MS检查显示无化合物3剩余)。将反应混合物过滤以去除固体副产物并将滤液直接加到硅胶柱上并且通过柱色谱(硅胶，含0％到20％EtOAc的己烷)纯化两次，得到呈白色泡沫状的化合物RTA 408(16.347g，73％，从RTA 401开始经4个步骤)：1H NMR(400MHz，CD3Cl)δ8.04(s，1H)，6.00(s，1H)，5.94(s，br，1H)，3.01(d，1H，J＝4.8Hz)，2.75-2.82(m，1H)，1.92-2.18(m，4H)，1.69-1.85(m，7H)，1.53-1.64(m，1H)，1.60(s，3H)，1.50(s，3H)，1.42(s，3H)，1.11-1.38(m，3H)，1.27(s，3H)，1.18(s，3H)，1.06(s，3H)，1.04(s，3H)，0.92(s，3H)；m/z 555(M+1)。
B.药效动力学
下面提供评价RTA 408的主要药效动力学作用的体外和体内研究的概要。
1.RTA 408对Keap1-Nrf2和NF-κB的体外作用
AIM对IFNγ诱导的NO产生的抑制具有Nrf2依赖性(Dinkova-Kostova，2005)。将RAW264.7小鼠巨噬细胞以30，000个细胞/孔于补充有0.5％FBS的RPMI 1640中接种到96孔板中(一式三份)并且在37℃在5％CO2下孵育。第二天，用DMSO(媒介物)或RTA 408将细胞预处理2小时，之后用20ng/mL的小鼠IFNγ处理24小时。使用格里斯试剂***(GriessReagent System)(目录编号：G2930，Promega)，根据制造商的说明书测量培养基中作为一氧化氮的替代物的亚硝酸根(NO2 -)的水平，这是因为亚硝酸根是NO的主要的稳定分解产物。使用wST-1细胞增殖试剂(Cell Proliferation Reagent)(目录编号：11644807001，RocheApplied Science)，根据制造商的说明书来评估细胞活力。基于针对细胞活力归一化的对IFNγ诱导的一氧化氮产生的抑制来确定IC50值。用RTA 408处理引起对IFNγ诱导的NO产生的剂量依赖性抑制，平均IC50值为3.8±1.2nM。来自代表性实验的结果示于图1中。发现RTA408的IC50值比化合物63170(8±3nM)、63171(6.9±0.6nM)、63179(11±2nm)和63189(7±2nM)的IC50值低45％-65％。63170、63171、63179和63189是具有下式的化合物：
2.RTA 408对Nrf2靶基因的作用
在两种不同的萤光素酶报告基因测定中测试RTA 408以评估ARE的活化。所测试的第一种萤光素酶报告基因受源自于人类NQO1基因的启动子的单个ARE的控制，其允许对培养的哺乳动物细胞中Nrf2转录因子的内源性活性进行定量评估。NQO1-ARE萤光素酶报告基因质粒的萤火虫萤光素酶的表达受Nrf2与对应于在人类NADPH：醌氧化还原酶1(NQO1)基因的启动子区中所鉴别出的抗氧化反应元件(ARE)的特异性增强子序列的结合的控制(Xie等人，1995)。通过使用HindIII/XhoI克隆位点(新泽西州皮斯卡塔韦的GenScript公司(GenScript Corp.，Piscataway，NJ))将人类NQO1-ARE(5′-CAGTCACAGTGACTCAGCAGAATCTG-3′)***到pLuc-MCS载体中来建构NQO1-ARE-萤光素酶报告基因质粒。使用脂质转染胺(Lipofectamine)2000(Invitrogen)，利用NQO1-ARE萤光素酶报告基因质粒和pRL-TK质粒对被维持在补充有10％FBS以及100U/mL(各自)的青霉素和链霉素的DMEM(Invitrogen)中的HuH-7人类肝细胞瘤细胞系进行瞬时转染，所述pRL-TK质粒组成性地表达海肾(Renilla)萤光素酶并且被用作转染水平归一化的内部对照。转染30小时后，用RTA 408将细胞处理18小时。通过Dual-Glo萤光素酶测定(Luciferase Assay)(目录编号：E2920，Promega)测定萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的活性，并且在L-Max II光度计(Molecular Devices)上测量发光信号。针对海肾萤光素酶活性将萤火虫萤光素酶活性归一化，并且计算归一化的萤火虫活性相对于媒介物对照组(DMSO)的诱导倍数。图2a示出了在这一细胞系中RTA 408对萤光素酶活性的剂量依赖性诱导。值代表三次独立实验的平均值。需要比63189(14.9nM)少20％的RTA 408(12nM)将HuH-7细胞中NQO1ARE的转录增加2倍。同样，需要分别是63170(25.2nM)和63179(29.1nM)的5/12-10/21的RTA 408将HuH-7细胞中NQO1ARE的转录增加2倍。
还在AREc32报告细胞系中评估了RTA 408对萤光素酶报告基因活化的作用。这一细胞系源自于人类乳腺癌MCF-7细胞并且被受到8拷贝的大鼠GSTA2ARE序列的转录控制的萤火虫萤光素酶报告基因稳定地转染(Wang等人，2006，其以引用方式并入本文中)。在用RTA 408处理18小时后，使用ONE-Glo萤光素酶测定***(Promega，目录编号：E6110)，根据制造商的说明书来测量萤火虫萤光素酶活性。在AREc32报告细胞系中观察到剂量依赖性反应(图2b)。在NQO1-ARE报告基因测定***与GSTA2-ARE报告基因测定***这两者中用15.6nM RTA 408处理后，均明显有对萤光素酶活性的约2倍的诱导。当查看来自GSTA2-ARE(AREc32)萤光素酶活性研究以及WST1活力研究的结果时，可将63415(RTA 408)对GSTA2-ARE诱导的作用与RTA 402、63170、63171、63179和63189的作用直接进行比较(图3a-f)。在萤光素酶报告基因测定中，相比于RTA 402的值，63415显示出这5种比较化合物中对GSTA2-ARE介导的转录的最快诱导作用，它需要93nM的浓度以达到4倍的诱导。所有其它化合物均仅在高得多的浓度下显示出类似的诱导作用，63170需要171nM的浓度，63171需要133nM的浓度，63179需要303nM的浓度并且63189需要174nM的浓度来实现对萤光素酶活性的4倍诱导。这些值相当于为了产生相同量的活性相比于RTA 402需要增加到1.86倍(63415)、3.40倍(63170)、2.65倍(63171)、6.05倍(63179)和3.47倍(63189)的活性化合物的量。
RTA 408还被证实增加了已知的Nrf2靶基因在HFL1人类胎肺成纤维细胞和BEAS-2B人类支气管上皮细胞系中的转录物水平。在补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的F-12K培养基中培养HFL1细胞。在补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM/F-12培养基中培养BEAS-2B细胞。将细胞以2.5×105个细胞/孔的密度接种到6孔培养皿中。第二天，用DMSO(媒介物)或RTA 408(7.8nM、15.6nM、31.3nM、62.5nM或125nM)将细胞处理18小时。每个孔均接收相同量的媒介物。在处理后，去除培养基并且使用RLT缓冲液(Qiagen)收获细胞。使用QIAShredder柱(Qiagen，目录编号：79654)将溶解产物匀浆并且使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen，目录编号：74104)分离RNA。为了进行反转录，将RNA(1μg)与Oligo(dT)12-18引物和H2O组合，最终体积为23.25μL。将混合物加热到70℃，持续10分钟，然后放在冰上。将含有8μL5×第1链缓冲液、2μL1mg/mL BSA、2μL 20mM DTT、4μL 5mM dNTP昆合物、0.25μLRNaseOUTTM和0.5μLII反转录酶的主混合物添加到RNA混合物中并且在42℃孵育1小时。通过加热到70℃并持续10分钟使反应物失活。在用于qPCR中之前，将所述反应混合物用H2O 1∶3稀释。将2.5μL稀释过的反转录反应物与一组PCR引物(0.36μM最终浓度)、2×iQTM Green Supermix(Bio-Rad，目录编号：170-8885)和H2O组合达到20μL的最终体积。PCR引物的序列如下：谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚单位(GCLM)正向引物5′-GCTGTGGCTACTGCGGTATT-3′(SEQ ID NO：1)，反向引物5′-ATCTGCCTCAATGACACCAT-3′(SEQID NO：2)；血红素加氧酶-1(HMOX1)正向引物5′-TCCGATGGGTCCTTACACTC-3′(SEQ ID NO：3)，反向引物5′-TAGGCTCCTTCCTCCTTTCC-3′(SEQ ID NO：4)；NAD(P)H脱氢酶醌1(NQO1)正向引物5′-AAAACACTGCCCTCTTGTGG-3′(SEQ ID NO：5)，反向引物5′-GTGCCAGTCAGCATCTGGTA-3′(SEQ ID NO：6)；核糖体蛋白S9(RPS9)正向引物5′-GATGAGAAGGACCCCACGGCGTCTG-3′(SEQID NO：7)，反向引物5′-GAGACAATCCAGCAGCCCAGGAGGG-3′(SEQ ID NO：8)；硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)正向引物5′-ATTGCCACTGGTGAAAGACC-3′(SEQ ID NO：9)，反向引物5′-ACCAATTTTGTTGGCCATGT-3′(SEQ ID NO：10)。已预先对所有引物的特异性和扩增效率进行了确认。使用以下循环条件来扩增cDNA：(95℃3分钟，44个循环的95℃30秒、60℃15秒、72℃15秒，之后是55℃到95℃的解链曲线，增量为0.5℃)。使用比较CT方法(ΔΔCT)确定每个Nrf2靶基因的相对丰度。在三个重复孔中对每个样品运行PCR反应。使用上述条件进行两次独立实验。用RTA 408将HFL1肺成纤维细胞处理18小时使得包括NQO1、HMOX1、GCLM和TXNRD1在内的若干种Nrf2靶基因的表达增加，如通过定量PCR所测量(图4a-d)。对于所测试的所有基因来说，RTA 408的诱导作用具有剂量依赖性并且在低到15.6nM的浓度下也是明显的。用RTA 408将BEAS-2B支气管上皮细胞处理18小时使得所评价的所有Nrf2靶基因出现类似的剂量依赖性增加(图5a-d)。RTA408在类似的浓度下也使Nrf2靶基因在正常人类肾小球系膜细胞(nHMC)、小鼠BV2小神经胶质细胞系和人类SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞系中的表达增加。
在用RTA 408处理后，通过蛋白质印迹来测量Nrf2靶标NQO1和HMOX1在SH-5Y5Y细胞和BV-2细胞中的蛋白质水平。将SH-SY5Y细胞以4×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中。将BV-2细胞以2.5×104个细胞/孔的密度接种到6孔板中。在接种后24小时(BV-2)或48小时(SH-SY5Y)，用RTA 408将细胞处理24小时。在处理后，用冷PBS将细胞洗涤两次并且收获于溶解缓冲液中。对细胞进行声波处理并且通过离心(以18,000rcf进行10分钟，BeckmanCoulter的微量离心18离心机)清除碎片。使用Bio-Rad蛋白质试剂以BSA作为标准物对上清液中的总蛋白质进行定量。在SDS-PAGE上分离等量的总细胞蛋白质，并且将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将膜在含有5％牛奶的TBST(1×含有0.1％Tween-20的TBS)中封闭1小时，用TBST洗涤3次，并且与一抗在4℃孵育过夜。NQO1抗体来自Abcam(编号：AB2346)；HMOX1(HO-1)抗体来自Santa Cruz(编号：sc-10789)；肌动蛋白抗体来自Millipore(编号：MAB1501)。在用TBST洗涤后，在室温下将二抗添加于TBST+5％牛奶中，持续1小时。亲和纯(AffiniPure)山羊抗兔或抗小鼠IgG二抗来自Jackson ImmunoResearch(目录编号分别为111-035-144和115-035-146)。将膜在TBST中洗涤，使用ECL显影，并且对X射线胶片进行曝光。用RTA 408处理也以剂量依赖性方式使SH-SY5Y细胞中NQO1蛋白质水平增加(图6a)。在未处理的SH-SY5Y细胞或经RTA 408处理的SH-SY5Y细胞中未检测到HMOX1蛋白质。在BV2细胞中，用RTA 408处理在一直到125nM的浓度下使NQO1和HMOX1的蛋白质水平增加(图6b)。RTA 408对SK-N-SH细胞中Nrf2蛋白质表达的诱导的EC50值(56.4nM)比63171(122nM)、63189(102nM)和63179(126nM)的EC50值低45％-65％。需要相同量的63170(54.6nM)。
使用细胞内蛋白质印迹NQO1测定来测量EC50，其中将所述细胞与所评价的化合物一起孵育三天。在与所关注的化合物一起孵育后，使所述细胞与小鼠NQO1抗体反应，然后在第二天使所述细胞与IRDye-800CW-抗小鼠IgG抗体反应。使目标信号可视化，然后进行分析。
与对Nrf2靶基因和相应的蛋白质产物的诱导一致，将RAW264.7小鼠巨噬细胞处理24小时也以剂量依赖性方式使NQO1酶活性增强，在7.8nM下的增加是明显的(图7)。通过改良的普罗查斯卡测定(Prochaska assay)来测量NQO1酶活性(Prochaska和Santamaria，Anal Biochem.169：328-336，1988，其以引用方式并入本文中)。
总之，这些来自多种细胞系的数据证明用RTA 408进行的处理增强了由抗氧化反应元件控制的转录活性，增加了Nrf2靶基因的表达并且增强了Nrf2靶基因产物NQO1的活性。
3.RTA 408对细胞氧化还原能力标记物的作用
谷胱甘肽和NADPH是维持细胞氧化还原能力所需的关键因子。参与合成谷胱甘肽(例如GCLC和GLCM)和NADPH[例如己糖-6-磷酸脱氢酶(H6PD)和苹果酸酶1(ME1)]的多种基因已被证明受Nrf2调节(Wu，2011)。在小鼠AML-12肝细胞细胞系中使用GSH-GloTM谷胱甘肽测定试剂盒(Promega，目录编号：V6912)，根据制造商的说明书评价RTA 408处理对总谷胱甘肽水平的作用。用RTA 408将AML-12细胞处理24小时以剂量依赖性方式使总细胞谷胱甘肽水平增加(图8)。所示的数据代表了两次独立实验。在低到15.6nM的RTA 408浓度下观察到总谷胱甘肽增加到＞2倍。使用RAW264.7小鼠模型时，RTA 408对谷胱甘肽水平的诱导的EC50值(9.9nM)比63170(12.1nM)、63171(23.2nM)和63189(16nM)的EC50值低22％-57％。
在HCT-116细胞中评价RTA 408处理对NADPH水平的作用，如通过氧化还原敏感性染料WST-1(Roche Applied Science，目录编号：11644807001)的吸光度所测量。WST-1吸光度常用于通过测量活细胞对NAD(P)H的糖酵解产生来评估细胞活力。因此，在对细胞活力不存在任何作用而NADPH产生增加的情况下，WST-1吸光度也会增加(Berridge等人，1996，其以引用方式并入本文中)。参与NADPH产生的多种关键基因也已被证实受Nrf2调节(Thimmulappa等人，2002；Wu等人，2011，这两篇文献均以引用方式并入本文中)。RTA 408处理24小时以剂量依赖性方式使WST-1吸光度增加(图9)，表明NADPH水平增加。
还在这一研究中评价了RTA 408对参与NADPH合成通路的基因的表达的作用。用RTA 408将HCT-116细胞处理24小时，并且使用定量PCR测量H6PD、磷酸葡糖酸脱氢酶(PGD)、转酮醇酶(TKT)和ME1的mRNA水平。将HCT-116细胞以3×105个细胞/孔的密度接种到6孔培养皿中。第二天，用DMSO(媒介物)、10nM RTA 408或50nM RTA 408将细胞处理24小时。每个孔接收相同量的媒介物。在处理后，去除培养基并且使用RLT缓冲液(Qiagen)收获细胞。使用QIAShredder柱(Qiagen，目录编号：79654)将溶解产物均质化并且使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，目录编号：74104)分离RNA。为了进行反转录，将RNA(1μg)与Oligo(dT)12-18引物和H2O组合，最终体积为23.25μL。将混合物加热到70℃，持续10分钟，然后放到冰上。将含有8μL 5×第1链缓冲液、2μL 1mg/mL BSA、2μL 20mM DTT、4μL 5mM dNTP混合物、0.25μLRNaseOUTTM和0.5μLII反转录酶的主混合物添加到RNA混合物中并且在42℃孵育1小时。通过加热到70℃并持续10分钟使所述反应物失活。在用于qPCR中之前，将所述反应混合物用H2O 1∶3稀释。将2.5μL稀释过的反转录反应物与一组PCR引物(0.36μM最终浓度)、2×iQTM Green Supermix(Bio-Rad，目录编号：170-8885)和H2O组合达到20μL的最终体积。PCR引物的序列如下：核糖体蛋白S9(RPS9)正向引物5′-GATGAGAAGGACCCCACGGCGTCTG-3′(SEQ ID NO：7)，反向引物5′-GAGACAATCCAGCAGCCCAGGAGGG-3′(SEQ ID NO：8)；己糖-6-磷酸脱氢酶(H6PD)正向引物5′-GAGGCCGTGTACACCAAGAT-3′(SEQ ID NO：11)，反向引物5′-AGCAGTGGGGTGAAAATACG-3′(SEQID NO：12)；磷酸葡糖酸脱氢酶(PGD)正向引物5′-AAGGCACTCTACGCTTCCAA-3′(SEQ ID NO：13)，反向引物5′-AGGAGTCCTGGCAGTTTTCA-3′(SEQ ID NO：14)；转酮醇酶(TKT)正向引物5′-CATCTCCGAGAGCAACATCA-3′(SEQ ID NO：15)，反向引物5′-TTGTATTGGCGGCTAGTTCC-3′(SEQID NO：16)；苹果酸酶1(ME1)正向引物5′-TATATCCTGGCCAAGGCAAC-3′(SEQ ID NO：17)反向引物5′-GGATAAAGCCGACCCTCTTC-3′(SEQ ID NO：18)。已预先对所有引物的特异性和扩增效率进行了确认。使用以下循环条件来扩增cDNA：(95℃3分钟，44个循环的95℃30秒、60℃15秒、72℃15秒，之后是55℃到95℃的解链曲线，增量为0.5℃)。使用比较CT方法(ΔΔCT)确定每个Nrf2靶基因的相对丰度。在三个重复孔中对每个样品运行PCR反应。使用上述条件进行两次独立实验。用RTA 408处理使得参与NADPH合成的基因的表达出现剂量依赖性增加(图10a-d)。
总之，用RTA 408处理增加了AML-12肝细胞中的总谷胱甘肽水平并且增加了HCT-116细胞中的WST-1吸光度，即NADPH产生的标记物。这一观察结果与编码参与NADPH合成的酶的多种关键基因的表达增加具有相关性。
4.RTA 408对TNFα诱导的NF-κB信号传导的作用
NF-κB是在许多免疫反应和炎性反应的调节中起重要作用的转录因子。RTA 402和其它AIM已被证实能抑制多种细胞系中的促炎性NF-κB信号传导(Shishodia，2006；Ahmad，2006；Yore，2006)。使用小鼠NIH3T3/NF-κB-luc细胞系(Panomics)，探究RTA 408和化合物63171、63179、63170和63189对NF-κB-Luc报告基因的作用。NIH3T3/NF-κB-luc细胞系持有由8拷贝的NF-κB反应元件调节的萤火虫萤光素酶报告基因构建体的染色体整合。可通过测量NF-κB IC50的值对这些化合物的作用进行定量。RTA 408显示出1.2μM的IC50，在针对活力进行归一化时显示出1.4μM的IC50。其它4种化合物显示出1.7μM、0.2μM、1.1μM和1.1μM的NIH3T3/NF-κB IC50值，在针对活力进行归一化时分别显示出1.8μM、0.6μM、1.1μM和1.0μM的IC50值。在图11a和b中，将RTA 408和其对NF-κB的作用作为给予剂量和相对变化倍数的函数绘图，并给出了WST1和WST1/2。在HeLa/NF-κB-Luc细胞中评价RTA 408对TNFα诱导的NF-κB信号传导的作用，所述细胞为被受到多种NF-κB转录反应元件控制的萤光素酶报告基因构建体稳定转染的人类***细胞系。用RTA 408将HeLa/NF-κB-Luc细胞预处理1小时，之后用TNF-α(10ng/mL)另外处理5小时。在处理后，测量发光，并且确定RTA 408预处理对TNF-α诱导的萤光素酶活性的作用。来自三次独立实验的平均结果和标准偏差示于图12中。RTA408以517±83nM的IC50值剂量依赖性地抑制TNF-α诱导的NF-κB活化。在另一种NF-κB报告细胞系(A549/NF-κB-Luc)中观察到类似结果，其中RTA 408以627nM(在614-649nM范围内)的IC50值抑制TNF-α诱导的NF-κB活化。RTA 408减少NF-κB启动子报告基因在HeLa/NF-κB-Luc细胞中的表达的效率分别是63189(854nM)和63170(953nM)的1.6-1.8倍。利用人类A549细胞系进行的进一步的实验显示RTA 408的IC50为1.7μM并且已针对活力经过归一化的值为1.7μM。RTA 408的IC50显示出类似于63189、63179、63171和63170的活性，所述63189、63179、63171和63170分别显示出1.1μM、1.4μM、2.0μM和1.0μM的IC50值。当针对活力对那些值进行归一化时，测定分别显示1.2μM、1.5μM、2.1μM和1.1μM的IC50。绘制随RTA 408浓度而变化的NF-κB的变化倍数以及WST1和WST1/2曲线并且将其示于图13a和13b中。
还在HeLa细胞中评价RTA 408对TNF-α诱导的IκBα磷酸化的作用，所述IκBα磷酸化是NF-κB通路活化中的一个关键步骤。用RTA 408将HeLa细胞预处理6小时，之后用TNF-α(20ng/mL)处理5分钟。通过蛋白质印迹评价IκBα的总水平和磷酸化水平。IκBα一抗来自Santa-Cruz(sc-371)，pIκBα抗体来自Cell Signaling(9246)，肌动蛋白抗体来自Millipore(MAB1501)。与过氧化物酶缀合的亲和纯(affini-pure)山羊抗兔(IgG)和与过氧化物酶缀合的亲和纯山羊抗小鼠IgG二抗购自Jackson ImmunoResearch。使用ECL使蛋白质印迹显影，并且对X射线胶片进行曝光。与来自萤光素酶报告基因测定的结果一致，RTA 408以剂量依赖性方式抑制TNF-α诱导的IκBα磷酸化(图14)。
RTA 408也已被证明抑制其它促炎性信号传导通路，例如IL-6诱导的信号转导因子和转录活化因子3(STAT3)的磷酸化以及NF-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导的破骨细胞生成。在HeLa细胞中，用1μM RTA 408预处理6小时抑制了IL-6诱导的STAT3的磷酸化。STAT3(124H6)和磷酸-STAT3(Tyr705)的单克隆抗体来自Cell Signaling Technology。与过氧化物酶缀合的亲和纯山羊抗兔IgG和与过氧化物酶缀合的亲和纯山羊抗小鼠IgG来自Jackson ImmunoResearch。破骨细胞生成是由RANKL与其位于造血起源的细胞上的受体RANK的结合所引起的多步分化过程。这会引起NF-κB和MAPK的活化，进而增加破骨细胞特异性靶基因的转录，所述靶基因包括抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)。在小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7中评价RTA 408对RANKL诱导的破骨细胞生成的作用。将RAW 264.7细胞以5,000个细胞/孔的密度接种到24孔板中。第二天，用RTA 408将细胞处理2小时，然后用50ng/mL重组小鼠RANKL(R&D systems)处理。将处理过的细胞孵育4天以允许分化成破骨细胞。通过测量TRAP活性来评估向破骨细胞的分化。简单地说，从每个测试孔中取出90μL条件化(conditioned)细胞培养基并且将其等分到96孔板的三个重复孔(30μL/孔)中。然后将170μL的TRAP测定缓冲液(Kamiya Biomedical)添加到每个孔中并且将所述板在37℃孵育3小时。在孵育后，使用Spectramax M2板读数分光光度计测定540nm下的吸光度。RTA 408以剂量依赖性方式抑制RANKL诱导的TRAP活性和破骨细胞的形成，IC50是约5-10nM。
5.RTA 408对编码转氨酶的基因的表达的作用
在利用RTA 408对大鼠和猴(程度明显更低)进行的28天毒性研究中观察到转氨酶升高。在人类中口服施用相关AIM(甲基巴多索隆)后观察到类似的发现(Pergola，2011)。关于这一作用的一种假设是AIM在不存在细胞毒性时直接或间接增加转氨酶基因表达。为了评估用RTA 408进行处理是否影响转氨酶mRNA水平，用RTA 408将小鼠AML-12肝细胞处理18小时，并且使用定量PCR测量编码转氨酶的基因的mRNA水平。使用每孔2mL的培养基将AML-12细胞以3×105个细胞/孔接种到6孔培养皿中。第二天，用DMSO(媒介物)或250nM和500nMRTA 408将细胞在37℃处理18小时。每个孔接收0.1％DMSO。进行三次独立的重复实验。在处理后，去除培养基并且使用RLT缓冲液(Qiagen)收获细胞。使用QIAShredder柱(Qiagen，目录编号：79654)将溶解产物匀浆并且使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，目录编号：74104)分离RNA。为了进行反转录，将RNA(1μg)与Oligo(dT)12-18引物和H2O组合，最终体积为23.25μL。将混合物加热到70℃，持续10分钟，然后放到冰上。将含有8μL5×第1链缓冲液、2μL1mg/mLBSA、2μL 20mM DTT、4μL 5mM dNTP昆合物、0.25μLRNaseOUTTM和0.5μLII反转录酶的主混合物添加到RNA混合物中并且在42℃孵育1小时。通过加热到70℃并持续10分钟使所述反应物失活。在用于qPCR中之前，将所述反应混合物用H2O 1∶3稀释。将2.5μL稀释过的反转录反应物与一组PCR引物(0.36μM最终浓度)、2×iQTM Green Supermix(Bio-Rad，目录编号：170-8885)和H2O组合达到20μL的最终体积。PCR引物的序列如下：核糖体蛋白L19(Rpl19)正向引物5′-TCAGGCTACAGAAGAGGCTTGC-3′(SEQ ID NO：19)，反向引物5′-ACAGTCACAGGCTTGCGGATG-3′(SEQ ID NO：20)；NAD(P)H脱氢酶醌1(Nqo1)正向引物5′-TCGGGCTAGTCCCAGTTAGA-3′(SEQ ID NO：21)，反向引物5′-AAAGAGCTGGAGAGCCAACC-3′(SEQID NO：22)；谷氨酸丙酮酸转氨酶1(Gpt1或Alt1)正向引物5′-CACGGAGCAGGTCTTCAACG-3′(SEQ ID NO：23)，反向引物5′-AGAATGGTCATCCGGAAATG-3′(SEQ ID NO：24)；谷氨酸丙酮酸转氨酶2(Gpt2或Alt2)正向引物5′-CGCGGTGCAGGTCAACTACT-3′(SEQ ID NO：25)，反向引物5′-CCTCATCAGCCAGGAGAAAA-3′(SEQ ID NO：26)；谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(Got1或Ast1)正向引物5′-GGCTATTCGCTATTTTGTGT-3′(SEQ ID NO：27)，反向引物5′-GACCAGGTGATTCGTACAAT-3′(SEQ ID NO：28)；谷氨酸草酰乙酸转氨酶2(Got2或Ast2)正向引物5′-AGAGTCCTCTTCAGTCATTG-3′(SEQ ID NO：29)，反向引物5′-ATGATTAGAGCAGATGGTGG-3′(SEQ ID NO：30)。已预先对所有引物的特异性和扩增效率进行了确认。使用以下循环条件来扩增cDNA：(95℃3分钟，44个循环的95℃30秒、60℃15秒、72℃15秒，之后是55℃到95℃的解链曲线，增量为0.5℃)。使用比较CT方法(ΔΔCT)确定每个Nrf2靶基因的相对丰度。在三个重复孔中对每个样品运行PCR反应。用RTA 408处理使得丙氨酸转氨酶1(Alt1或Gpt1)和天冬氨酸转氨酶1(Ast1或Got1)的mRNA水平增加(图15a、15c)。RTA 408对丙氨酸转氨酶2(Alt2或Gpt2)的mRNA水平没有作用并且降低了天冬氨酸转氨酶2(Ast2或Got2)的mRNA水平(图15b、15d)。这些结果证明RTA 408在测试浓度(250nM或500nM)下在体外影响转氨酶基因表达。
6.RTA 408对糖酵解中间体的水平的作用
对糖尿病小鼠进行的研究已证明甲基巴多索隆增加了肌肉特异性胰岛素刺激的葡萄糖摄取(Saha，2010)。在人类中，相比于接受安慰剂的患者，更高百分比的接受甲基巴多索隆的患者报告了经历肌肉痉挛(Pergola，2011)。在施用胰岛素后，在糖尿病患者中也报告了肌肉痉挛，表明可能与肌肉葡萄糖代谢有联系。通过评估在培养的啮齿类动物C2C12肌细胞中的乳酸和丙酮酸水平来评价RTA 408对糖酵解代谢的作用。为了测量乳酸水平，用1μM或2μM RTA 408或胰岛素将分化的C2C12肌管在37℃处理3小时。将缓冲液取出并且保留用于测量细胞外乳酸水平。在测量乳酸前，通过离心(在14,000rpm下进行10分钟)使细胞碎片沉淀。为了测量细胞内乳酸，将细胞悬浮于含0.1％Triton X-100的PBS中并且通过用25号针进行剪切使其溶解。将细胞溶解产物离心(在14,000rpm、4℃下进行10分钟)并且测量上清液中的乳酸。使用乳酸测定试剂盒(BioVision，目录编号：K607-100)测量细胞内和细胞外乳酸。类似于用胰岛素处理，用1μM或2μM RTA 408将分化的C2C12肌管处理3小时以剂量依赖性方式显著地增加了细胞内和细胞外乳酸水平。
为了测量丙酮酸水平，用250nM或500nM RTA 408nM或100nM胰岛素将分化的C2C12肌管处理18小时。在药物处理后，去除培养基并且用PBS洗涤细胞。在丙酮酸测定缓冲液(丙酮酸测定试剂盒，BioVision，目录编号：K609-100)中溶解细胞。将细胞溶解产物离心(在14,000rpm、4℃下进行10分钟)并且测量上清液中的丙酮酸水平。用250nM或500nM RTA408将分化的C2C12肌管处理18小时也以剂量依赖性方式显著地(P＜0.0001，以星号标注)增加细胞内丙酮酸水平(图16)。总之，这些结果证明RTA 408在测试浓度下可在体外影响肌肉的糖酵解中间体；然而，尚不清楚在RTA 408测试浓度下来自这一体外***的结果如何与在临床上相关的剂量水平下对人类葡萄糖代谢的潜在作用相关。
7.通过MRP-1对RTA 408外排进行体外评价
药物候选物的特征之一是化合物的外排比。外排比测量了化合物被跨膜转运的容易程度。MRP-1蛋白即多药物抗性辅助蛋白1是帮助促进有机阴离子和其它小分子穿过细胞膜转运的蛋白质家族中的一种蛋白质。较大的外排比通常意味着所述药物候选物较容易被转运出细胞膜而较少可用于调节细胞内过程。类似的蛋白质还调节化合物跨血脑屏障的转运。以实验方式确定MRP-1对RTA 408的外排比(1.3)为63170(10)和63171(11.2)的约1/10并且不足63179(56.5)和63189(57.1)的1/40。不受理论所束缚，RTA408可能不是MRP-1的良好底物和/或血脑屏障处由p-糖蛋白介导的外排的候选物。在一些实施方案中，RTA 408可用于治疗中枢神经***(CNS)病症。
C.RTA 408在肺病的动物模型中的保护作用
在肺病的多种动物模型中测试RTA 408以评价它在肺中的潜在功效。对于所有研究来说，每天以3mg/kg到150mg/kg范围的剂量水平在芝麻油中经口施用RTA 408。在大多数情况下，在诱发肺损伤反应前的数天开始施用RTA 408。
1.LPS诱发的小鼠肺部炎症
在LPS诱发的小鼠肺部炎症的两项研究中测试RTA 408。在第一项研究中，为了发现初步剂量范围，每天经口施用RTA 408(30mg/kg、100mg/kg或150mg/kg)一次，持续三天，之后在末次给药后1小时施用LPS。在施用LPS后20小时(在最终给予RTA 408后21小时)收集支气管肺泡灌洗液(BALF)并且使用LuminexTM技术评价促炎标记物(即IL-6、IL-12p40、TNF-α和RANTES)的水平。RTA 408处理使得IL-12p40(在所有剂量)和TNF-α(在100mg/kg和150mg/kg剂量)显著降低(图17)。在第二项研究中，每天施用RTA 408(10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg)，持续6天，之后在末次给药后1小时施用LPS。在这一研究中，在100mg/kg剂量水平下从第3天开始观察到体重显著减轻。在10mg/kg剂量下观察到TNF-α的显著降低，并且在30mg/kg剂量下观察到IL-12p40、TNF-α和RANTES的显著降低(图18a)。对来自这一研究中的小鼠的肺进行进一步评价，显示在10mg/kg和30mg/kg下相关Nrf2靶基因的有意义的参与，包括对NQO1酶活性的显著诱导(通过测量2，6-二氯苯酚-靛酚的减少率)和总GSH(GSH-GloTM，威斯康星州麦迪逊的Promega公司(Promega，Madison，WI))的增加(图18b)。
2.博来霉素诱发的肺纤维化
还在博来霉素诱发的小鼠和大鼠的肺纤维化模型中评价RTA 408的作用。在第一项初步研究中，每天经由经口灌胃对小鼠施用RTA 408(10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg)，持续39天，在第10天进行博来霉素攻击(challenge)(鼻内)。在给药最后一天，收集肺组织并且进行组织学分析以评价炎症和间质性纤维化的程度。在这一模型中，在测试的RTA 408剂量下没有观察到统计显著性作用(图19a和19b)。使用已在洛夫莱斯呼吸研究所(LovelaceRespiratory Research Institute)进行广泛表征的肺纤维化的大鼠模型进行另外的评价。在这一研究中，在第0天通过气管内施用利用博来霉素或盐水攻击大鼠。在攻击后，动物每天经由经口灌胃接受RTA 408(3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg)，持续28天。在第14天由于动物过度脱水和腹泻而停止施用30mg/kg剂量。对于剩余动物来说，在第28天收集支气管肺泡灌洗液用于通过流式细胞术来评估促炎性浸润，并且通过LC-MS和组织病理学分析肺组织的羟脯氨酸水平。用硫酸博来霉素进行攻击诱导BALF中嗜中性粒细胞的大量释放和可溶性胶原的增加，以及肺中羟脯氨酸的增加。用3mg/kg和10mg/kg RTA 408处理显著地抑制了多形核(PMN)细胞浸润到肺中并且还使得羟脯氨酸沉积出现有意义的减少(约10％-20％)(图20a和20b)。
重要的是，组织病理学评价显示用RTA 408处理的大鼠中的胶原沉积显著减少，如通过三色染色所评估。而博来霉素对照动物主要表现出中度染色，用10mg/kg RTA 408处理的动物主要具有最低程度到轻度的染色(表2)。
表2：如通过三色染色强度所评估的RTA 408对大鼠肺中胶原沉积的作用
a值表示间质三色染色在动物中由博来霉素诱发的肺改变区域中的染色强度。
对这一研究中的大鼠的肺进行的进一步评价还显示相关Nrf2靶基因的有意义的参与，如通过Quantigene Plex 2.0多重测定(加利福尼亚州圣克拉拉的Affymetrix公司(Affymetrix，Santa Clara，CA))所测定(图21)。RTA 408显著地并且以剂量依赖性方式增加了暴露于博来霉素的大鼠肺中的NQO1、Txnrd、Gsr和Gst酶活性，证明在这一疾病背景下RTA 408使Nrf2活化。通过测量DCPIP的减少率来评估NQO1酶活性。使用可从CaymanChemical公司(密歇根州安阿伯(Ann Arbor，MI))商购的试剂盒来测量Txnrd、Gst和Gst酶活性。
3.香烟烟雾诱发的小鼠COPD
还在香烟烟雾诱发的小鼠COPD模型中测试RTA 408。小鼠每天经由经口灌胃接受RTA 408(3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg)，持续两周，并且在RTA 408给药期间使其每周5天暴露于香烟烟雾。在研究结束时，收集肺组织和BALF用于分析炎性浸润和细胞因子。在这一实验中，以低到3mg/kgRTA 408的剂量进行RTA 408的多剂量施用引起对包括KC(人类IL-8的小鼠功能性同源物)和TNF-α在内的促炎性细胞因子的显著抑制，如使用LuminexTM技术所测量。来自这一研究的结果的概要呈现于图22a-e中。在相同研究中测试AIM类似物(63355)用于比较。63355是具有下式的化合物：
对来自这一研究中的小鼠的肺进行的进一步评价还显示相关Nrf2靶基因的有意义的参与(图23)。香烟烟雾暴露显著地降低了肺中NQO1的酶活性(测量为DCPIP的减少率)；施用RTA 408挽救了这一损失。30mg/kg剂量的RTA 408还诱导了Txnrd酶活性。一般来说，处理并未改变Gsr酶活性，而使Gst酶活性降低，这两种情形都可能是这些酶的暂时反应的结果。使用可从Cayman Chemical公司(密歇根州安阿伯)商购的试剂盒来测量Txnrd、Gst和Gst酶活性。
4.卵白蛋白诱发的小鼠哮喘
还在初步研究中在卵白蛋白诱发的小鼠哮喘模型中评价RTA 408的潜在活性。在第0天和第14天利用腹膜内注射的卵白蛋白和氢氧化铝使小鼠致敏并且在第14天、第25天、第26天和第27天用盐水中的卵白蛋白进行鼻内攻击。小鼠在第1-13天和第15-27天每天经由经口灌胃接受RTA 408(3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg)。在用卵白蛋白致敏和攻击后，媒介物处理的小鼠的总白细胞数相比于阳性对照(***)处理的小鼠显著增加。还在媒介物处理的小鼠中观察到T细胞和B细胞数量的增加。用30mg/kg的RTA 408处理显著地减少了气道内B细胞的数量和百分比。RTA 408(3mg/kg和30mg/kg)还显著地减少了在气道中检测到的巨噬细胞的数量，但并未显著地降低巨噬细胞的平均百分比。这些观察结果表明在这一模型中的潜在功效。
5.RTA 408对LPS诱发的小鼠败血症的作用
在第0天用腹膜内注射的LPS(21mg/kg)诱发败血症，并且观察存活情况直到第4天为止。从第-2天到第2天每天经由经口灌胃施用RTA 408(10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg)。在媒介物对照组中，60％的动物一直存活到第4天(高于在这一模型中所预计的约40％的存活率)。在RTA 408处理组中，10mg/kg剂量组中80％的动物和30mg/kg剂量组中90％的动物一直存活到第4天(图24c和24d)。对于100mg/kg剂量组来说，90％的动物一直存活到第4天，在第4天仅发生一例死亡。虽然这些由RTA 408诱导的作用指示在这一模型中的极大功效，但媒介物对照组中相对高的存活率使对照组与RTA 408处理组之间不可能有统计显著性差异。还呈现了使用化合物RTA 405获得的结果(图24a和24b)。RTA 405是具有下式的化合物：
6.RTA 408针对辐射诱发的口腔粘膜炎的作用
暴露于针对仓鼠的面颊颊囊的急性辐射产生类似于在人类口腔溃疡性粘膜炎中所观察到的作用。这些作用包括特征在于严重红斑和血管舒张、浅表粘膜糜烂以及形成溃疡的中度到重度的粘膜炎。进行单次研究以评价RTA 408在这一模型中的作用。在第0天，对每只仓鼠给予40Gy针对左面颊颊囊的急性辐射剂量。从第-5天到第-1天和第1天到第15天每天经口施用RTA 408(10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg)两次。从第6天开始并且一直持续到第28天为止，每隔一天使用标准的6分评分量表评价口腔粘膜炎。30mg/kg剂量的RTA 408和100mg/kg剂量的RTA 408这两者均使得溃疡性粘膜炎的持续时间显著缩短(图25)。此外，还观察到粘膜炎评分≥3的动物的百分比出现剂量依赖性降低。然而，施用30mg/kg或100mg/kg的RTA 408使得被辐照的仓鼠的体重增加出现显著的剂量依赖性降低。在第2天，由于体重减轻超过20％，因此使100mg/kg剂量组中8只仓鼠中的2只安乐死。
7.RTA 408对体内诱导Nrf2生物标记物的作用
如上文所述，RTA 408的关键分子靶标是Nrf2，Nrf2是抗氧化细胞保护的核心转录调节因子。Nrf2活化会诱导一组细胞保护基因上调，所述细胞保护基因包括NQO1、参与GSH合成的酶[即谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基和修饰亚基(Gclc和Gclm)]、参与解毒的酶(即谷胱甘肽S-转移酶[Gst])和外排转运蛋白[即多药物抗性相关蛋白(Mrp)]。对这些基因的诱导产生协调的细胞作用力以防止氧化损害，突出特点在于抗氧化能力增加、诱导谷胱甘肽合成、以及缀合和从细胞中排出潜在有害的分子。除了在上述各种动物模型中评价的功效终点和Nrf2靶基因表达外，还使用从RTA 408处理的健康小鼠、大鼠和猴收集的组织评估了RTA 408诱导Nrf2靶基因表达的能力。
作为在小鼠、大鼠和猴中进行的对RTA 408的非GLP 14天毒性研究的一部分，收集组织用于测量所选Nrf2靶基因的mRNA和酶活性水平的目的。对于小鼠和大鼠来说，在第14天末次给药后4小时收集肝样品。对于猴来说，在第14天末次给药后24小时收集血液(用于PBMC分离)、肝、肺和脑组织。在组织匀浆物中测量如上文所述的NQO1、Gst和谷胱甘肽还原酶(Gsr)的酶活性。使用Quantigene Plex 2.0技术，根据制造商的方案测定mRNA的水平，所述技术包括使用磁珠进行基于杂交的测定以对mRNA靶标进行直接定量。另外，通过LC/MS/MS方法在TQD质谱仪(马萨诸塞州米尔福德的Waters公司(Waters，Milford，MA))上测量血浆和组织中的RTA 408浓度。
RTA 408在10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg的剂量下大体上以剂量依赖性方式增加各种Nrf2靶基因的表达(图26、图27a、图28a和图28b)。RTA 408使Nrf2靶基因转录上调还使得抗氧化反应出现功能性增加，如通过啮齿类动物的肝以及猴的肝和肺中NQO1、Gst和Gsr酶活性的剂量依赖性增加所表明(图29a和29b、图30a和30b、图31a和31b)。此外，在啮齿类动物中，RTA 408的肝暴露与NQO1(Nrf2的原型靶基因)的酶活性水平具有相关性(图32b、图33b)。在猴中，PBMC中NQO1与硫氧还蛋白1(sulfiredoxin 1，SRXN1)这两者的mRNA表达水平与对于RTA 408的血浆暴露具有相关性(图37a和37b)。总体上，RTA 408增加了Nrf2靶标的mRNA水平和活性，并且所述增加大体上与组织和血浆的暴露具有相关性，表明Nrf2靶标可充当Nrf2活化的可行的生物标记物(图34a和b)并且可用于评估RTA 408在健康人类受试者中的药理学活性。
D.安全性药理学
使用RTA 408完成符合GLP的安全性药理学项目。这包括对心血管***的体外和体内(猴)研究，以及对大鼠的呼吸***和中枢神经***的研究。
1.对RTA 408对在HEK293细胞中表达的克隆的hERG通道的作用的评价
进行这一研究以评估RTA 408对快速活化性内向整流钾电流(IKr)的作用，所述快速活化性内向整流钾电流由在人类胚肾(HEK293)细胞系中稳定表达的hERG(人类ether-a-go-go相关基因)通道传导的。使用全细胞膜片钳电生理学方法来评估RTA 408对hERG相关钾电流的作用。在hERG QPatch_Kv11.1测定中测定RTA 408具有12.4μM的IC50值。这一值分别为63170(4.9μM)和63189(3.8μM)的值的2.5-3倍。RTA 408的IC50值类似于63171的值(15.7μM)。
2.在食蟹猴(Cynomolgus Monkey)中对RTA 408的心血管评价
在有意识的自由活动的食蟹猴中进行单次研究以评价RTA 408的潜在心血管作用。根据拉丁方设计(Latin square design)对所述的4只雄性食蟹猴和4只雌性食蟹猴施用媒介物(芝麻油)和10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg剂量水平的RTA 408，其中每周对一只动物/性别/处理给药，之后是施用之间的14天洗脱期(washout)，直到每只动物均接受所有处理为止。经由经口灌胃以5mL/kg的剂量体积对所有动物施用媒介物和RTA 408。
为动物装配遥测发射器以测量体温、血压、心率和进行心电图(ECG)评价。从给药前至少2小时直到给药后至少24小时连续地监测体温、收缩压、舒张压和平均动脉血压、心率和ECG参数(QRS持续时间以及RR间期、PR间期和QT间期)。在指定的时间点根据心血管监测数据打印ECG迹线并且由委员会认证的兽医学心脏病专家进行定性评价。在研究时第一次施用之前，连续地监测未接受处理的动物的心血管终点至少24小时，并且将这些数据用于计算在整个研究期间的校正的QT间期。
对所有动物的发病率、死亡率、损伤以及食物和水的利用度进行观察，至少每天两次。在给药前、给药后约4小时之时和完成心血管监测阶段后进行临床观察。在施用每种处理前一天测量体重并且进行记录。
RTA 408在10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg的剂量水平下未引起死亡、不利的临床体征，或未导致体重、体温、血压或者定性或定量(PR间期、RR间期、QRS间期、QT间期)的ECG参数出现有意义的变化(图35；表45)。在100mg/kg剂量组中，观察到校正的QT间期出现小幅(平均1.6％)但具有统计显著性的增加；然而，各动物数据并未显示出一致的将指示测试物品相关作用的QTc的增加。因此，由于变化幅度小并且在各动物中缺乏一致的反应，所以QTc的这些轻微增加并不被认为与RTA 408处理有关。因此，以最高100mg/kg且包括100mg/kg的剂量经口施用RTA 408未对食蟹猴的心血管功能产生作用。
3.在大鼠中对RTA 408的神经行为评价
在大鼠中评价RTA 408的潜在急性神经行为毒性。3个各有10只雄性和10只雌性[(SD)]大鼠的处理组接受3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的剂量水平的RTA408。另外一组10只动物/性别充当对照并且接受媒介物(芝麻油)。在第1天经由经口灌胃以10mL/kg的剂量体积对所有组施用媒介物或RTA 408一次。
对所有动物的发病率、死亡率、损伤以及食物和水的利用度进行观察，每天两次。在第1天给药前和在每次功能观察组合(functional observational battery，FOB)评价后对临床体征进行观察。在给药前(第-1天)和在给药后约4小时和24小时之时进行FOB评价。在第1天给药前测量体重并且进行记录。
RTA 408在3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的剂量下未引起死亡、不利的临床观察结果或对所测试的任何神经行为量度的作用。在30mg/kg组中在给药后约24小时之时观察到体重增加的轻微减少，这可能潜在地与测试物品相关。关于在这一研究中评价的基本神经行为终点，RTA 408在最高达30mg/kg且包括30mg/kg的剂量下未在大鼠中产生任何不利的作用。
4.在大鼠中对RTA 408的肺评价
在大鼠中评价RTA 408对肺功能的潜在作用。3个各有8只雄性和8只雌性[(SD)]大鼠的处理组接受3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的剂量水平的RTA 408。另外一组8只动物/性别充当对照并且接受媒介物(芝麻油)。在第1天经由经口灌胃以10mL/kg的剂量体积对所有组施用媒介物或RTA 408一次。
对所有动物的死亡率、发病率、损伤以及食物和水的利用度进行观察，每天两次。在给药前、给药后约4小时之时和完成8小时肺监测阶段后进行临床观察。在施用RTA 408当天测量体重并且进行记录。将肺功能(呼吸速率、潮气量和分钟容量(minute volume))在给药前监测至少1小时以建立基线并且在给药后监测至少8小时。
RTA 408在3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的剂量下未引起死亡、不利的临床观察结果或对所评价的任何肺参数的作用。因此，关于在这一研究中评价的基本肺终点，RTA 408在最高达30mg/kg且包括30mg/kg的剂量下未在大鼠中产生任何不利的作用。
E.非临床概述
1.药物代谢动力学
已在体外和体内研究RTA 408以评估它的PK和代谢性质。已进行体外研究以测定RTA 408的血浆蛋白结合和血液/血浆分配、细胞色素P450(CYP450)的抑制和诱导，并且鉴别了由小鼠、大鼠、猴和人类的肝微粒体形成的代谢产物。已主要通过监测来自毒理学研究的血浆和所选组织中的药物水平获得与重复施用RTA 408后的体内吸收和分布有关的数据。已使用基于灵敏的且具有选择性的液相色谱-质谱的生物分析方法(LC/MS/MS)以适当的准确度和精度测量RTA 408在血浆、血液和组织中的浓度。在TQD和QToF质谱仪(Waters)上进行测量。
a.吸收
在单次和重复(每天)经口施用后在小鼠、大鼠和猴中研究RTA 408的吸收和全身性药物代谢动力学行为。在以10mg/kg到100mg/kg的剂量经口施用混悬液制剂后，在小鼠中在1小时到2小时内观察到最大浓度，并且在大鼠和猴中在1小时到24小时内观察到最大浓度。RTA 408的全身性暴露趋向于在大鼠中最高，在小鼠和猴中观察到较低水平。在经口施用后观察到的RTA 408的表观终末半衰期的估计值一般在6小时到26小时范围，但在一些情况下，明显延长的吸收期使得不能对确定的半衰期估计值进行计算。
RTA 408的全身性暴露在雄性和雌性中大体上是类似的。在重复的每天经口施用后对RTA 408的暴露趋向于略高(≤1倍)于单次剂量后观察到的暴露。以混悬液制剂形式施用3mg/kg到100mg/kg剂量范围内的RTA 408大体上使得全身性暴露出现与剂量成比例的增加。然而，施用更高剂量(在猴中100mg/kg到800mg/kg；在大鼠中500mg/kg到2000mg/kg)并未使得暴露出现类似的增加，表明在高于100mg/kg的剂量下吸收达到饱和。在对猴经口施用RTA 408的未经优化的(松散填充的)胶囊制剂(3mg/kg)后，针对剂量归一化的全身性暴露趋向于略低于利用混悬液制剂所观察到的全身性暴露。
在大鼠中使用单次和重复的表面局部施用来研究RTA 408的吸收和全身性药物代谢动力学行为。施用0.01％到3％范围内的RTA 408显示出相对于类似的经口给药更低的血浆浓度。RTA 408的全身性暴露大体上以剂量依赖性方式增加。将表面局部施用物配制成于芝麻油中的混悬液。
使用兔来评价RTA 408的眼部吸收和全身性药物代谢动力学行为。表面局部地施用RTA 408于眼，每天一次，持续5天。眼部施用显示出相对于在经口施用RTA 408时的RTA408血浆浓度更低的RTA 408血浆浓度(图36)。相对于在经口施用RTA 408时，血浆中RTA408的量即使在连续5天后相比于第一次给药后的浓度仍仅显示出小幅变化，在经口施用RTA 408时，血浆浓度几乎高达100倍(图36)。
b.分布
使用超速离心方法以10-2000ng/mL的RTA 408浓度在小鼠、大鼠、兔、狗、小型猪、猴和人类的血浆中评价RTA 408的血浆蛋白结合。RTA 408广泛地结合血浆蛋白。在非临床物种中血浆蛋白结合在93％(小鼠)到＞99％(小型猪)范围，在毒理学物种(大鼠和猴)中的结合为95％，而人类中的结合为97％。没有证据表明在所测试的任何物种中有浓度依赖性的蛋白质结合。来自血液到血浆的分配的实验的结果指示，对于所测试的所有物种和所有浓度来说，RTA 408趋向于以线性方式主要分布于血液的血浆部分中，血液∶血浆比均＜1.0。
已在对小鼠、大鼠和猴经口施用后研究RTA 408在组织中的分布。在14天非GLP毒性研究中，在施用所述研究的末次剂量后的单个时间点(对于大鼠和小鼠为4小时之时；对于猴为24小时之时)收集所选组织(肝、肺和脑)并且使用LC/MS/MS分析RTA 408含量。RTA408易于分布到肺、肝和脑中。在4小时之时在小鼠和大鼠的肺中RTA 408浓度类似于或略高(＜1倍)于血浆中的浓度，而在24小时之时在猴的肺中RTA 408浓度是血浆浓度的6到16倍。对于脑观察到类似的模式。相比之下，在4小时之时在小鼠和大鼠的肝中的RTA 408浓度是血浆浓度的5到17倍，并且在24小时之时在猴的肝中的RTA 408浓度是血浆浓度的2到5倍。
通过监测对从14天毒性研究中收集的用于药物暴露的相同组织中的Nrf2靶基因的诱导在小鼠、大鼠和猴中评估RTA 408在组织中的药效动力学作用。RTA 408对Nrf2靶基因的诱导使得抗氧化反应增加，如通过被检查的组织中NQO1、谷胱甘肽S-转移酶(Gst)和谷胱甘肽还原酶(Gsr)酶活性的剂量依赖性增加所表明。如上文所述测量酶活性。此外，在啮齿类动物中，RTA 408的肝含量与NQO1(Nrf2的原型靶基因)的酶活性水平具有相关性。在猴中，NQO1和硫氧还蛋白1(SRXN1)这两者在外周血单核细胞(PBMC)中的mRNA表达水平均与RTA 408的血浆暴露具有相关性(图37a和37b)。总之，RTA 408在啮齿类动物和猴中诱导了Nrf2的生物标记物，并且所述诱导一般与组织和血浆对RTA 408的暴露有很好的相关性。
当经由眼部表面局部施用对兔施用RTA 408时，在角膜、视网膜或虹膜中发现所述化合物的最高浓度，而玻璃体液、房水和血浆显示出显著更低的RTA 408浓度(图38)。
C.代谢
已在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生***和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)反应混合物存在下将RTA 408与来自小鼠、大鼠、猴和人类的肝微粒体一起在体外孵育60分钟后对RTA 408的代谢进行了研究。利用灵长类动物微粒体观察到RTA 408的广泛代谢转换，猴微粒体与人类微粒体这两者中在60分钟孵育结束时保留＜10％的母体分子。相比之下，在啮齿类动物微粒体中的代谢程度较低，在所述孵育结束时保留＞65％的母体分子。缺乏用于RTA 408的各种潜在代谢产物的可供使用的可信标准使得不可能对所观察到的代谢产物进行定量评价。从定性角度来说，在物种间观察到RTA 408代谢产物的类似模式，并且所述模式包括质量与RTA 408的还原和羟化以及RTA 408或它的还原/羟化代谢产物的葡萄糖醛酸化一致的峰。没有观察到独特的人类代谢产物，还在一种或多种临床前物种中观察到人类微粒体孵育中的所有峰。具体地说，基于体外微粒体数据，所有人类代谢产物均存在于大鼠或猴，即所选的啮齿类动物和非啮齿类动物毒性物种中。
d.药物代谢动力学药物相互作用
使用汇集的人类肝微粒体和用于特异性CYP450酶的标准底物来评价RTA 408抑制细胞色素P450(CYP450)介导的代谢的潜力。RTA 408直接抑制CYP2C8和CYP3A4/5，对每种酶的Ki值均为约0.5μM。对于所测试的其它酶(CYP1A2、CYP286、CYP2C9、CYP2C19或CYP2D6)没有观察到有意义的抑制作用，在最高的测试浓度(3μM)下的抑制＜50％。另外，很少有或没有证据表明对所测试的任何酶的代谢依赖性抑制作用。基于这些数据以及可在经口施用后在胃肠(GI)道中局部实现的潜在高的浓度，可能需要进行研究对CYP3A4/5介导的药物-药物相互作用的潜力的未来研究。
使用培养的人类肝细胞来评价RTA 408诱导CYP450酶表达的潜力。在原型诱导物引起CYP活性出现预期的增加的条件下，RTA 408(最高3μM)不是培养的人类肝细胞中的CYP1A2、CYP286或CYP3A4酶活性的诱导物。通过在分离的微粒体中分别监测CYP1A2、CYP286和CYP3A4对非那西丁(phenacetin)、安非他酮(bupropion)和睾酮的底物转化来测量酶活性。
F.RTA 408对急性辐射性皮炎的作用
已对RTA 408作为用于急性辐射性皮炎的表面局部或口服预防剂的作用进行了研究。使用雄性BALB/c小鼠，在第0天施用30Gy剂量的辐射(表3)。在第-5天到第-1天和第1天到第30天对大鼠施用芝麻油媒介物或RTA408。在芝麻油中以3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg经口施用以及在芝麻油中以0.01％、0.1％和1％的组成百分比表面局部施用RTA 408。从第4天起到第30天每隔一天对所述皮炎进行盲法评价。在第12天，观察到皮炎的典型峰值并且在施用所述剂量后4小时之时将4只小鼠处死。在第30天给药后4小时之时将剩余小鼠处死。在第12天和第30天收集血浆以及经过辐照的皮肤样品用于mRNA和组织学检查。
表3：用于急性辐射性皮炎模型的研究设计
在用RTA 408处理小鼠的测试组中，当以经口或表面局部施用方式给予RTA 408时，发生的皮炎的严重程度似乎略有降低(图39-42)。此外，绘制出测试组随时间而变化的平均皮炎临床评分的曲线显示在以经口或表面局部形式施用RTA 408时与未处理的测试组相比有一些变化(图43-45)，尤其是在通过经口施用给予RTA 408的情况下。此外，如在下表4和表5中可以看出的那样，利用RTA 408通过经口施用处理的小鼠中罹患临床评分高于3的皮炎的小鼠的百分比显著更低，而给予RTA 408表面局部施用的测试组中罹患临床评分高于2的皮炎的小鼠的百分比略低。
G.RTA 408对分次辐射性皮炎的作用
在通过表面局部施用利用RTA 408的情况下，测量RTA 408对改善分次辐射性皮炎的影响的作用。使用Balb/c小鼠，以0.01％到1％范围内的三种剂量从第-5天到第30天每天对所述小鼠施用呈表面局部制剂形式的RTA408。在第0-2天和第5-7天对小鼠进行辐照，每天6次10Gy剂量。从第4天开始直到研究结束每两天对小鼠的临床皮炎评分进行盲法评价一次。在图46中，所述图表示出了作为时间函数绘制的每组平均临床评分的变化。所述图表显示用0.1％到1％的RTA 408表面局部制剂处理的小鼠的评分有统计显著性的改善。研究和处理参数可见于表6中。
表6：用于分次辐射诱发的皮炎的研究条件
通过分析图46中所示的平均临床评分，进行曲线下面积(AUC)分析，获得所述皮炎相对于皮炎持续时长的严重程度。这一AUC分析允许对不同组的小鼠之间和RTA 408的不同百分比组合物的作用进行直接比较(图47和表7)。施用表面局部RTA 408制剂将2级和3级病灶从使小鼠仅暴露于媒介物时的60％和33％分别减少到用1％浓度的RTA 408时的21％和6％。其它RTA组合物显示出一定活性，但不如由1％制剂所显示的那样显著。
表7：每个处理组的皮炎评分的百分比
组 ％天数≥2 ％天数≥3
没有辐射，没有处理 0％ 0％
有辐射，没有处理 66％ 31％
有辐射，芝麻油 60％ 33％
组 ％天数≥2 ％天数≥3
有辐射，RTA 408(0.01％) 54％ 29％
有辐射，RTA 408(0.1％) 40％ 13％
有辐射，RTA 408(1％) 21％ 6％
H.RTA 408和癌症治疗剂对肿瘤生长的协同作用
进行对与传统的化学治疗剂组合使用的RTA 408的作用的研究以确定潜在治疗的功效。进行体外研究以确定RTA 408对两种不同的***癌细胞系LNCaP和DU-145的作用。如可以在图48a中看出，当与剂量在0.125μM到0.5μM范围内的RTA 408组合时，在体外用5-氟尿嘧啶处理***癌细胞系(LNCaP)显示出细胞毒性的统计显著性增加。使用***细胞系DU-145和多西他赛，对于0.125μM到0.75μM的RTA 408剂量来说，RTA 408以统计显著性方式放大了化学治疗剂的细胞毒性，如图48b中所示。这一证据支持了RTA 408可与癌症治疗剂协同作用并且可在一些实施方案中用于提供治疗癌症患者的更大功效的观念。
在获得体外测定的成功结果后，使用被工程化以表达萤火虫萤光素酶的LNCaP/C4-2B和DU145人类***癌(下文分别被称作C4-2B-Luc和DU145-Luc)来进行体内初步测定。值得注意的是，这两种细胞系均以非雄激素依赖性方式生长。在补充有10％FBS的RPMI1640中培养细胞。使用TrypLE Express(Invitrogen)收获细胞并在PBS中洗涤并且进行计数。使细胞在PBS中复原以达到3×106个细胞/30μL(除非另有说明)的最终浓度并且在单独的管中等分。将生长因子减少型基质胶(Matrigel)(BD Bioscience)在+4℃解冻过夜并且以30μL的等分部分转移到管中。将细胞/基质胶溶液转移到动物饲养室(vivarium)中并且在即将注射前以1：1比率混合。每只小鼠(n＝1/组，总共三只动物)接受肿瘤细胞的单次皮下注射。使肿瘤预先形成4周。然后，用RTA 408(17.5mg/kg，腹膜内)处理一只动物，每天一次，持续3天(第-3到-1天)。第二天(第0天)，用单剂的18Gy IR处理经RTA 408处理的动物和另一只动物，所述IR局限于被植入肿瘤的骨盆区。在随后一周内，经过RTA 408预处理的小鼠接受另外三次剂量的RTA 408(17.5mg/kg，腹膜内)，每隔一天一次。第三只动物不接受处理并且充当阳性对照。每周经由实时成像监测肿瘤进展。为了检测表达萤光素酶的肿瘤细胞，在成像前5分钟根据制造商的方案(Caliper LifeScience)对小鼠腹膜内注射D-虫荧光素。在成像前，通过异氟烷吸入将小鼠麻醉并且在IVIS Lumina XR***(CaliperLifeScience)上成像。对于标准化来说，确定使对照肿瘤成像所必需的最短暴露时间并且使所有动物在这些条件下成像。在第7天，相比于对照，在经IR处理的动物中没有见到肿瘤大小的明显减小，而接受RTA 408与IR这两者的动物显示出较小的肿瘤图像。在第14天和第21天，对照动物显示出持续的肿瘤发生和生长，而用电离辐射处理的动物显示出一些改善，最显著的是在第21天。另一方面，用RTA 408和电离辐射处理的动物从第7天到第14天没有显示出进展并且在第21天没有可见的肿瘤。肿瘤每周的进展可见于图49。体外数据和体内数据这两者均证实RTA 408似乎补充了不同癌症治疗剂的活性，从而提高了药剂的功效。
I.RTA 408对眼部炎症模型的作用
使用新西兰白化品系的兔进行有关RTA 408对眼部炎症的作用的研究。将兔分成5组(每组12只兔)，对它们给予三种不同浓度(0.01％、0.1％和1％)的RTA 408、0.1％的滴眼剂和媒介物(芝麻油)。在穿刺术诱导前60分钟内对每只兔给予三次滴注并且在穿刺术诱导后30分钟内给予两次滴注。每次滴注为50μL并且在两只眼中给予。在穿刺术诱导后30分钟时收集每个时间点6只动物的房水，并且在2小时之时再次收集。通过房水中的蛋白质浓度来确定炎症的量。如图50中所示，仅在制剂中有0.01％RTA 408时，RTA 408显示出类似于最高浓度的其它参考化合物(MaxiDex或马普拉科拉特)中的任一种的房水蛋白质减少作用。增加RTA 408浓度的作用似乎可以忽略，这是因为所有浓度的RTA 408在降低房水蛋白浓度方面似乎都显示出在误差范围内相对类似的作用。
J.多晶型物筛选
对化合物63415进行预配制和多晶型现象研究。作为这一研究的一部分，进行初步的多晶型现象方案，目的在于以相当高的概率鉴别出在室温下最稳定的无水形式和可能的水合物。进行总共30次结晶实验，包括相平衡、干燥实验和其它技术。通过FT-拉曼光谱法对所有获得的固体进行表征。通过PXRD和TG-FTIR并且任选地通过DSC和DVS对所有新形式进行表征。
另外，制备非晶形形式并且进行表征。进行使用不同技术和方法的若干实验以制备所述非晶形形式。通过FT-拉曼光谱法、PXRD、TG-FTIR、DSC、DVS和卡尔-费歇尔滴定对所述非晶形形式进行表征。在高湿度和高温条件下经过4周的过程测试所述非晶形形式的稳定性。
1.起始物质和命名
将两批63415用作起始物质(表8)。63415在本公开中还被称作PP415。在这一计划过程中获得或产生的所有样品均获得形式PP415-Px的独特标识码，其中Px是指样品/实验编号(x＝1、2......n)。
表8：起始物质
2.化合物63415，批号0414-66-1(PP415-P1)：
非晶形形式
通过FT-拉曼光谱法、PXRD、TG-FTIR、卡尔-费歇尔滴定、1H-NMR、DSC、DVS和近似溶解度测量对63415批号0414-66-1起始物质进行表征。结果概述于表9中。
表9：63415起始物质(PP415-P1)的表征
FT-拉曼光谱(图58)将被用作起始物质的参考光谱。PXRD(图59)没有显示出尖峰图谱。约10°-20°2θ处的宽晕峰是非晶形物质的特征。
TG-FTIR温谱图(图60)显示从25℃到200℃约0.9重量％EtOH(即约0.1当量)与痕量H2O的逐渐损失。在T＞290℃开始分解。
通过卡尔-费歇尔滴定测定0.5重量％的水含量。
1H-NMR谱(图61)与所述结构一致并且显示约0.08当量的EtOH，这与TG-FTIR温谱图一致。
DSC温谱图(图62)显示在第一次加热扫描中非晶形物质在Tg＝152.7℃(ΔCp＝0.72J/g℃)发生玻璃转化。在骤冷后的第二次扫描中，在Tg＝149.7℃(ΔCp＝0.45J/g℃)发生玻璃转化。
DVS等温线(图63)显示在将相对湿度从50％相对湿度降低到0％相对湿度后发生1.0重量％的逐渐质量损失；在0％相对湿度达到平衡。在将相对湿度增加到95％相对湿度后，发生2.1重量％(相对于在0％相对湿度的质量)的逐渐质量增加；在95％相对湿度达到平衡。在将相对湿度从95％相对湿度降低到50％相对湿度后，最终质量比起始质量低0.2重量％。在85％相对湿度0.4重量％的质量增加(相对于起始质量)将所述样品分类为略有吸湿性。
所述样品在DVS测量后的FT-拉曼光谱(图64)和PXRD图谱(图65)相比于所述样品在所述测量前的光谱和图谱无变化。
在室温下通过手动稀释加上目视观察在12种溶剂和4种溶剂混合物中测量PP415-P1起始物质的近似溶解度(表10)。由于这种方法中固有的实验误差，因此这些溶解度值意图被视为粗略估计值并且仅被用于结晶实验的设计。所有溶剂混合物均以体积比(v/v)列出。
表10：PP415-P1(非晶形)起始物质的近似溶解度
溶剂 溶解度S[mg/mL]
溶剂 溶解度S[mg/mL]
甲苯 S＞200
DCM S＞200
EtOAc S＞210
丙酮 S＞230
MeCN S＞230
DMF S＞210
MeOH S＜210
EtOHa 105＜S＜210
2PrOH 16＜S＜19
DEE S≥1d
庚烷 S＜1
H2O S＜1
2PrOH/H2O(9∶1)b 7.9＜S＜8.5
MeCN/H2O(2∶3)c S＜1
EtOAc/庚烷(1∶1)a 100＜S＜200
甲苯/DEE(1∶1)a S＞220
a在约1天后观察到沉淀；
b25℃下的水活度a(H2O)为约0.7；
c50℃下的水活度a(H2O)＞0.9；
d起初不完全溶解(S＜1)，但固体残余物过夜完全溶解(S＞1)。
3.化合物63415，批号2083-69-DC(PP415-P40)：类别2
63415批号2083-69-DC是庚烷溶剂化物。通过PXRD对这一物质(PP415-P40)进行表征并且发现它对应于类别2(图66)。
类别2可能对应于具有紧密结合的溶剂的同构非化学计量的(＜0.5当量)溶剂化物(庚烷、环己烷、异丙醚、1-丁醇、三乙胺和可能的例如己烷和其它醚的其它溶剂的溶剂化物)。
PP415-P40的图谱中在7.9°2θ和13.8°2θ处可见的小峰并不对应于类别3、4或5的峰。它们的起源在这一点上尚不清楚。
4.所述非晶形形式的化学稳定性
经过7天的过程研究所述非晶形形式在不同溶剂中的化学稳定性。
在4种有机溶剂(丙酮、MeOH、MeCN、EtOAc)和三种水性表面活性剂介质(1％水性SDS、1％水性Tween 80、1％水性CTAB)中制备浓度为1mg/mL的溶液/悬浮液。
对于每种溶剂制备4份单独的溶液/悬浮液，使它们平衡6小时、24小时、2天和7天并且随后通过HPLC进行分析。
表11中给出了从HPLC色谱图获得的相对面积％。所述化合物似乎在稀释剂(含0.1％甲酸的MeCN)中有些不稳定；在所述序列的过程中(即在约24小时内)，参考样品(PP415-P1，在所述序列开始和结束时运行)的面积％在254nm从99.9％降低到99.3％并且在242nm从99.9％降低到99.5％。由于这一作用，可能影响到在所述序列(按以下顺序设定：7天、2天、24小时、6小时)临近结束时测量的样品并且所获得的面积％可能被低估。
表11：63415的非晶形形式(PP415-P1)的化学稳定性实验a
a在第三波长(210nm)下，信号强度弱并且信噪比大，因此未进行积分
b悬浮液，对于所有时间点，并非所有物质均溶解
c悬浮液，对于时间点24小时和6小时，并非所有固体均溶解
对于在MeCN中的溶液(在7天后)以及对于在1％水性Tween 80介质中的悬浮液(在所有时间点在254nm，以及在24小时、2天和7天后在242nm)观察到≥1％的分解。
5.所述非晶形形式的储存稳定性
为了更多地了解63415的非晶形形式的基本性质和物理稳定性，通过在高温和高相对湿度下储存来对它进行胁迫。
将所述非晶形形式(PP415-P1起始物质)的样品在25℃/约62％相对湿度(在饱和NH4NO3水溶液上)和40℃/约75％相对湿度(在饱和的NaCl水溶液上)开放式储存并且在60℃和80℃封闭式储存(表12)。在时间点0周、1周、2周和4周时，通过PXRD检查样品并且与起始物质PP415-P1进行比较。
表12.63415的非晶形形式(PP415-P1)的储存稳定性实验
样品 条件 时间点 PXRD结果
PP415-P2a 开放式，25℃/约62％相对湿度 1周 非晶形
PP415-P2b 开放式，25℃/约62％相对湿度 2周 非晶形
PP415-P2c 开放式，25℃/约62％相对湿度 4周 非晶形
PP415-P3a 开放式，40℃/约75％相对湿度 1周 非晶形
PP415-P3b 开放式，40℃/约75％相对湿度 2周 非晶形
PP415-P3c 开放式，40℃/约75％相对湿度 4周 非晶形
PP415-P4a 封闭式，60℃ 1周 非晶形
PP415-P4b 封闭式，60℃ 2周 非晶形
PP415-P4c 封闭式，60℃ 4周 非晶形
PP415-P5a 封闭式，80℃ 1周 非晶形
PP415-P5b 封闭式，80℃ 2周 非晶形
PP415-P5c 封闭式，80℃ 4周 非晶形
在1周(时间点1周，图67)、2周(时间点2周，图68)和4周(时间点4周，图69)后，所有4种样品仍为非晶形的，这是因为粉末X射线衍射图相比于时间点0周的起始物质没有显示出差异。
6.结晶和干燥实验
a.结晶实验
以所述非晶形形式为起始物质进行相平衡、从热溶液中结晶和蒸发实验，以便以相当高的概率鉴别出在室温下最合适的无水形式和可能的水合物。通过FT-拉曼光谱法对所有获得的物质进行表征；还通过PXRD对所选样品进行表征。
将FT-拉曼光谱根据它们的峰位置的相似性分成各类。将原始样品(PP415-P1，参见表8)与结晶产物一起分类。然而，一种类别内的光谱并不完全相同，而是类似的。可能存在小的差异和峰位移。仅考虑FT-拉曼光谱，难以确定一种类别的光谱是否属于相同的多晶型物。
测定PXRD图谱中的峰，然后使用PANalytical X’Pert(Highscore Plus)软件将所述图谱分类成各个集群。这些集群鉴别了具有高度相似性的图谱。然而，在集群内存在虽然小但显著的差异。因此，集群内的图谱并不一定对应于相同的多晶型物，而是代表具有非常类似的分子结构的不同形式。FT-拉曼类别在所有情况下均对应于PXRD集群。
b.悬浮液平衡实验
在一种溶剂和11种溶剂混合物中进行悬浮液平衡实验(表13)。制备约100mgPP415-P1于0.2-2.0mL所选溶剂中的悬浮液并且在22℃-24℃振荡4-15天。回收固体并且通过FT-拉曼光谱法进行表征；还通过PXRD对大部分固体进行表征。
表13.以所述非晶形形式(PP415-P1)为起始物质的悬浮液平衡实验
样品 溶剂/混合物 FT-拉曼类别 PXRD集群
PP415-P6 2PrOH 3 3
PP415-P7 1∶2EtOAc/庚烷 2 2
PP415-P8 1∶2丙酮/己烷 2 2
PP415-P9 1∶3甲苯/DEE 2d --
PP415-P10 1∶3MeOH/TBME 2 2
PP415-P11 1∶2MEK/环己烷 2d --
PP415-P12 9∶1EtOH/H2Oa 3 3
PP415-P13 7∶3MeCN/H2Ob 4d 4
PP415-P14 约1∶1THF/H2Oc 5d 5
PP415-P29 1∶2EtOAc/TEA 2 2
PP415-P31 9∶1PEG/H2O 1 1
PP415-P35 7∶3MeCN/H2Ob 4d 4
水活度：a50℃下的a(H2O)为约0.5；b50℃下的a(H2O)为约0.85；c64℃下的a(H2O)＞0.99；
d所述光谱含有溶剂信号
c.从热溶液中结晶
在一种溶剂和4种溶剂混合物中制备PP415-P1的热溶液(表14)。在以约0.2K/min的速率缓慢冷却到5℃后，在三种情况(-P20、-P21、-P24)下观察到沉淀。在两种情况(-P22、-P23)下，即使在4℃-5℃下储存2天后，也没有固体沉淀。这里，在N2流下在室温下蒸发溶剂。将固体回收并且通过FT-拉曼光谱法进行表征，并且对于光谱不同于非晶形起始物质(FT-拉曼类别1)的那些固体，还通过PXRD进行表征。
表14：以非晶形形式(PP415-P1)为起始物质的缓慢冷却实验
a在缓慢冷却且在5℃搅拌2天后没有沉淀；在N2流下在室温下蒸发溶剂
b所述光谱含有溶剂信号
d.蒸发/沉淀实验
在三种溶剂混合物中制备PP415-P1的澄清溶液(表15)。然后在室温下在环境条件下缓慢地蒸发所述溶剂。然而，在三次实验中的两次(-P15和-P17)中，在开始蒸发前有白色固体沉淀。通过FT-拉曼光谱法和PXRD检查所获得的固体。
表15.所述非晶形形式(PP415-P1)的缓慢蒸发实验
样品 溶剂/混合物 FT-拉曼类别 PXRD集群
PP415-P15 1∶2DCM/IPE 2a 2
PP415-P16 1∶2MeOH/甲苯 1a --
PP415-P17 1∶3EtOAc/庚烷 2a 2
a所述光谱含有溶剂信号
e.干燥实验
在真空下将每种类别的至少一种样品干燥，目的在于将所述溶剂化物去溶剂化并获得63415的非溶剂化晶形(表16)。通过FT-拉曼法、PXRD和TG-FTIR进一步对干燥物质进行表征。
表16.对从结晶实验获得的样品进行的干燥实验
a去溶剂化成功，溶剂含量显著降低，样品主要为非晶形的；PXRD中仅有很少的宽峰
b样品较低程度结晶，如通过PXRD中的较宽峰所指示
c去溶剂化成功，溶剂含量显著降低，样品仍为结晶的；结构没有变化
7.新形式(类别)的表征
a.新类别的概要
除了63415的非晶形形式外，在这一研究中还获得了4种新晶形(表17)。
表17：获得的类别的概要
类别2：大多数结晶实验产生类别2的固体物质。这些样品可能对应于具有紧密结合的溶剂分子的同构非化学计量的(＜0.5当量)溶剂化物(庚烷、环己烷、异丙醚、1-丁醇、三乙胺和可能的己烷和其它醚等的溶剂化物)。这一类别内的拉曼光谱和PXRD图谱彼此非常类似，因此结构可能基本上相同，其中由于被并入的溶剂不同而仅有小的差异。
对类别2样品进行的干燥实验并未产生结晶的非溶剂化形式。即使高温(80℃)和高真空(＜1×10-3毫巴)仍不能完全去除紧密结合的溶剂分子；始终保留＞2重量％的溶剂含量。这些样品的结晶度降低，但既没有观察到转化成不同的结构，也没有观察到显著的非晶形化。
类别3：从多次结晶实验获得类别3固体物质。类别3的样品可能是具有紧密结合的溶剂分子的2PrOH、EtOH和可能的丙酮的同构溶剂化物。它们可能对应于溶剂含量为约0.5当量的化学计量的半溶剂化物或非化学计量的溶剂化物。与类别2一样，这一类别内的拉曼光谱和PXRD图谱彼此非常类似，指示合并有不同溶剂的类似结构。
类似于类别2，干燥实验也不成功。非常紧密结合的溶剂分子仅可被部分地去除(在1×10-3毫巴和80℃长达3天后去除约5.4重量％到约4.8重量％)。PXRD图谱保持不变。
类别4：仅从7∶3MeCN/H2O溶剂***获得了类别4的物质。它最有可能对应于结晶的乙腈半溶剂化物。
通过干燥(在真空或N2流下在高温下)，可去除大多数的溶剂而不改变或破坏晶体结构(PXRD保持不变)。因此，获得了结晶的非溶剂化形式(或更确切地说，去溶剂化的溶剂化物)。它略有吸湿性(从50％相对湿度到85％相对湿度，质量增加约0.7重量％)并且具有196.1℃(ΔH＝29.31J/g)的可能熔点。
类别5：也仅从一种溶剂***(约1∶1THF/H2O)获得了类别5并且其含有结合的THF(以及可能的H2O)。由于这两种组分的含量不能单独地被定量，因此不能确定这种结晶的溶剂化物的确切性质。
将类别5干燥引起完全的去溶剂化和向非晶形形式(类别1)转化。一种可能的用类别2物质制备非晶形形式的方法是将类别2转化成类别5，之后进行干燥和非晶形化。
b.类别1-非晶形形式
从一些结晶实验获得了类别1，即63415的非晶形形式(表18)。大多数结晶实验产生类别2、3、4或5的结晶物质。
起始物质PP415-P1是非晶形的并且属于类别1。进行进一步的实验，目的仅在于制备非晶形形式(类别1)。
表18.产生类别1的固体物质的结晶实验
a在缓慢冷却且在5℃搅拌2大后没有沉淀；在N2流下在室温下蒸发溶剂
c.类别2-同构的溶剂化物(例如庚烷)
大多数的结晶实验产生类别2的固体物质(表19)。另外，将一批类别2庚烷溶剂化物PP415-P40用作起始物质(参见表8)。
虽然类别2的FT-拉曼光谱彼此明显类似(图70)，但仍显示小的差异。它们显著不同于非晶形起始物质类别1的光谱(图71)以及类别3、4和5的光谱(图72)。
类别2的PXRD图谱(图73)确认了所述物质的结晶度。虽然所述样品的图谱彼此非常类似，但仍显示小的差异(图74)。类别2的图谱明显不同于类别3、4和5的图谱(图75)。
样品PP415-P7的TG-FTIR温谱图(图76)显示在从约100℃到290℃的两个步骤中约7.5重量％的EtOAc和庚烷损失以及在温度T＞290℃下分解。在TG-FTIR实验前，在真空(10-20毫巴)下将样品短暂地干燥(约5分钟)以去除过量的未结合的溶剂。EtOAc与庚烷这两者的损失共同发生在相同的温度范围内；这两种溶剂似乎都紧密结合在所述结构内。半溶剂化物的理论EtOAc含量(沸点＝76℃)为7.4重量％，半溶剂化物的理论庚烷含量(沸点＝98℃)为8.3重量％。遗憾的是，不能对所述两种组分的含量进行单独地定量。
样品PP415-P21的TG-FTIR温谱图(图77)显示在从约140℃到约250℃的两个步骤中约5.8重量％的环己烷损失以及在温度T＞250℃下分解。在环己烷的沸点为81℃的情况下，所述溶剂似乎紧密结合在所述结构内。半溶剂化物的理论环己烷含量为7.1重量％。因此，样品PP415-P18可能对应于非化学计量的环己烷溶剂化物(具有＜0.5当量的溶剂含量)。
样品PP415-P24的TG-FTIR温谱图(图78)显示在从约50℃到约160℃的步骤中约16.6重量％的1BuOH损失、在从160℃到230℃的第二个步骤中1BuOH(6.6重量％)进一步损失以及在温度T＞230℃下分解。在1BuOH的沸点为117℃的情况下，至少第二个步骤的溶剂似乎紧密结合在所述结构内。半溶剂化物的理论1BuOH含量为6.3重量％。
样品PP415-P29的TG-FTIR温谱图(图79)显示从约50℃到约220℃约5.1重量％的EtOAc和TEA损失，其中大部分是在从180℃到210℃的步骤中损失的。分解发生在温度T＞220℃。EtOAc与TEA这两者的损失共同发生在相同的温度范围内；这两种溶剂似乎都紧密结合在所述结构内(EtOAc的沸点为77℃，并且TEA的沸点为89℃)。
样品PP415-P47的TG-FTIR温谱图(图80)显示在最高240℃的温度下类别2的典型的两步骤质量损失(总共约7.9重量％的EtOAc)，指示溶剂分子非常紧密地结合。
样品PP415-P48的TG-FTIR温谱图(图81)显示约3.5重量％甲酸乙酯和水的质量损失，所述质量损失起初逐渐地发生，然后在从180℃到200℃的明显的步骤中发生。可能有甲酸乙酯的进一步损失并伴有在T＞240℃下的分解。
因此，类别2的样品可能全部对应于具有紧密结合的溶剂分子的非化学计量的(＜0.5当量)同构的溶剂化物。由于这一类别内的拉曼光谱和PXRD图谱彼此非常类似，因此结构可能彼此基本上相同，其中由于被并入的溶剂分子的大小和形状不同而仅有晶胞尺寸的小失真或晶胞内的原子位置的小变化。
表19：产生类别2的固体物质的结晶实验
a起始物质：PP415-P40，类别2；在所有其它实验中，PP415-P1(类别1)被用作起始物质。
d.对类别2的样品进行的干燥实验
将类别2的多种样品在真空下(并且一些在高温下)干燥并且试图将它们去溶剂化，目的在于获得63415的无水形式。干燥样品的细节和表征提供于下表20中。
然而，甚至在80℃和真空＜1×10-3毫巴下干燥3天仍不能完全去除紧密结合的溶剂分子；保留＞2重量％的溶剂含量(参见样品-P32和样品-P34)。PXRD图谱显示这些样品的结晶度降低，但没有观察到转化成不同的结构。
表20.对类别2样品进行的干燥实验
a根据PXRD，略少结晶
因此，类别2溶剂化物似乎具有非常紧密结合的溶剂分子。难以对它们进行去溶剂化或转化/非晶形化。
e.PP415-P7→PP415-P30
在真空下将从在1∶2EtOAc/庚烷中进行的悬浮液平衡实验获得的样品PP415-P7(类别2)的固体物质干燥(作为PP415-P30)数天(1-10毫巴，50℃-70℃)。
干燥的类别2物质(PP415-P30)的FT-拉曼光谱显示与原始光谱(样品PP415-P7，图82)有小的差异，但仍对应于类别2。
干燥的类别2物质(PP415-P30)的PXRD图谱显示出略宽的较小强度的峰(图83)，但仍对应于类别2。
干燥样品PP415-P30的TG-FTIR温谱图(图84)显示在从约50℃到约250℃的两个步骤中约2.5重量％的庚烷(和一些EtOAc)损失以及在温度T＞250℃下分解。相比于样品PP415-P7的TG-FTIR(图76)，保持了两个溶剂损失步骤，但样品中溶剂的总量从PP415-P7中的约7.5重量％降低到PP415-P30中的约2.5重量％。
因此，试图在高温(50℃-70℃)和1-10毫巴的真空下将这一溶剂化物去溶剂化仅引起了溶剂的部分损失。
f.PP415-P15→PP415-P18
在真空(约2-20毫巴)下在室温下将从在1∶2DCM/IPE中进行的沉淀实验获得的样品PP415-P15(类别2)的固体物质干燥(作为PP415-P18)约2小时。
PP415-P18的FT-拉曼光谱与样品PP415-P15的光谱相同(图85)，这两者均对应于类别2。
PP415-P18的PXRD图谱显示与PP415-P15的图谱有小的差异(图86)。PP415-P18仍对应于类别2。
TG-FTIR温谱图(图87)显示在从约140℃到约250℃的两个步骤中约7.0重量％的IPE损失以及在温度T＞250℃下分解。在IPE的沸点为67℃的情况下，所述溶剂似乎紧密结合在所述结构内。半溶剂化物的理论IPE含量为8.4重量％。
遗憾的是，没有记录所述物质在干燥步骤前的TG-FTIR。然而，由于所述溶剂似乎如此紧密地结合到所述结构中并且没有在FT-拉曼光谱和PXRD图谱中观察到变化(或仅观察到小的变化)，因此假定所述干燥对结构或溶剂含量没有显著作用。
g.PP415-P17→PP415-P19→PP415-P32
在真空(约2-20毫巴)下在室温下将从在1∶3EtOAc/庚烷中进行的沉淀实验获得的样品PP415-P17(类别2)的固体物质干燥(作为PP415-P19)约2小时。
PP415-P19的FT-拉曼光谱与样品PP415-P17的光谱相同(图88)；没有观察到变化，并且这两者均对应于类别2。
PP415-P19的PXRD图谱与PP415-P17的图谱(图89)略有不同，但仍对应于类别2。
TG-FTIR温谱图(图90)显示在从约140℃到约270℃的两个步骤中约7.6重量％的庚烷损失以及在温度T＞270℃下分解。在庚烷的沸点为98℃的情况下，所述溶剂似乎紧密结合在所述结构中。半溶剂化物的理论庚烷含量为8.3重量％。
对与PP415-P32相同的样品进行进一步的干燥实验(80℃，＜1×10-3毫巴，3天)。
FT-拉曼光谱保持不变(图88)。PXRD图谱仍对应于类别2(图89)，但样品更低程度结晶(因为峰更宽并且具有更低的S/N比)。
TG-FTIR温谱图(图90)显示约2.2重量％的庚烷损失，其中大部分在从170℃到200℃的步骤中损失，以及在温度T＞250℃下分解。
因此，庚烷含量仅从7.6重量％降低到2.2重量％，证实了溶剂分子的紧密结合。
h.PP415-P21→PP415-P28→PP415-P34
在真空下将从在约1∶5EtOH/环己烷中进行的缓慢冷却实验获得的样品PP415-P21(类别2)的固体物质干燥(作为PP415-P28)数天(2-20毫巴，室温到60℃)。
干燥的类别2物质(PP415-P28)的FT-拉曼光谱显示与类别2(样品PP415-P21，图92)的光谱有小的差异，但仍对应于类别2。
干燥的类别2物质(PP415-P28)的PXRD图谱相比于PP415-P21的图谱显示出更宽的更小强度的峰(图93)，指示所述干燥的样品更低程度结晶。然而，所述图谱仍对应于类别2。
干燥样品PP415-P28的TG-FTIR温谱图(图94)显示在从约140℃到约250℃的两个步骤中约3.0重量％的环己烷损失以及在温度T＞250℃下分解。相比于样品PP415-P21的TG-FTIR(图77)，保持了两个溶剂损失步骤，但样品中溶剂的总量从PP415-P21中的约5.8重量％降低到PP415-P28中的约3.0重量％。
因此，这一溶剂化物的去溶剂化似乎仅引起了溶剂的部分损失，类似于结晶度的部分损失。
对这一样品进行进一步干燥(在80℃，＜1×10-3毫巴，3天)(作为PP415-P34)。
FT-拉曼光谱保持不变(图92)。PXRD图谱仍对应于类别2(图93)，但样品更低程度结晶(因为峰更宽并且具有更低的S/N比)。
TG-FTIR温谱图(图95)显示在从25℃到270℃的两个步骤中约2.3重量％的环己烷损失以及在温度T＞270℃下分解。
因此，环己烷含量仅从3.0重量％降低到2.3重量％，证实了溶剂分子的紧密结合。
i.类别3-同构的溶剂化物(例如乙醇)
若干结晶实验产生类别3的固体物质并且通过FT-拉曼光谱法、PXRD和TG-FTIR进行表征(表21)。
类别3的FT-拉曼光谱彼此明显类似(图96)，但仍显示出小的差异(图97)。类别3的光谱显著不同于非晶形起始物质(类别1)的光谱(图98)和类别2、4和5的光谱(图72)。
类别3的PXRD图谱(图99)确认了所述物质的结晶度。三种样品的图谱虽然彼此类似，但仍显示出虽然小但却显著的差异(图100)。类别3图谱明显不同于类别2、4和5的结晶图谱(图75)。
样品PP415-P6的TG-FTIR温谱图(图100)显示从25℃到250℃约5.4重量％的2PrOH损失，其中大部分是在从约170℃到190℃的步骤中损失的。在温度T＞250℃开始分解。在TG-FTIR实验前，在真空(10-20毫巴)下将样品短暂地干燥(持续约5分钟)以去除过量的未结合的溶剂。半溶剂化物的理论2PrOH(沸点＝82℃)含量为5.1重量％。
样品PP415-P12的TG-FTIR温谱图(图101)显示从25℃到250℃约4.9重量％的EtOH(与痕量的水)损失，其中大部分是在从约160℃到190℃的步骤中损失的。在温度T＞250℃开始分解。半溶剂化物的理论EtOH(沸点＝78℃)含量为4.0重量％。
因此，类别3的样品似乎是具有紧密结合的溶剂内含物的2PrOH、EtOH和可能的丙酮的同构溶剂化物。它们可对应于化学计量的半溶剂化物。然而，不能排除这些形式是非化学计量的溶剂化物。
由于这一类别内的拉曼光谱和PXRD图谱彼此非常类似，因此结构可能基本上相同，其中由于合并有不同的溶剂分子而仅有晶胞尺寸的小失真或晶胞内的原子位置的小变化。
表21.产生类别3的固体物质的结晶实验
j.对类别3的样品进行的干燥实验
在真空下将从在2PrOH中进行的悬浮液平衡实验获得的类别3的样品之一(PP415-P6)干燥(作为PP415-P25)数天(2-20毫巴，室温到60℃，表22)。
这一干燥的类别3物质样品PP415-P25的TG-FTIR温谱图(图102)显示从50℃到250℃约5.4重量％的2PrOH损失，其中大部分是在从170℃到190℃的步骤中损失的，从290℃到320℃约1.0重量％的2PrOH的另一损失以及在温度T＞320℃下分解。相比于原始类别3样品PP415-P6的TG-FTIR(图103)，在溶剂含量为约5.4重量％的2PrOH的情况下，所述溶剂含量似乎没有显著地降低。
在高真空和高温(＜1×10-3毫巴，80℃)下将这一物质进一步干燥(作为PP415-P33，表22)3天，目的在于将溶剂化物去溶剂化并获得63415的非溶剂化的无水形式。
这一被进一步干燥的类别3物质样品PP415-P33的TG-FTIR温谱图(图103)显示从50℃到210℃约4.2重量％的2PrOH损失，其中大部分是在从160℃到190℃的步骤中损失的，从210℃到290℃约0.5重量％2PrOH的另一损失以及在温度T＞290℃下分解。
相比于样品PP415-P6和PP415-P25的溶剂含量，溶剂含量仅从约5.4重量％降低到约4.8重量％。
表22.对类别3的样品进行的干燥实验
类别3(样品PP415-P6)、类别3的干燥物质(样品PP415-P25)和类别3的被进一步干燥的物质(样品PP415-P33)的FT-拉曼光谱是相同的并且没有显示出变化(图104)。
类别3(样品PP415-P6)和类别3的被进一步干燥的物质(样品PP415-P33)的PXRD图谱未显示出任何显著的差异，但与类别3的初步干燥的物质(样品PP415-P25，图105)的图谱有很少的小偏移和差异。所有图谱均对应于类别3。
由于干燥对溶剂含量没有很大的影响，因此干燥物质的FT-拉曼光谱和PXRD图谱相比于未干燥物质未显示出差异是不足为奇的。
因此，类别3是一类具有非常紧密结合的溶剂分子的同构溶剂化物(2PrOH、EtOH和可能的丙酮)，通过在此施加的干燥条件(在1×10-3毫巴和80℃下长达3天)仅可部分地(约5.4重量％到约4.8重量％)去除所述溶剂分子。
k.类别4-乙腈溶剂化物
仅从7∶3MeCN/H2O溶剂混合物获得了类别4(表23)。重复产生类别4(PP415-P13)的实验(作为PP415-P35)以制备更多物质用于进一步干燥研究。
类别4(样品PP415-P13)的FT-拉曼光谱(图72)和PXRD图谱(图75)显著不同于类别2、3和5的光谱和图谱。
类别4的TG-FTIR温谱图(样品PP415-P13，图106)显示从25℃到270℃约3.4重量％的MeCN(与痕量水)损失，其中大部分是在从约180℃到210℃的步骤中损失的。在温度T＞270℃开始分解。在TG-FTIR实验前，在真空(10-20毫巴)下将样品短暂地干燥(持续约5分钟)以去除过量的未结合的溶剂。半溶剂化物的理论MeCN(沸点＝81℃)含量为3.6重量％。
表23.产生类别4的固体物质的结晶实验
l.对类别4进行的干燥实验
在真空下或在N2流下将从在约7∶3MeCN/H2O中进行的悬浮液平衡实验获得的类别4的样品干燥数天(表24)。
表24.对类别4的样品进行的干燥实验
a溶剂内含物可能为MeCN和H2O，但因量小而难以测定
干燥的类别4物质(PP415-P26)的FT-拉曼光谱与类别4(PP415-P13，图107)的光谱相同。
干燥的类别4物质(PP415-P26)的PXRD图谱显示与类别4的样品PP415-P13的图谱仅有非常小的差异(图108)。一些峰似乎更好分辨，并且峰强度已改变。没有观察到非晶形化。PP415-P26的图谱对应于类别4。
干燥的类别4物质样品PP415-P26的TG-FTIR温谱图(图109)显示从170℃到250℃约2.8重量％的MeCN损失以及在温度T＞300℃下分解。相比于样品PP415-P13的TG-FTIR(图106)，所述样品的溶剂含量从3.4重量％降低到2.8重量％。
因此，所述样品似乎为部分去溶剂化的溶剂化物。由于没有保留足够的物质用于第二次干燥实验与随后表征，因此重复(作为PP415-P35)实验PP415-P13。再制备类别4的物质并且利用这一新制备的物质进行两次干燥实验：
●PP415-P36：在真空(＜1×10-3毫巴)下在80℃干燥3天
●PP415-P37：在N2流下在80℃干燥3天。
这些干燥的类别4样品(PP415-P36和PP415-P37)的FT-拉曼光谱对应于类别4(即PP415-P35，图110)的光谱。
类别4物质(样品PP415-P35)和类别4的干燥样品(样品PP415-P36和PP415-P37)的PXRD图谱(图111)是相同的。所述干燥样品是结晶的。
类别4的这些干燥样品的TG-FTIR温谱图(PP415-P36是图112，并且PP415-P37是图113)显示在从25℃到280℃的两个步骤中PP415-P36和PP415-P37分别仅有约0.6重量％和约0.9重量％的小的溶剂含量(MeCN和/或H2O)。溶剂内含物可能为MeCN和H2O，但因量小而难以测定。在温度T＞280℃开始分解。
因此，可去除这一溶剂化物的大部分溶剂而不会破坏晶体结构。获得结晶的非溶剂化形式(或更确切地说，去溶剂化的溶剂化物)。
m.对干燥和去溶剂化的类别4的进一步表征
将类别4(MeCN溶剂化物)干燥产生了溶剂含量降低到＜1重量％(TG-FTIR)的去溶剂化的溶剂化物。
在去溶剂化后结构没有发生变化(FT-拉曼法和PXRD)。没有观察到结晶度的显著损失。
因此，获得63415的非溶剂化的晶形，这是迄今已知的唯一一种。
通过DVS和DSC对这一去溶剂化的类别4物质进行进一步表征。
DVS等温线(图114)显示在50％相对湿度下的初始平衡时间过程中发生约0.4重量％的质量增加。在测量期间，在将相对湿度从50％相对湿度降低到0％相对湿度后，发生约1.3重量％的逐渐的可逆的质量损失。达到平衡。在将相对湿度增加到95％相对湿度后，观察到约0.8重量％的逐渐的质量增加(相对于在50％相对湿度下的平衡质量)。达到平衡。在将相对湿度降低到50％相对湿度后，最终质量仍比平衡的起始质量低0.1重量％。在将相对湿度从50％相对湿度增加到85％相对湿度后约0.7重量％的质量增加将所述样品分类为略有吸湿性。
测量后的样品的PXRD图谱相比于测量前的图谱无变化(图115)。
去溶剂化的类别4物质的样品的DSC温谱图(图116)没有显示出原本预计在约150℃出现的可归属于非晶形形式的玻璃转化，而是显示出在T＝196.1℃(ΔH＝29.31J/g)具有最大值的吸热尖峰，它可能对应于熔化，并且最高到270℃都没有显示出分解。
另外，利用非晶形物质(类别1)与去溶剂化的类别4物质的约1∶1混合物进行DSC实验以研究所述非晶形物质是否会转化并结晶成去溶剂化的类别4，这一现象预计会在高于非晶形形式的玻璃转化温度(Tg约150℃)并且低于去溶剂化的类别4的熔点(Tm约196℃)的情况下发生(如果有的话)。
所述混合物的DSC温谱图(图117)显示出在T＝156.7℃(ΔH＝1.47J/g)处具有峰的吸热现象和在197.0℃(ΔH＝14.1J/g)处具有峰的第二吸热现象。第一现象可归属于所述非晶形物质(在Tg约150℃下的玻璃转化)。第二现象可对应于去溶剂化的类别4在约196℃的Tm下的熔化。所述混合物的熔解热(ΔH＝14.1J/g)与纯去溶剂化的类别4的熔解热(ΔH＝29.3J/g)的一半具有良好的相关性。
在玻璃转化到熔化的温度范围内没有观察到对应于所述非晶形物质可能结晶的放热现象。因此，在这一时标上似乎没有发生所述非晶形形式转化成去溶剂化的类别4形式。
在利用非晶形物质(类别1)与去溶剂化的类别4物质的约1∶1混合物进行的又另一个DSC实验中，在173℃(在玻璃转化与熔化之间)停止加热以为可能的结晶留出时间。
所述混合物的DSC温谱图(图118)显示出在T＝161.4℃(ΔH＝0.31J/g)处具有峰的吸热现象和在201.4℃(ΔH＝11.4J/g)处具有峰的第二吸热现象。如在第一次实验中，第二峰的熔解热没有增加；没有看到有关所述非晶形形式转化成去溶剂化的类别4形式的迹象。
弯曲的基线(-50℃到150℃)最有可能是伪迹(artifact)(由于弯曲的样品支架盖所致)。
n.类别5-THF溶剂化物
仅从1∶1THF/H2O溶剂混合物获得了类别5(表25)。
类别5的FT-拉曼光谱(图71)和PXRD图谱(图75)显著不同于类别2、3和4的光谱和图谱。
类别5的TG-FTIR温谱图(样品PP415-P14，图119)显示从25℃到200℃约36.1重量％的THF和H2O损失，其中大部分是在从约100℃到130℃的步骤中损失的。在TG-FTIR实验前，在真空(10-20毫巴)下将所述样品短暂地干燥(持续约5分钟)以去除过量的未结合的溶剂。THF与H2O这两者的损失共同发生在相同的温度范围内。在温度T＞300℃开始分解。三溶剂化物(trisolvate)的理论THF(沸点＝66℃)含量为28.1重量％。遗憾的是，由于这两种组分的含量不能单独地被定量，因此不能确定确切的溶剂化状态。
提供了关于样品PP415-P41和PP415-P45的实验和表征的细节。
表25.产生类别5的固体物质的结晶实验
b起始物质：PP415-P40，类别2；在这一表中所有其它实验中，PP415-P1(类别1)被用作起始物质
c3g规模实验，而不是100mg规模
o.对类别5的样品进行的干燥实验
在真空下将从在约1∶1THF/H2O中进行的悬浮液平衡实验获得的类别5的样品(PP415-P14)干燥(作为PP415-P27)数天(2-20毫巴，室温到60℃，表26)。
表26.类别5的样品的干燥实验
a主要为非晶形的，仅有很少的具有低S/N比的宽峰
干燥物质(PP415-P27)的FT-拉曼光谱不同于类别5(PP415-P14，图120)的光谱并且在其加宽峰的情况下，更类似于类别1非晶形起始物质PP415-P1的光谱。
干燥的类别5物质(PP415-P27)的PXRD图谱仅显示出一些具有低S/N比的宽的低强度峰，指示所述样品的差结晶度(图121)。所述峰中的一些可对应于类别5，而其它峰(即7.35°2θ处的峰)是新的或位移的。
干燥的类别5物质的TG-FTIR温谱图(图122)显示从25℃到290℃约0.3重量％的质量损失以及在温度T＞290℃下分解。所述样品是无水的。
因此，通过在真空下干燥，所述物质损失了它的溶剂含量以及它的大部分结晶度。
8.制备非晶形形式的实验
使用类别2物质(PP415-P40，表8)作为起始物质进行目的在于制备非晶形形式(类别1)的实验。尝试了多种策略和方法：
●将类别2转化成类别5，之后将类别5干燥，获得非晶形形式(类别1)。
●如果可能的话，直接用类别2，使用ICH类别3溶剂制备非晶形形式(类别1)。
主要呈非晶形的物质是以类别2物质为起始物质在两步法中经由类别5在100mg和3g的规模上制备的。
进行进一步实验，目的在于将所述程序简化成一步法，以避免ICH类别2溶剂THF，并且获得完全非晶形的物质。发现最有前景的方法是在冷水浴中从丙酮溶液中沉淀。这种直接法得到比经由类别5的两步法好得多的结果。
a.经由类别5制备所述非晶形形式
进行使用类别2的PP415-P40作为起始物质的结晶实验，目的在于将这种庚烷溶剂化物转化成类别5(可能为THF溶剂化物)，之后将类别5干燥，获得所述非晶形物质(表27)。
类别5被认为是良好的中间步骤，因为它比类别2或3更容易去溶剂化和非晶形化。
表27.目的在于经由类别5物质制备非晶形形式(类别1)的实验的概要
步骤 样品 方法 条件 结果
1 PP415-P41 悬浮液平衡 1∶1THF/H2O，24℃，3天 类别5
“ PP415-P45 悬浮液平衡 1∶1THF/H2O，室温，1天 类别5
2 PP415-P44a 干燥 100毫巴，80℃，2天 类别1a；0.9重量％THF
“ PP415-P46a 干燥 100毫巴，80℃，4天 类别1a；0.4重量％H2O
a主要为非晶形的，仅有很少的具有低S/N比的宽峰
b.步骤1：将类别2转化成类别5
通过将PP415-P40(庚烷溶剂化物)物质悬浮于(1∶1)THF/H2O混合物中并且使所述悬浮液在室温下平衡来成功地使庚烷溶剂化物(类别2)向THF溶剂化物(类别5)进行转化(PP415-P41，100mg规模)。所得固体物质对应于THF溶剂化物，类别5(图123)。
类似于PP415-P41进行从毫克级规模到克级规模(×30，即3g规模)的第一按比例放大实验：将类别2庚烷溶剂化物起始物质(PP415-P40)在THF/H2O(1∶1)中平衡一天并且成功地转化成类别5，即THF溶剂化物(PP415-P45，图124)。
c.步骤2：通过干燥使类别5物质非晶形化
考虑到可在API MFG地点使用的条件，在高温(80℃)下在真空(约100毫巴)下将类别5物质(THF溶剂化物)干燥。
在80℃和100毫巴下将100mg规模实验的物质PP415-P41干燥一天后，它转化成主要呈非晶形的物质(PP415-P44，图125)。所述PXRD图谱仅显示出一些具有低强度的宽峰。再干燥(80℃，100毫巴)过夜后，这些宽峰的强度进一步降低(PP415-P44a)。这一物质的TG-FTIR显示从25℃到280℃约0.9重量％的THF(与痕量水)逐渐损失以及在温度T＞300℃下分解(图126)。
也在80℃和100毫巴下将3g规模实验的物质PP415-P45干燥(作为PP415-P46)。它过夜转化成仅具有一些具有低强度的宽峰的主要呈非晶形的物质(图127)。在干燥(80℃，100毫巴)总共4天后，这些宽峰仍然存在(-P46a，图128)。这一物质的TG-FTIR没有显示出THF含量，但显示从25℃到250℃约0.4重量％的水逐渐损失以及在温度T＞250℃下分解(图129)。
d.直接获得非晶形形式
以类别2物质为起始物质在两步法中经由类别5制备非晶形形式基本上，但并非完全成功。因此，进行进一步实验，目的在于将所述程序简化成一步法，以避免使用ICH类别2溶剂THF，并且获得完全非晶形的物质(表28)。
在对类别2的THF溶液进行的蒸发实验中在N2流下直接从类别2物质制备非晶形形式(类别1)(PP415-P42，图129)。
为了模拟不完全干燥的具有大量剩余溶剂的庚烷/己烷溶剂化物，在8∶2THF/己烷溶液中蒸发类别2溶液(使用己烷代替庚烷以在溶剂混合物中具有类似沸点)。然而，所得固体对应于类别2，即同构的溶剂化物的类别，而非类别5(PP415-P43，图130)。
为了避免ICH类别2溶剂THF，在ICH类别3溶剂中进行蒸发实验。
在N2流下蒸发类别2的EtOAc溶液产生具有对应于类别2的PXRD图谱的结晶物质(PP415-P47，图130)。TG-FTIR(图80)显示在最高达240℃的温度下类别2典型的两步骤质量损失(总共约7.9重量％的EtOAc)，指示非常紧密结合的溶剂分子。
在甲酸乙酯中蒸发也得到了结晶的类别2物质，而非非晶形形式(PP415-P48，图131)。TG-FTIR(图78)显示约3.5重量％的甲酸乙酯的质量损失，起初逐渐地损失，然后在从180℃到200℃的明显的步骤中损失。可能有甲酸乙酯的进一步损失并伴有在T＞240℃下的分解。
然而，成功地通过将丙酮溶液添加到冷(5℃)水浴中将类别2物质转化成非晶形形式，类别1(PP415-P49，图132)。
这种用于制备非晶形形式的直接法与两步法相比得到了更好的结果并且是更有前景的方法。
表28.目的在于直接从类别2起始物质获得非晶形形式的实验的概要
样品 方法 溶剂 条件 结果
PP415-P42 蒸发 THF N2流，1天 类别1
PP415-P43 蒸发 8∶2THF/己烷 N2流，1天 类别2
PP415-P47 蒸发 EtOAc N2流，1天 类别2
PP415-P48 蒸发 甲酸乙酯 N2流，1天 类别2
PP415-P49 沉淀 丙酮 5℃H2O浴 类别1
9.仪器-典型测量条件
FT-拉曼光谱法：具有OPUS 6.5软件的Bruker RFS100；Nd：YAG 1064nm激发，Ge检测器，3500-100cm-1范围；典型测量条件：100-300mW额定激光功率，64-128次扫描，2cm-1分辨率。
PXRD：Stoe Stadi P；Mythen1K检测器；Cu-Kα辐射；标准测量条件：透射；40kV和40mA管功率；弯曲式Ge单色仪；0.02°2θ步长，12秒或60秒步进时间，1.5°-50.5°2θ或1.0°-55°2θ扫描范围；检测器模式：步进扫描；1°2θ或6°2θ检测器步长；标准样品准备：将10mg到20mg的样品置于两个醋酸箔(acetate foil)之间；样品支架：Stoe透射样品支架；在测量期间旋转所述样品。
TG-FTIR：具有Bruker FT-IR光谱仪Vector22的Netzsch Thermo-MicrobalanceTG 209；铝制坩锅(具有微孔)，N2气氛，10K/min加热速率，25℃-250℃或25℃-350℃范围。
DSC：Perkin Elmer DSC 7；金制坩埚(封闭式或具有微孔)，在N2环境中填充样品，10K/min加热速率，-50℃到250℃或350℃范围，在扫描之间时常骤冷(以-200K/min)到-50℃。
DVS：Projekt Messtechnik Sorptions Prüfsystem SPS 11-100n或表面测量***(Surface Measurement Systems)DVS-1。将样品置于微量天平顶部上的铝制或铂制支架上并且在50％相对湿度下平衡2小时，然后开始预定的湿度程序：
(1)50％→0％相对湿度(5％/小时)；在0％相对湿度下5小时
(2)0％→95％相对湿度(5％/小时)；在95％相对湿度下5小时
(3)95％→50％相对湿度(5％/小时)；在50％相对湿度下2小时
基于在85％相对湿度下相对于初始质量的质量增加将吸湿性如下分类：潮解性(吸附足量水以形成液体)、高度吸湿性(质量增加≥15％)、吸湿性(质量增加＜15％但≥2％)、略有吸湿性(质量增加＜2％但≥0.2％)或不吸湿性(质量增加＜0.2％)。
溶剂：对于所有实验来说，均使用Fluka、Merck或ABCR分析级溶剂。
近似溶解度测定：通过将约10mg物质在0.05mL溶剂中的悬浮液逐步稀释来测定近似溶解度。如果通过添加总共＞10mL的溶剂未使所述物质溶解，则将溶解度示为＜1mg/mL。由于这种方法中固有的实验误差，因此这些溶解度值意图被视为粗略估计值并且仅用于结晶实验的设计。
化学稳定性测定：在1.0mL的对应的溶剂中制备1.0mg PP415-P1物质的4个样品。在25℃将所得悬浮液/溶液在温控式Eppendorf Thermomixer Comfort振荡器中以500rpm的振荡速率平衡7天、2天、24小时和6小时。必要时，通过过滤离心(0.5μm PVDF膜)分离固相。将滤液在稀释剂(含0.1％甲酸的MeCN)中稀释到≤0.2mg/mL(对于悬浮液来说，未知并且可能更低)的浓度并且使用表29中给出的HPLC方法进行检查。作为参考，将PP415-P1物质在稀释剂中稀释到0.25mg/mL的浓度并且添加到HPLC序列的开始和最后。
HPLC结果
表29.用于化学稳定性测定的HPLC方法
10.缩写
方法：
AUC 曲线下面积分析
DSC 差示扫描量热
DVS 动态蒸汽吸附
FT拉曼法 傅里叶变换(Fourier-transform)拉曼光谱法
1H-NMR 质子核磁共振波谱法
HPLC 高效液相色谱
PXRD 粉末X射线衍射
TG-FTIR 热重分析-傅里叶变换红外光谱法联用
化学品：
1BuOH 1-丁醇
CTAB 十六烷基三甲基溴化铵
DCM 二氯甲烷
DEE ***
DMF N，N-二甲基甲酰胺
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
IPE 异丙醚
MeCN 乙腈
MEK 甲基乙基酮
MeOH 甲醇
PEG 丙二醇
PTFE 聚四氟乙烯、铁氟龙(Teflon)
2PrOH 2-丙醇、异丙醇
SDS 十二烷基硫酸钠
TBME 叔丁基甲醚
TEA 三乙胺
THF 四氢呋喃
Tween 80 聚氧乙烯(80)脱水山梨糖醇单油酸酯或聚山梨醇酯80
基因、蛋白质和生物参数：
AIM 抗氧化炎症调节剂
Akr1c1 醛酮还原酶家族1，成员c1
ALP 碱性磷酸酶
ALT 丙氨酸转氨酶
ARE 抗氧化反应元件
AST 天冬氨酸转氨酶
AUC 曲线下面积
BAL 支气管肺泡灌洗
BALF 支气管肺泡灌洗液
Bil 胆红素
BUN 血液尿素氮
COPD 慢性阻塞性肺病
COX-2 环加氧酶-2
Cr 肌酸
CYP450 细胞色素P450
Eh-1 环氧化物水解酶1
G6PD 葡萄糖-6磷酸脱氢酶
Gclc 谷氨酸-半胱氨酸连接酶，催化亚单位
Gclm 谷氨酸-半胱氨酸连接酶，修饰亚单位
Ggt1 γ-谷氨酰转移酶
Glrx 谷氧还蛋白-1
Glu 葡萄糖
GOT 谷氨酸-草酰乙酸转氨酶
GPT1 谷氨酸-丙酮酸转氨酶
Gpx3 谷胱甘肽过氧化物酶3
GSH 谷胱甘肽
GSR 谷胱甘肽还原酶
GSs 谷胱甘肽合成酶
GST 谷胱甘肽S-转移酶
GSTa1 谷胱甘肽S-转移酶α1
GSTp1 谷胱甘肽S-转移酶π1
Gy 戈瑞(Gray)
H6PD 己糖-6-磷酸脱氢酶
hERG 人类ether a-go-go相关基因
HMOX1 血红素加氧酶(脱环)1
HO-1 血红素加氧酶
IFNγ 干扰素-γ
IL 白细胞介素
iNOS 诱导型一氧化氮合酶
IκBα B细胞κ轻链多肽基因增强子核因子抑制因子α
KC 小鼠IL-8相关蛋白
Keap1 Kelch样ECH相关蛋白-1
LPS 脂多糖
ME1 苹果酸酶1
MPCE 微核嗜多染红细胞
Mrp metG相关蛋白
Mrps 多药物抗性相关蛋白
NADPH 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
NFκB 活化的B细胞的κ轻链增强子核因子
NO 一氧化氮
NQO1 NAD(P)H醌氧化还原酶1
Nrf2 核因子(红细胞衍生)-样2
p-IκBα 磷酸化IκBα
PBMC 外周血单核细胞
PCE 嗜多染红细胞
PGD 磷酸葡萄糖酸脱氢酶
PMN 多形核
RANTES 调节正常T细胞表达和分泌因子
SOD1 超氧化物歧化酶1
SRXN1 硫氧还蛋白-1
TG 总甘油酯
TKT 转酮醇酶
TNFα 肿瘤坏死因子α
Txn 硫氧还蛋白
TXNRD1 硫氧还蛋白还原酶1
xCT 溶质载体家族7，成员11
杂项：
API 活性药物成分
aq. 水性
b.p. 沸点
cryst. 结晶
decomp. 分解
d 天
eq. 当量
equil. 平衡
evap. 蒸发
h 小时
mat. 物质
min 分钟
m.p. 熔点
MS 分子筛
part. 部分
precip. 沉淀
r.h. 相对湿度
rpm 转/分钟
室温 室温(约25℃)
S/N 信噪比
solv. 溶剂
susp. 悬浮液
T 温度
Tg 玻璃转化温度
theo. 理论
vis.obs. 目视观察
w 周
wt.-％ 重量百分比
根据本公开，无需过多实验即可制备和实施本文所公开和要求保护的所有化合物、多晶型物、制剂和方法。虽然已就优选的实施方案对本发明的化合物、多晶型物、制剂和方法进行了描述，但对于本领域技术人员将显而易见的是，可在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下对本文所述的化合物、多晶型物、制剂和方法以及方法的步骤或步骤的次序进行改变。更具体地说，将显而易见的是，可用在化学和生理学上均相关的某些药剂代替本文所述的药剂而实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员来说显而易见的所有这些类似的替代和修改方案均被认为落入由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
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Claims (99)

1.一种具有下式的化合物：
或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物不呈盐形式。
3.一种具有下式的化合物的多晶型物：
其中所述多晶型物具有基本上如图59中所示的用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射图谱。
4.根据权利要求3所述的多晶型物，其进一步具有150℃到155℃的Tg。
5.根据权利要求4所述的多晶型物，其进一步具有约153℃的Tg。
6.根据权利要求3所述的多晶型物，其进一步具有包含以150℃到155℃为中心的吸热的差示扫描量热曲线。
7.根据权利要求6所述的多晶型物，其中所述吸热以约153℃为中心。
8.根据权利要求3所述的多晶型物，其具有基本上如图62中所示的差示扫描量热曲线。
9.一种具有下式的化合物的多晶型物：
其中所述多晶型物是具有<0.5当量的庚烷、环己烷、异丙醚、1-丁醇或三乙胺的非化学计量的溶剂化物，其具有在约5.6°2θ、7.0°2θ、10.6°2θ、12.7°2θ和14.6°2θ处包含峰的用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射图谱。
10.根据权利要求9所述的多晶型物，其中所述用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射图谱基本上如图75中的顶部图谱中所示。
11.一种具有下式的化合物的多晶型物：
其中所述多晶型物是具有约0.5当量的乙醇、异丙醇或丙酮的溶剂化物，其具有在约7.0°2θ、7.8°2θ、8.6°2θ、11.9°2θ、13.9°2θ、14.2°2θ和16.0°2θ处包含峰的用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射图谱，其中在约13.9°2θ处的峰为双峰。
12.根据权利要求11所述的多晶型物，其中所述用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射图谱基本上如图75中从顶部起的第二个图谱所示。
13.一种具有下式的化合物的多晶型物：
其中所述多晶型物是具有在约7.5°2θ、11.4°2θ、15.6°2θ和16.6°2θ处包含峰的用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射图谱的乙腈半溶剂化物。
14.根据权利要求13所述的多晶型物，其中所述用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射图谱基本上如图75中从底部起的第二个图谱所示。
15.根据权利要求13所述的多晶型物，其进一步具有约196℃的Tg。
16.根据权利要求13所述的多晶型物，其进一步具有包含以约196℃为中心的吸热的差示扫描量热曲线。
17.根据权利要求13所述的多晶型物，其具有基本上如图116中所示的差示扫描量热曲线。
18.一种具有下式的化合物的多晶型物：
其中所述多晶型物是具有在约6.8°2θ、9.3°2θ、9.5°2θ、10.5°2θ、13.6°2θ和15.6°2θ处包含峰的用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射图谱的四氢呋喃溶剂化物。
19.根据权利要求18所述的多晶型物，其中所述用Cu-Kα辐射的X射线粉末衍射图谱基本上如图75中的底部图谱所示。
20.一种药物组合物，其包含：
由根据权利要求1到2中任一项所述的化合物或根据权利要求3到19中任一项所述的多晶型物组成的活性成分，以及
药学上可接受的载体。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于以如下方式施用：口服、脂肪内、动脉内、关节内、颅内、真皮内、病灶内、肌内、鼻内、眼内、心包内、腹膜内、胸膜内、***内、直肠内、鞘内、气管内、瘤内、脐内、***内、静脉内、膀胱内、玻璃体内、以脂质体方式、经粘膜、肠胃外、经直肠、结膜下、皮下、舌下、表面局部、经颊、透皮、经***、以乳膏形式、以液体组合物形式、经由导管、经由灌洗、经由连续输注、经由输注、经由吸入、经由注射、经由局部递送、或经由局部灌注。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于口服、动脉内、静脉内或表面局部施用。
23.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于口服施用。
24.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成硬胶囊或软胶囊、片剂、糖浆、混悬液、乳液、溶液、固体分散体、糯米纸囊剂或酏剂。
25.根据权利要求20所述的药物组合物，其进一步包含提高溶解性和分散性的试剂。
26.根据权利要求20所述的药物组合物，其中将所述化合物或多晶型物悬浮于芝麻油中。
27.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于表面局部施用。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成洗剂、乳膏、凝胶、油、软膏、油膏、乳液、溶液或混悬液。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成洗剂。
30.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成乳膏。
31.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成凝胶。
32.根据权利要求20到30中任一项所述的药物组合物，其中所述活性成分的量是0.01重量％到5重量％。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述活性成分的量是0.01重量％到3重量％。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述活性成分的量是约0.01重量％。
35.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述活性成分的量是约0.1重量％。
36.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述活性成分的量是约1重量％。
37.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述活性成分的量是约3重量％。
38.根据权利要求1到2中任一项所述的化合物或根据权利要求3到19中任一项所述的多晶型物用于制备用以治疗或预防患者中与炎症或氧化应激相关的病况的药物的用途。
39.根据权利要求38所述的用途，其中所述病况是炎症。
40.根据权利要求38所述的用途，其中所述病况与氧化应激相关。
41.根据权利要求38所述的用途，其中所述病况是皮肤疾病或病症、败血症、骨关节炎、癌症、自身免疫性疾病、炎性肠病、因局部或全身暴露于电离辐射所致的并发症、粘膜炎、急性或慢性器官衰竭、肝病、胰腺炎、眼部病症、肺病或糖尿病。
42.根据权利要求41所述的用途，其中所述病况是皮肤疾病或病症。
43.根据权利要求42所述的用途，其中所述皮肤疾病或病症是皮炎、热烧伤或化学烧伤、慢性创伤、痤疮、脱发、其它毛囊病症、大疱性表皮松解、晒伤、晒伤并发症、皮肤色素沉着病症、衰老相关性皮肤病况、手术后创伤、因皮肤损伤或烧伤所致的瘢痕、银屑病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的皮肤表现、皮肤癌、或牵涉到皮肤细胞过度增殖的病症。
44.根据权利要求43所述的用途，其中所述皮肤疾病或病症是皮炎。
45.根据权利要求44所述的用途，其中所述皮炎是过敏性皮炎、特应性皮炎、因化学暴露所致的皮炎或辐射诱发的皮炎。
46.根据权利要求43所述的用途，其中所述皮肤疾病或病症是慢性创伤。
47.根据权利要求46所述的用途，其中所述慢性创伤是糖尿病性溃疡、褥疮或静脉曲张性溃疡。
48.根据权利要求43所述的用途，其中所述皮肤疾病或病症是脱发。
49.根据权利要求48所述的用途，其中所述脱发是秃发或药物诱发的脱发。
50.根据权利要求43所述的用途，其中所述皮肤疾病或病症是皮肤色素沉着病症。
51.根据权利要求50所述的用途，其中所述皮肤色素沉着病症是白癜风。
52.根据权利要求43所述的用途，其中所述皮肤疾病或病症是牵涉到皮肤细胞过度增殖的病症。
53.根据权利要求52所述的用途，其中所述牵涉到皮肤细胞过度增殖的病症是角化过度。
54.根据权利要求41所述的用途，其中所述病况是自身免疫性疾病。
55.根据权利要求54所述的用途，其中所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、狼疮、克罗恩氏病或银屑病。
56.根据权利要求41所述的用途，其中所述病况是肝病。
57.根据权利要求56所述的用途，其中所述肝病是脂肪肝病或肝炎。
58.根据权利要求41所述的用途，其中所述病况是眼部病症。
59.根据权利要求58所述的用途，其中所述眼部病症是葡萄膜炎、黄斑变性、青光眼、糖尿病性黄斑水肿、睑炎、糖尿病性视网膜病变、角膜内皮疾病或病症、干眼、或结膜炎。
60.根据权利要求59所述的用途，其中所述眼部病症是黄斑变性。
61.根据权利要求60所述的用途，其中所述黄斑变性是干性形式。
62.根据权利要求60所述的用途，其中所述黄斑变性是湿性形式。
63.根据权利要求59所述的用途，其中所述角膜内皮疾病或病症是福斯氏角膜内皮营养不良。
64.根据权利要求41所述的用途，其中所述病况是肺病。
65.根据权利要求64所述的用途，其中所述肺病是肺部炎症、肺纤维化、COPD、哮喘、囊肿性纤维化或特发性肺纤维化。
66.根据权利要求65所述的用途，其中所述肺病是肺部炎症。
67.根据权利要求65所述的用途，其中所述肺病是肺纤维化。
68.根据权利要求65所述的用途，其中所述肺病是COPD。
69.根据权利要求68所述的用途，其中所述COPD是由香烟烟雾诱发的。
70.根据权利要求65所述的用途，其中所述肺病是哮喘。
71.根据权利要求41所述的用途，其中所述病况是败血症。
72.根据权利要求41所述的用途，其中所述病况是因放射疗法或化学疗法所致的粘膜炎。
73.根据权利要求72所述的用途，其中所述粘膜炎是口腔粘膜炎。
74.根据权利要求41所述的用途，其中所述病况是因局部或全身暴露于电离辐射所致的并发症。
75.根据权利要求74所述的用途，其中所述暴露于电离辐射导致皮炎。
76.根据权利要求74所述的用途，其中所述暴露于电离辐射是急性的。
77.根据权利要求74所述的用途，其中所述暴露于电离辐射是分次的。
78.根据权利要求41所述的用途，其中所述病况是癌症。
79.根据权利要求78所述的用途，其中所述癌症是癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤或***瘤。
80.根据权利要求78所述的用途，其中所述癌症是膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经***癌、子***、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胆囊癌、生殖器癌、泌尿生殖道癌、头部癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、肌肉组织癌、颈部癌、口腔粘膜癌或鼻粘膜癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌、或甲状腺癌。
81.根据权利要求38所述的用途，其中所述化合物或所述药物组合物是以每天单剂施用的。
82.根据权利要求38所述的用途，其中所述化合物或所述药物组合物是以每天超过一剂施用的。
83.根据权利要求38所述的用途，其中所述药物组合物是以1mg/kg到2000mg/kg的单位剂量施用的。
84.根据权利要求83所述的用途，其中所述剂量是3mg/kg到100mg/kg。
85.根据权利要求83所述的用途，其中所述剂量是约3mg/kg。
86.根据权利要求84所述的用途，其中所述剂量是约10mg/kg。
87.根据权利要求84所述的用途，其中所述剂量是约30mg/kg。
88.根据权利要求83所述的用途，其中所述剂量是约100mg/kg。
89.根据权利要求38所述的用途，其中表面局部施用所述药物。
90.根据权利要求89所述的用途，其中所述表面局部施用是对皮肤施用。
91.根据权利要求89所述的用途，其中所述表面局部施用是对眼施用。
92.根据权利要求38所述的用途，其中口服施用所述药物。
93.根据权利要求38所述的用途，其中眼内施用所述药物。
94.根据权利要求38所述的用途，其中在用放射疗法或化学疗法对所述患者进行治疗之前施用所述药物或之后立即施用所述药物，其中所述化学疗法不包含根据权利要求20中所述的活性成分。
95.根据权利要求38所述的用途，其中在用所述放射疗法或所述化学疗法对所述患者进行治疗之前施用所述药物和之后立即施用所述药物，其中所述化学疗法不包含根据权利要求20中所述的活性成分。
96.根据权利要求95所述的用途，其中所述治疗减少了所述放射疗法或所述化学疗法的副作用。
97.根据权利要求96所述的用途，其中所述副作用是粘膜炎和皮炎。
98.根据权利要求94所述的用途，其中所述治疗提高了所述放射疗法或所述化学疗法的功效。
99.根据权利要求94所述的用途，其中所述化学疗法包括对所述患者施用治疗有效量的5-氟尿嘧啶或多西他赛。
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