CN104388178B - 一种从藻类细胞中提取dha藻油的方法 - Google Patents
一种从藻类细胞中提取dha藻油的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种从藻类细胞中提取DHA藻油的方法，包括如下步骤：(1)将藻类细胞发酵液经离心、喷雾干燥后，制备藻类细胞干粉，然后将藻类细胞干粉与无水乙醇混合均匀，然后进行高压匀质破壁，制得破壁乙醇溶液；(2)将破壁乙醇溶液进行低温真空蒸发，去除乙醇，制得破壁菌体；(3)取破壁菌体，进行CO2超临界萃取，制得DHA藻油。本发明在高压匀浆破壁前，先将藻类细胞干粉用无水乙醇浸泡，从而大幅提高萃取率和提取率。
Description
技术领域
本发明涉及一种从藻类细胞中提取DHA藻油的方法，属于保健品制备技术领域。
背景技术
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)是一种重要的ω-3型长链多不饱和脂肪酸。现代医学证明DHA可促进婴幼儿视力和智力发育，对心血管***疾病、癌症、炎症等也具有积极的防治作用。DHA的生产具有多种来源，其中利用微生物发酵法生产DHA藻油，具有易于大规模培养、多不饱和脂肪酸含量高、易于分离纯化、氧化稳定性较好等优点。在众多产DHA的微生物(包括裂殖壶菌、破囊壶菌、隐甲藻等)中，裂殖壶菌具有生长速度快、DHA含量高等诸多优点，是发酵法生产DHA的理想微生物之一。
目前，国内外提取DHA藻油的方法主要有有机溶剂萃取法、压榨法、CO2超临界萃取法等。其中，CO2超临界萃取法可在接近室温的条件下进行，并且无有机溶剂残留，因此受到越来越多的关注。但是，CO2超临界萃取法必须与适宜的破壁方法相结合才能更有效地萃取DHA藻油。中国专利文献CN101550078A(申请号200910027822.8)将超临界萃取的方法与超声波破壁的方法相结合，在萃取的过程中使用超声波对裂殖壶菌进行破壁以提高萃取效率。但超声波破壁具有耗能多、破壁范围较小、破壁效果较差等缺点。
中国专利文献CN 102181320A(申请号201110077030.9)公开了一种生物发酵DHA藻油的提取方法，包括以下步骤：a)将微藻发酵液固液分离后得到的固体物干燥，得到干燥菌体；b)以超临界二氧化碳为萃取剂对所述干燥菌体进行萃取，得到二氧化碳流体；c)对所述二氧化碳流体进行减压分离，得到DHA藻油。本发明以超临界二氧化碳为萃取剂萃取DHA藻油，萃取效率高，得到的DHA藻油纯度高、产率高、质量稳定。实验表明，采用本发明提供的方法得到的DHA藻油中，DHA的含量大于40％。
中国专利文献CN101817738A(申请号200910225296.6)公开了一种从藻类细胞中破壁提取DHA方法，涉及一种从微生物中提取有效组分的方法，提供一种无需任何有机溶剂和化学药物的辅助，采用物理方法将藻类细胞破壁并提取胞内油脂产物DHA(二十二碳六烯酸)，适合于低成本的大规模生产。将发酵结束后的藻类发酵液通过分离***分离收集细胞，用酸调节菌泥pH2.0～4.0，然后控制菌泥温度在10～20℃，在菌泥中加入抗氧化剂后通过高压均质机进行高压均质破壁；将破壁后的菌泥加入水，搅拌后将料液通过三相分离机分离得到DHA油脂。
但上述提取工艺受现有破壁工艺条件的技术限制，DHA提取率依然较低。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种从藻类细胞中提取DHA藻油的方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种从藻类细胞中提取DHA藻油的方法，包括如下步骤：
(1)将藻类细胞发酵液经离心、喷雾干燥后，制备藻类细胞干粉，然后将藻类细胞干粉与无水乙醇按照质量体积比1:(4～6)的比例混合均匀，单位kg/L，静置25～40min，然后在压力为80～120Mpa条件下进行高压匀质破壁，循环破壁2～4次，制得破壁乙醇溶液；
(2)将步骤(1)制得的破壁乙醇溶液在40～50℃温度、-0.12～-0.05Mpa压力条件下进行低温真空蒸发，去除乙醇，制得破壁菌体；
(3)取步骤(2)制得的破壁菌体，进行CO2超临界萃取，制得DHA藻油。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的藻类细胞发酵液，制备步骤如下：
a、取藻类细胞接种于活化培养基中，在28～32℃下活化培养20～28h，制得活化菌种；
b、将步骤a制得的活化菌种按重量百分比5～10％接种于发酵培养基中，在30℃的条件下发酵培养50～65h，然后流加浓度450～600g/L的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度为10g/L～15g/L，继续发酵20～30h，制得藻类细胞发酵液。
进一步优选的，所述的活化培养基，组分如下：
葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、海水晶20g/L，pH5.0；
进一步优选的，所述的发酵培养基，组分如下：
葡萄糖40g/L、蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、海水晶20g/L，pH5.0；
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，喷雾干燥条件为：进风温度为130～150℃。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，所述的藻类为裂殖壶菌。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，藻类细胞干粉与无水乙醇的质量体积比为1:5。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，高压匀质破壁条件为：压力100Mpa，循环破壁3次。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，低温真空蒸发的温度为45℃、压力为-0.08Mpa。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，还包括将去除的乙醇回收后，作为无水乙醇循环应用于步骤(1)的步骤。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，CO2超临界萃取步骤如下：
(Ⅰ)在温度40～50℃、压力15～20Mpa的条件下，以超临界CO2为萃取剂对破壁后的菌体进行萃取，得到二氧化碳流体；
(Ⅱ)将以上二氧化碳流体泵入入第一分离罐，在温度40～50℃、压力9Mpa～12Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油；
(Ⅲ)将剩余的二氧化碳流体泵入第二分离罐，在温度30～40℃、压力5Mpa～8Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油，二氧化碳气体通过加压后形成二氧化碳流体循环使用。
有益效果
1、本发明在高压匀浆破壁前，先将藻类细胞干粉用无水乙醇浸泡，从而使细胞壁上的蛋白质变性，有助于细胞壁的破除；并且避免了高压匀浆机破壁的过程中，前期释放的油脂将菌体细胞包裹保护起来，发生乳化，导致高压匀浆不能彻底破除细胞壁的问题；可以提高萃取率和提取率；
2、低温真空蒸发乙醇后，破壁菌体内还残存有部分乙醇，残存乙醇可作为超临界萃取的分散剂，从而大大提高萃取效率；
3、本发明将高压匀浆破壁法与CO2超临界萃取法相结合，具有较高的萃取效率；同时，本发明所述的从裂殖壶菌中提取DHA藻油的方法具有无有机溶剂残留，勿需后续的脱色、除臭等工序的优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中所述的裂殖壶菌来源于山东广博生物技术服务有限公司。
培养基
活化培养基，组分如下：
葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、海水晶20g/L，pH5.0。
发酵培养基，组分如下：
葡萄糖40g/L、蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、海水晶20g/L，pH5.0。
实施例1
一种从裂殖壶菌中提取DHA藻油的方法，包括如下步骤：
(1)将裂殖壶菌发酵液经离心、喷雾干燥后，制备裂殖壶菌干粉，然后将裂殖壶菌干粉与无水乙醇按照质量体积比1:5的比例混合均匀，单位kg/L，静置30min，然后在压力为100Mpa条件下进行高压匀质破壁，循环破壁3次，制得破壁乙醇溶液；
(2)将步骤(1)制得的破壁乙醇溶液在45℃温度、-0.08Mpa压力条件下进行低温真空蒸发，去除乙醇，制得破壁菌体；
(3)取步骤(2)制得的破壁菌体，进行CO2超临界萃取，制得DHA藻油。
所述步骤(1)中的裂殖壶菌发酵液，制备步骤如下：
a、取裂殖壶菌接种于活化培养基中，在30℃下活化培养24h，制得活化菌种；
b、将步骤a制得的活化菌种按重量百分比10％接种于发酵培养基中，在30℃的条件下发酵培养55h，然后流加浓度500g/L的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度为12g/L，继续发酵25h，制得裂殖壶菌发酵液。
所述步骤(1)中，喷雾干燥条件为：进风温度为140℃。
所述步骤(2)中，还包括将去除的乙醇回收后，作为无水乙醇循环应用于步骤(1)的步骤。
所述步骤(3)中，CO2超临界萃取步骤如下：
(Ⅰ)在温度45℃、压力17Mpa的条件下，以超临界CO2为萃取剂对破壁后的菌体进行萃取，得到二氧化碳流体；
(Ⅱ)将以上二氧化碳流体泵入入第一分离罐，在温度45℃、压力10Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油；
(Ⅲ)将剩余的二氧化碳流体泵入第二分离罐，在温度35℃、压力6Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油，二氧化碳气体通过加压后形成二氧化碳流体循环使用。
按如下公式计算藻油的萃取率、提取率，并检测藻油的DHA含量，结果如表1所示：
萃取率(％)＝藻油质量(g)/藻粉质量(g)
提取率(％)＝萃取率/藻粉含油率。
实施例2
一种从裂殖壶菌中提取DHA藻油的方法，包括如下步骤：
(1)将裂殖壶菌发酵液经离心、喷雾干燥后，制备裂殖壶菌干粉，然后将裂殖壶菌干粉与无水乙醇按照质量体积比1:6的比例混合均匀，单位kg/L，静置25min，然后在压力为80Mpa条件下进行高压匀质破壁，循环破壁4次，制得破壁乙醇溶液；
(2)将步骤(1)制得的破壁乙醇溶液在40℃温度、-0.12Mpa压力条件下进行低温真空蒸发，去除乙醇，制得破壁菌体；
(3)取步骤(2)制得的破壁菌体，进行CO2超临界萃取，制得DHA藻油。
所述步骤(1)中的裂殖壶菌发酵液，制备步骤如下：
a、取裂殖壶菌接种于活化培养基中，在28℃下活化培养28h，制得活化菌种；
b、将步骤a制得的活化菌种按重量百分比10％接种于发酵培养基中，在32℃的条件下发酵培养50h，然后流加浓度450g/L的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度为10g/L，继续发酵30h，制得裂殖壶菌发酵液。
所述步骤(1)中，喷雾干燥条件为：进风温度为130℃。
所述步骤(2)中，还包括将去除的乙醇回收后，作为无水乙醇循环应用于步骤(1)的步骤。
所述步骤(3)中，CO2超临界萃取步骤如下：
(Ⅰ)在温度40℃、压力20Mpa的条件下，以超临界CO2为萃取剂对破壁后的菌体进行萃取，得到二氧化碳流体；
(Ⅱ)将以上二氧化碳流体泵入入第一分离罐，在温度40℃、压力12Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油；
(Ⅲ)将剩余的二氧化碳流体泵入第二分离罐，在温度30℃、压力8Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油，二氧化碳气体通过加压后形成二氧化碳流体循环使用。
按如下公式计算藻油的萃取率、提取率，并检测藻油的DHA含量，结果如表1所示：
萃取率(％)＝藻油质量(g)/藻粉质量(g)
提取率(％)＝萃取率/藻粉含油率。
实施例3
一种从裂殖壶菌中提取DHA藻油的方法，包括如下步骤：
(1)将裂殖壶菌发酵液经离心、喷雾干燥后，制备裂殖壶菌干粉，然后将裂殖壶菌干粉与无水乙醇按照质量体积比1:4的比例混合均匀，单位kg/L，静置40min，然后在压力为120Mpa条件下进行高压匀质破壁，循环破壁2次，制得破壁乙醇溶液；
(2)将步骤(1)制得的破壁乙醇溶液在50℃温度、-0.05Mpa压力条件下进行低温真空蒸发，去除乙醇，制得破壁菌体；
(3)取步骤(2)制得的破壁菌体，进行CO2超临界萃取，制得DHA藻油。
所述步骤(1)中的裂殖壶菌发酵液，制备步骤如下：
a、取裂殖壶菌接种于活化培养基中，在32℃下活化培养20h，制得活化菌种；
b、将步骤a制得的活化菌种按重量百分比10％接种于发酵培养基中，在28℃的条件下发酵培养65h，然后流加浓度600g/L的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度为15g/L，继续发酵30h，制得裂殖壶菌发酵液。
所述步骤(1)中，喷雾干燥条件为：进风温度为150℃。
所述步骤(2)中，还包括将去除的乙醇回收后，作为无水乙醇循环应用于步骤(1)的步骤。
所述步骤(3)中，CO2超临界萃取步骤如下：
(Ⅰ)在温度50℃、压力15Mpa的条件下，以超临界CO2为萃取剂对破壁后的菌体进行萃取，得到二氧化碳流体；
(Ⅱ)将以上二氧化碳流体泵入入第一分离罐，在温度50℃、压力9Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油；
(Ⅲ)将剩余的二氧化碳流体泵入第二分离罐，在温度40℃、压力5Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油，二氧化碳气体通过加压后形成二氧化碳流体循环使用。
按如下公式计算藻油的萃取率、提取率，并检测藻油的DHA含量，结果如表1所示：
萃取率(％)＝藻油质量(g)/藻粉质量(g)
提取率(％)＝萃取率/藻粉含油率。
对比例1
一种从裂殖壶菌中提取DHA藻油的方法，包括如下步骤：
(1)将裂殖壶菌发酵液经离心、喷雾干燥后，制备裂殖壶菌干粉，然后将裂殖壶菌干粉与软化水按照质量体积比1:5的比例混合均匀，单位kg/L，静置30min，然后在压力为100Mpa条件下进行高压匀质破壁，循环破壁3次，制得破壁乙醇溶液；
(2)将步骤(1)制得的破壁乙醇溶液在45℃温度、-0.08Mpa压力条件下进行低温真空蒸发，去除乙醇，制得破壁菌体；
(3)取步骤(2)制得的破壁菌体，进行CO2超临界萃取，制得DHA藻油。
所述步骤(1)中的裂殖壶菌发酵液，制备步骤如下：
a、取裂殖壶菌接种于活化培养基中，在30℃下活化培养24h，制得活化菌种；
b、将步骤a制得的活化菌种按重量百分比10％接种于发酵培养基中，在30℃的条件下发酵培养55h，然后流加浓度500g/L的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度为12g/L，继续发酵25h，制得裂殖壶菌发酵液。
所述步骤(1)中，喷雾干燥条件为：进风温度为140℃。
所述步骤(2)中，还包括将去除的乙醇回收后，作为无水乙醇循环应用于步骤(1)的步骤。
所述步骤(3)中，CO2超临界萃取步骤如下：
(Ⅰ)在温度45℃、压力17Mpa的条件下，以超临界CO2为萃取剂对破壁后的菌体进行萃取，得到二氧化碳流体；
(Ⅱ)将以上二氧化碳流体泵入入第一分离罐，在温度45℃、压力10Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油；
(Ⅲ)将剩余的二氧化碳流体泵入第二分离罐，在温度35℃、压力6Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油，二氧化碳气体通过加压后形成二氧化碳流体循环使用。
按如下公式计算藻油的萃取率、提取率，并检测藻油的DHA含量，结果如表1所示：
萃取率(％)＝藻油质量(g)/藻粉质量(g)
提取率(％)＝萃取率/藻粉含油率。
对比例2
一种从裂殖壶菌中提取DHA藻油的方法，包括如下步骤：
将裂殖壶菌发酵液经离心、喷雾干燥后，制备裂殖壶菌干粉，然后向裂殖壶菌干粉表面喷洒2％(以干燥菌体重量计)无水乙醇；然后进行CO2超临界萃取，制得DHA藻油。
所述裂殖壶菌发酵液，制备步骤如下：
a、取裂殖壶菌接种于活化培养基中，在30℃下活化培养24h，制得活化菌种；
b、将步骤a制得的活化菌种按重量百分比10％接种于发酵培养基中，在30℃的条件下发酵培养55h，然后流加浓度500g/L的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度为12g/L，继续发酵25h，制得裂殖壶菌发酵液。
所述喷雾干燥条件为：进风温度为140℃。
所述CO2超临界萃取步骤如下：
(Ⅰ)在温度45℃、压力17Mpa的条件下，以超临界CO2为萃取剂对破壁后的菌体进行萃取，得到二氧化碳流体；
(Ⅱ)将以上二氧化碳流体泵入入第一分离罐，在温度45℃、压力10Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油；
(Ⅲ)将剩余的二氧化碳流体泵入第二分离罐，在温度35℃、压力6Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油，二氧化碳气体通过加压后形成二氧化碳流体循环使用。
按如下公式计算藻油的萃取率、提取率，并检测藻油的DHA含量，结果如表1所示：
萃取率(％)＝藻油质量(g)/藻粉质量(g)
提取率(％)＝萃取率/藻粉含油率。
表1
结果分析
由表1可以看出，实施例1与对比例2的区别仅在于采用不同的溶剂对藻类细胞干粉进行处理，实施例1与对比例2的区别仅在于高压均质破壁前采用无水乙醇进行不同的处理方式，从而导致二者的萃取率和提取率差异明显，主要原因是在高压匀浆破壁前，先将藻类细胞干粉用无水乙醇浸泡，从而使细胞壁上的蛋白质变性，有助于细胞壁的破除；并且避免了高压匀浆机破壁的过程中，前期释放的油脂将菌体细胞包裹保护起来，发生乳化，导致高压匀浆不能彻底破除细胞壁的问题。
Claims (11)
1.一种从藻类细胞中提取DHA藻油的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将藻类细胞发酵液经离心、喷雾干燥后，制备藻类细胞干粉，然后将藻类细胞干粉与无水乙醇按照质量体积比1:（4～6）的比例混合均匀，单位kg/L，静置25～40min，然后在压力为80～120Mpa条件下进行高压匀质破壁，循环破壁2～4次，制得破壁乙醇溶液；
（2）将步骤（1）制得的破壁乙醇溶液在40～50℃温度、-0.12～-0.05 Mpa压力条件下进行低温真空蒸发，去除乙醇，制得破壁菌体；
（3）取步骤（2）制得的破壁菌体，进行CO2超临界萃取，制得DHA藻油。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的藻类细胞发酵液，制备步骤如下：
a、取藻类细胞接种于活化培养基中，在28～32℃下活化培养20～28h，制得活化菌种；
b、将步骤a制得的活化菌种按重量百分比5～10%接种于发酵培养基中，在30℃的条件下发酵培养50～65h，然后流加浓度450～600g/L的葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度为10g/L～15g/L，继续发酵20～30h，制得藻类细胞发酵液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的活化培养基，组分如下：
葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、海水晶20g/L，pH5.0。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基，组分如下：
葡萄糖40g/L、蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、海水晶20g/L，pH5.0。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，喷雾干燥条件为：进风温度为130～150℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述的藻类为裂殖壶菌。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，藻类细胞干粉与无水乙醇的质量体积比为1:5。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，高压匀质破壁条件为：压力100Mpa，循环破壁3次。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，低温真空蒸发的温度为45℃、压力为-0.08Mpa。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，还包括将去除的乙醇回收后，作为无水乙醇循环应用于步骤（1）的步骤。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，CO2超临界萃取步骤如下：
（Ⅰ）在温度40～50℃、压力15～20Mpa的条件下，以超临界CO2为萃取剂对破壁后的菌体进行萃取，得到二氧化碳流体；
（Ⅱ）将以上二氧化碳流体泵入入第一分离罐，在温度40～50℃、压力9Mpa～12Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油；
（Ⅲ）将剩余的二氧化碳流体泵入第二分离罐，在温度30～40℃、压力5Mpa～8Mpa的条件下，进行减压分离，制得DHA藻油，二氧化碳气体通过加压后形成二氧化碳流体循环使用。
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