CN107099561A - 一种含二十二碳六烯酸油脂的无溶剂提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含二十二碳六烯酸（DHA）油脂的无溶剂提取方法。该方法包括：以裂殖壶菌为出发菌株，在液体培养基中连续发酵得到发酵液；向发酵液中添加氢氧化钠溶液调节pH；加热酶解罐；添加生物复合酶液进行破壁反应；离心分离酶解液获得富含二十二碳六烯酸油脂。通过本发明从裂殖壶菌中提取油脂，毛油提取率高达95％以上，得到的油脂酸价低，色泽浅，无溶剂残留，提取时间更短，提取成本更低。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及利用裂殖壶菌生产含二十二碳六烯酸（DHA）油脂的方法，特别是从裂殖壶菌菌体中提取油脂的方法。
背景技术
近年来，多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids， PUFAs）对人类健康的重要作用已愈来愈受到人们的关注。其中，二十二碳六烯酸因其在人体和动物体内的重要生理功能而倍受人们的青睐。研究表明，DHA是人体某些组织中细胞膜的基本组分；对婴幼儿视觉***和神经***的发育起着重要作用；还具有降低胆固醇的作用，抗凝血功效以及抑制癌功效，防止老年性痴呆症等。
利用微生物发酵生产二十二碳六烯酸（DHA）油脂己形成工业化生产，二十二碳六烯酸的生产工艺也在不断改进。现有公开报道，从海洋微藻生产二十二碳六烯酸（DHA）油脂，细胞破壁及油脂提取方法有三类。
一类是物理方法破壁后利用有机溶剂萃取，机械破壁如采用均质机或胶体磨等机械进行磨擦和挤压使细胞壁破裂、干燥法等。采用机械破壁方法细胞破壁不完全，用有机溶剂萃取收得率为总油脂的60-70％。采用干燥法耗时耗能，且加热及通气方法干燥后提取油脂过氧化值较高，毛油品质较差，冷冻干燥成本较高，干燥后用有机溶剂萃取精炼后得率仅为毛油的30-50％。公开日为1995年4月5日，公开号为CN1101034A的专利申请公开的利用海洋微藻生产二十二碳六烯酸（DHA）油脂的方法是采用冷冻干燥或加热及通气方法干燥后进行提取。
第二类是采用化学试剂破坏细胞壁结构，然后用有机溶剂萃取得到毛油。公开日为2007年6月27日，公开号为CN1986822A的专利申请公开的用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法是采用加破壁剂如十二烷基硫酸钠等，其用量为浓缩发酵液取量的0.1-0.6％。这种方法得到的油脂中会有化学试剂残留，影响油的品质。且毛油质量较差，精炼后得率仅为毛油30-50％。
第三类是采用生物酶对细胞进行酶解破壁，然后用有机溶剂萃取得到毛油。公开日为2008年11月19日，公开号为CN101307341的专利申请公开的一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法，以寇氏隐甲藻为出发菌株，在液体培养基中连续培养寇氏隐甲藻得到海藻细胞，然后通过生物酶法破壁从海藻细胞中提取二十二碳六烯酸油脂，虽然其细胞破壁率达到95%，但是其破壁之后仍需使用大量乙醇、正己烷等有机溶剂进行萃取，提取成本较高。
采用改进的方法对油脂进行提取仍有空间。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于改进现有技术中利用有机溶剂对DHA油脂进行提取的方法，提供一种无有机溶剂提取DHA油脂的方法。本发明提供的方法不仅提高二十二碳六烯酸（简称DHA）的收得率和毛油的品质，并且避免了乙醇、正己烷等有机溶剂的使用。
具体的，本发明的方案为：
一种含二十二碳六烯酸（DHA）油脂的无溶剂提取方法，其中，该方法具体步骤为：
（1）培养裂殖壶菌，在液体培养中连续有氧发酵，获取含裂殖壶菌菌体的发酵液；
（2）将步骤（1）获得的发酵液转移至酶解罐，加入氢氧化钠溶液将发酵液pH调节为8-9；
（3）将步骤（2）的发酵液加热至35-60℃；
（4）在步骤（3）的发酵液中加入复合酶液，并搅拌反应获得酶解液；
（5）将上述酶解液进行离心，排除渣、水相，收集油相，获得毛油；
（6）将步骤（5）获得的毛油，经脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精油。
本发明所述的方法，其中，使用的复合酶液为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、纤维素酶、溶菌酶、蜗牛酶、葡聚糖酶、木聚糖酶中的一种或多种。
使用的复合酶液为碱性蛋白酶、蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶的组合物，其中碱性蛋白酶的重量比例为65-75%；蜗牛酶的重量比例为12.5-15%；纤维素酶的重量比例为7.5-10%；溶菌酶的重量比例为5-10%。
所述复合酶用量为发酵液中菌体干重的2%-4%。
步骤（4）所述搅拌反应时间为3-10小时。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明的酶解方法细胞破壁完全，破壁率为95％以上，不需要经过干燥，可以防止二十二碳六烯酸毛油的氧化，使提取油脂过氧化值极低，POV值在0.5以下，收得率为总油的95％以上，精炼得率为毛油的75％以上。
（2）本发明提供的方法，无需乙醇、正己烷等有机溶剂的使用，提高了生产车间的安全性，节省了设备投资，降低了能源损耗及提取成本，符合环境友好型社会的发展需求，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
本实施例及对比实施例的发酵液来源于同一批次的发酵液，采用裂殖壶菌斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液5吨，每100kg发酵液中细胞干重为11.2kg。
实施例1
采用裂殖壶菌斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液，取100kg发酵液（细胞干重11.2kg），将上述发酵液转移至酶解罐，加入氢氧化钠溶液调节pH为9并加热至60℃，将发酵液中加入碱性蛋白酶0.3kg，蜗牛酶0.05kg，纤维素酶0.03kg，溶菌酶0.02kg，保温搅拌3-10小时，将上述酶解液以6000转/分钟转速离心分离，得到毛油5.7kg，将毛油经脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到精油4.6kg。
实施例2
一种无溶剂提取技术用于二十二碳六烯酸油脂生产方法：采用裂殖壶菌斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液，取100kg发酵液（细胞干重11.2kg），将上述发酵液转移至酶解罐，加入氢氧化钠溶液调节pH为9并加热至60℃，将发酵液中加入碱性蛋白酶0.26kg，蜗牛酶0.06kg，纤维素酶0.04kg，溶菌酶0.04kg，保温搅拌3-10小时，将上述酶解液以6000转/分钟转速离心分离，得到毛油5.4kg，将毛油经脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到精油4.3kg。
实施例3
一种无溶剂提取技术用于二十二碳六烯酸油脂生产方法：采用裂殖壶菌斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液，取100kg发酵液（细胞干重11.2kg），将上述发酵液转移至酶解罐，加入氢氧化钠溶液调节pH为7并加热至50℃，将发酵液中加入中性蛋白酶0.3kg，蜗牛酶0.05kg，葡聚糖酶0.03kg，木聚糖酶0.02kg，保温搅拌3-10小时，将上述酶解液以6000转/分钟转速离心分离，得到毛油5.5kg，将毛油经脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到精油4.4kg。
实施例4
一种无溶剂提取技术用于二十二碳六烯酸油脂生产方法：采用裂殖壶菌斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液，取100kg发酵液（细胞干重11.2kg），将上述发酵液转移至酶解罐，加入氢氧化钠溶液调节pH为7并加热至35℃，将发酵液中加入木瓜蛋白酶0.3 kg，胰蛋白酶0.05，蜗牛酶0.05kg，溶菌酶0.03 kg，木聚糖酶0.02 kg，保温搅拌3-10小时，将上述酶解液以6000转/分钟转速离心分离，得到毛油5.2kg，将毛油经脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到精油4.1 kg。
实施例5
一种无溶剂提取技术用于二十二碳六烯酸油脂生产方法：采用裂殖壶菌斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液，取100kg发酵液（细胞干重11.2kg），将上述发酵液转移至酶解罐，加入氢氧化钠溶液调节pH为9并加热至60℃，将发酵液中加入碱性蛋白酶0.2 kg，蜗牛酶0.03 kg，保温搅拌3-10小时，将上述酶解液以6000转/分钟转速离心分离，得到毛油5.1 kg，将毛油经脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到精油4.0 kg。
对比实施例1
一种使用均质破壁的方法及有机溶剂提取的方法用于二十二碳六烯酸油脂生产：采用裂殖壶菌斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液，取100kg发酵液（细胞干重11.2kg），5000 r /min 离心5 min得到发酵浓缩液，经高压均质机均质2次，均质压力为40 MPa，然后加入95%乙醇50kg，加入正己烷100kg，进行萃取，得到毛油4.2kg，将毛油经脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到精油3.4kg。
对比实施例2
一种无溶剂提取技术用于二十二碳六烯酸油脂生产方法：采用裂殖壶菌斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液，取100kg发酵液（细胞干重11.2kg），将上述发酵液转移至酶解罐，加入氢氧化钠溶液调节pH为9并加热至60℃，将发酵液中加入碱性蛋白酶0.3kg，蜗牛酶0.05kg，纤维素酶0.03kg，溶菌酶0.02kg，保温搅拌3-10小时，然后加入95%乙醇50kg，加入正己烷100kg，进行萃取，得到毛油5.8kg，将毛油经脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到精油4.2 kg。
表1实施例1-5，及对比实施例1，2结果对照表
Claims (5)
1.一种含二十二碳六烯酸（DHA）油脂的无溶剂提取方法，其特征在于，该方法具体步骤为：
（1）培养裂殖壶菌，在液体培养中连续有氧发酵，获取含裂殖壶菌菌体的发酵液；
（2）将步骤（1）获得的发酵液转移至酶解罐，加入氢氧化钠溶液将发酵液pH调节为8-9；
（3）将步骤（2）的发酵液加热至35-60℃；
（4）在步骤（3）的发酵液中加入复合酶液，并搅拌反应获得酶解液；
（5）将上述酶解液进行离心，排除渣、水相，收集油相，获得毛油；
（6）将步骤（5）获得的毛油，经脱胶、碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精油。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用的复合酶液为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、纤维素酶、溶菌酶、蜗牛酶、葡聚糖酶、木聚糖酶中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用的复合酶液为碱性蛋白酶、蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶的组合物，其中碱性蛋白酶的重量比例为65-75%；蜗牛酶的重量比例为12.5-15%；纤维素酶的重量比例为7.5-10%；溶菌酶的重量比例为5-10%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合酶用量为发酵液中菌体干重的2%-4%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述搅拌反应时间为3-10小时。
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