CN104330577B - 一种c反应蛋白定量测定试剂盒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种C反应蛋白定量测定试剂盒，属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域。该试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物。本发明还公开了该试剂盒的制备方法与使用该试剂盒检测C反应蛋白的方法。本发明以异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体和碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体制备抗试剂，以抗异硫氰酸荧光素抗体偶联羧基磁珠制得磁微粒试剂，使免疫反应更容易混匀和分离，而且大大提高了反应速度，以新型化学发光底物ALPS为底物，提高了试剂盒的灵敏度和特异性性能。本发明的检测试剂盒性能可靠、灵敏度高、线性范围宽，可配合半自动、全自动仪器使用。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械生物类免疫体外诊断领域，具体涉及一种基于磁微粒分离化学发光法定量检测血液中C反应蛋白的试剂盒及其制备方法，以及应用该试剂盒定量检测血液中C反应蛋白的方法。
背景技术
血清CRP水平是指示细菌感染的一项敏感而客观的指标。细菌感染时，血清CRP的水平可以中度或明显升高，阳性率可达90％以上；而病毒等感染时CRP水平多正常或轻度升高，因此可以帮助细菌感染与非细菌感染的鉴别诊断。此外，定量测定脑脊液、胸腔积液中的CRP水平亦可以对脑膜炎、胸膜炎的鉴别诊断有一定意义；不仅如此，CRP水平还与感染范围和感染严重程度有一定关系。另外，血清CRP水平还可以用来预测感染性疾病的严重程度、住院时间的长短、预后及复发。CRP还可以反映动脉粥样硬化斑块的成分并预测斑块破裂的可能性，是心血管疾病的独立预测因子。冠心病、急性冠脉综合征患者CRP往往明显升高，如心肌梗死患者中血清CRP可以急剧上升，其升高水平与冠状动脉梗阻程度、冠心病终末事件的发生及预后、充血性心力衰竭的程度等均有显著相关性。目前，CRP已经成为健康人及冠脉疾病患者心血管疾病风险的预测因子之一，也是监测疾病治疗效果的指标之一。
在国内，C反应蛋白(CRP)检测临床上主要以国外进口试剂和免疫组化试剂应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。具有自主知识产权的国产C反应蛋白(CRP)免疫化学发光检测试剂盒目前还较少，也仅停留在96孔微孔板式技术水平上。该技术灵敏度较低、线性窄、特异性较差，也不利于高通量的全自动检测。
因此，有待开发对C反应蛋白(CRP)检测灵敏度高与可靠性并能降低检测成本的检测技术。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的旨在提供一种C反应蛋白定量测定试剂盒，该试剂盒能够有效提高检测灵敏度及可靠性，并降低成本，延长有效期。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种C反应蛋白定量测定试剂盒，其包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；该试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；所述磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制成，所述发光底物是将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制成。
另一方面，本发明还提供了这种C反应蛋白定量测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
分别配制C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物独立地置于包装容器内，得到C反应蛋白的定量测定试剂盒。
本试剂盒的异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体为能与人体内C反应蛋白抗原特异结合的单克隆抗体，所述碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体为能与C反应蛋白抗原特异结合的单克隆抗体。包被抗体和标记抗体除能与C反应蛋白抗原特异性结合外，配对使用时可与抗原形成“三明治”夹心结构。
具体地，所述C反应蛋白定量测定试剂盒按照如下方法制备而成：
A、C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品的配制方法如下：
用标准品缓冲液溶解C反应蛋白，配置C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品；其中，所述校准品缓冲液是通过在1L新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；
B、抗试剂的制备方法如下：
1)抗试剂缓冲液的制备：
将12.12mg～60.57mg的Tris、0.01g～0.05g的四环素、1g～5g的绵羊血清、3g～10g的新生牛血清、1g～5g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，制得抗试剂缓冲液；
2)异硫氰酸荧光素与C反应蛋白偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体：
首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，使用分光光度计在495nm处读取吸光值，来调整浓度，然后按照C反应蛋白抗体与异硫氰酸荧光素的质量之比为1:1.1，将二者同时转移到棕色玻璃瓶中，室温下搅拌1～2小时，充分反应后使用pH为8～9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体；紫外监测，记录仪记录纯化图谱，同时注意确认含有连接物的试管，注意、避光防护；
3)碱性磷酸酶与C反应蛋白抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体：
首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，可以根据分光光度计在280nm处读取吸光值，将碱性磷酸酶的吸光值应该在一定的范围内。然后按照碱性磷酸酶与C反应蛋白的摩尔比为1:2～1:10的量将二者转移至棕色瓶中，室温下搅拌4～5小时，充分反应后使用pH为8～9的碳酸氢盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到的碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体；注意含有连接物的试管的避光防护。
4)将步骤2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体和和步骤3)中获得的碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体，加入含有表面活性剂的Tris盐缓冲液，充分搅拌后获得所述抗试剂；所述表面活性剂为Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种，表面活性剂的添加量为0.01％～0.5％。
C、磁微粒试剂的制备：
将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂。
1)取一定体积的充分混匀后的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中，将该反应瓶在磁场中放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入相当于反应瓶中羧基磁珠体积2～5倍的磁微粒缓冲液，混匀20-30min；再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清；重复清洗羧基磁珠3遍。最后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混匀待用；所述磁微粒缓冲液的配置方法是将12.12mg的Tris，5.82mg的氯化钠，50g的甲基纤维醚加入到1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解即得；该磁珠缓冲液含多种去垢剂，能够有效地清除非特异性吸附，提高检测特异性；
2)连接反应：按照质量比羧基磁珠溶液：抗异硫氰酸荧光素抗体＝100:1的比例在步骤1)所制得的羧基磁珠溶液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，在2～8℃内保持混匀状态反应18小时；
3)反应瓶在磁场中放置15min，待羧基磁珠沉降后用磷酸缓冲液清洗3遍，然后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需磁微粒试剂。
D、发光底物的制备：将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制备发光底物；
用相当于ALPS体积4～10倍的发光底物缓冲液充分溶解ALPS，所述发光底物缓冲液的配置方法是将12.12g～121.14g的Tris、5.82g的氯化钠、0.03g的光泽精加入到1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用盐酸调节pH至9.5即得。
进一步的，本发明的C反应蛋白定量测定试剂盒，该试剂盒还包括清洗液，该清洗液主要用于在检测过程中清洗与磁微粒试剂反应后的样品，清洗液的具体组分可以参照所属领域的常规操作进行。通常是磷酸二氢钠、氯化纳、Tween20和ProcLin300的混合溶液，在试剂盒制品中可以浓缩清洗液的形式存在，检测时适当稀释后使用。优选的清洗液的配置方法是将12.12g的Tris、5.82g的氯化钠、50mL的Tween-20、50mL的曲拉通-100，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解。
再一方面，本发明还提供了利用这种C反应蛋白定量测定试剂盒检测C反应蛋白的方法，该方法包括步骤：
1)取三支试管分别加15μLC反应蛋白的校准品、15μLC反应蛋白的质控品、15μL待测样本；
2)每支试管中加入60μL抗试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴5min；
3)每支试管中加入30μL磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴5min；
4)将三支试管在磁分离器上沉淀2min，缓慢地倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起放在滤纸上，用力拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
5)每支试管中加入300μL清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
6)重复步骤5)一次；
7)每支试管中加入200μL发光底物溶液，振荡混匀3s，用化学发光仪检测发光强度。
本发明的试剂盒中未详细提及的试剂组分(例如清洗液、一些必要的缓冲液等)、试剂盒的外包装以及各试剂组分的独立包装容器等均可以按照所属领域的常规操作进行，符合相关行业规定即可。本发明的方法中未详细提及的操作步骤也可参照所属领域的常规操作进行，例如在检测前可将各试剂放至室温(18～25℃)，加样前充分混匀；所用检测仪器设备例如化学发光类测定仪的使用按照说明书操作进行；本发明中，未特别注明单位的比例与含量，固体组分为质量比例与含量，液体组分为体积比例与含量。
本发明的有益效果在于：
1、本发明以碱性磷酸酶为标记酶，通过化学反应标记抗体，并使用凝胶层析分离纯化，提高了反应的灵敏度；
2、本发明以抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂，使免疫反应更容易混匀和分离，而且大大提高了反应速度；
3、本发明以ALPS(N-乙基-N-(3-丙磺基)苯胺钠盐)为底物，该底物是辉光性底物，灵敏度高，可以快速达到平台期，平台稳定期长且信号较强，有利于信号的检测，提高了最终试剂盒的灵敏度和特异性性能；并进一步优化了化学发光增强体系，保证了终产品的信号灵敏度高和稳定性好、变异小；
4、本试剂盒稳定性良好，有效期可至一年以上；
5、本试剂盒在临床研究中与国外进口试剂的符合相关性高达95％以上，且费用仅为其1/5，使用成本低。
附图说明
图1是C反应蛋白的标准曲线；
图2是C反应蛋白定量测定试剂盒与进口检测试剂的检测效果相关性曲线。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明做具体说明。
实施例1：各种缓冲液的配置，具体如下：
1、Tris盐缓冲液
将12.12g的Tris、5.82g的氯化钠，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用盐酸调整最终pH为7.5。
2、校准品缓冲液的制备
在1L新生牛血清中加入0.01g四环素和0.1g硫酸新霉素，充分溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成。
3、抗试剂缓冲液
将30.5mg的Tris、0.03g的四环素、3g的绵羊血清、8g的新生牛血清、3g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解即得；
4、磁微粒缓冲液
将12.12mg的Tris、5.82mg的氯化钠、50g的甲基纤维醚加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解即得。
5、发光底物缓冲液
将50.21g的Tris、5.82g的氯化钠、0.03g的光泽精加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用盐酸调节缓冲液的pH至9.5即得；
6、清洗液浓缩液的配置
将12.12g的Tris、5.82g的氯化钠、50mL的Tween-20、50mL的曲拉通-100加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解即得。
实施例2：C反应蛋白定量测定试剂盒的制备
1、校准品和质控品的制备
首先用标准品缓冲液溶解C反应蛋白，配置成如表1所示的目标浓度的校准品和质控品；本实施例所用的C反应蛋白采购自生产厂家fitzgerald公司。
表1校准品和质控品的制备
2、抗试剂的制备方法如下：
1)异硫氰酸荧光素与C反应蛋白抗体偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体：
首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为2.5mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照质量比为C反应蛋白：异硫氰酸荧光素溶液＝1:1.1将二者转移到棕色玻璃瓶里，室温下搅拌1～2小时；充分反应后使用pH为8～9的碳酸氢盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体；
2)碱性磷酸酶与C反应蛋白抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体：
首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为2.5mg/mL的碱性磷酸酶溶液，按照摩尔比为碱性磷酸酶：C反应蛋白＝1:2的二者转移至棕色玻璃瓶中，室温下搅拌4～5小时，充分反应后使用pH为8～9的碳酸氢盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体；紫外监测，记录仪记录纯化图谱，注意、避光防护；
3)将步骤1)中获得的异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体和和步骤2)中获得的碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体加入含有0.1％Tween20的Tris盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂；
3、磁微粒试剂的制备：将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基偶联制得磁微粒试剂；
1)取10mL的充分混匀后的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中，将该反应瓶在磁场放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入相当于反应瓶中羧基磁珠体积5倍的磁微粒缓冲液，震荡清洗20～30min；再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清。重复清洗羧基磁珠3遍。最后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混匀待用；
2)连接反应：按照质量比羧基磁珠溶液：抗异硫氰酸荧光素抗体＝100:1的比例在步骤1)所制得的羧基磁珠溶液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，在2～8℃内保持混匀状态反应18小时；
3)反应瓶在磁场中放置15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液清洗3遍，随后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需待用磁微粒试剂。
4、发光底物的制备：
用相当于ALPS体积7倍的发光底物缓冲液充分溶解ALPS。
5、将C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物独立地置于包装容器内，得到C反应蛋白的定量测定试剂盒。
实施例3：利用实施例2所述的C反应蛋白定量测定试剂盒检测C反应蛋白的方法，该方法包括步骤：
1)取三支试管分别加15μLC反应蛋白的校准品、15μLC反应蛋白的质控品、15μL待测样本；
2)每支试管中加入60μL抗试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴5min；
3)每支试管中加入30μL磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴5min；
4)将试管在磁分离器上沉淀2min，缓慢地倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起放在滤纸上，用力拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
5)每支试管中加入300μL清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
6)重复步骤5)一次；
7)每支试管中加入200μL发光底物溶液，振荡混匀3s，用化学发光仪检测发光强度；
8)数据的处理：
通过四参数非线性拟合校准品的浓度值和发光值获得标准曲线的四参数Logistic方程：Y＝350.4984+(4283133.6431-350.4984)/(1+(X/68.2067)＾-1.3246(R＝0.999025)，标准曲线如图1所示，其中，横轴代表校准品的浓度值，纵轴代表发光值。
临床数据：
1、为了评价本发明的C反应蛋白定量测定试剂盒的稳定性和准确性，每隔2个月对本实施例的试剂盒性能进行测定。
测试结果如表2所示。由表2可以看出：C反应蛋白与发光值的相关性连续15个月保持在0.99以上，本发明的试剂盒的最低检测限和准确度的相对偏差以及每批次的质控品的变异系数也符合国家标准。表2的数据表明本发明的C反应蛋白定量测定试剂盒的有较好的稳定性和准确性。
表2C反应蛋白定量测定试剂盒分析性能和稳定性表
2、C反应蛋白定量测定试剂盒与进口检测试剂检测效果的比较
选取240份标本，将标本中的低中高值分离后，对低中高值样本进行单独的线性回归分析，得到了线性回归方程y＝0.969X-0.732，R2＝0.964。该回归曲线方程如图2所示，其中，横轴代表对照测值，纵轴代表参考测值。图2表明，本发明的试剂盒性能可靠，灵敏度高，线性范围宽，可配合全自动仪器使用。
3、采用本实施例的C反应蛋白定量测定试剂盒，对120份正常人样本进行检验；用SPSS19.0forwindows软件对正常人样本的测定结果进行正态性检验，数据整体分布基本属于非正态分布。
表3C反应蛋白定量测定试剂盒正态性检验表
| 项目 | 自由度 | p值 |
| 正常人血清 | 120 | 0.01 |
4、C反应蛋白定量测定试剂盒临床参考值范围；以正常人样本检测值的双侧95百分位数作为参考值。
表4C反应蛋白定量测定试剂盒临床参考值范围表
| 项目 | 95％计算基本范围(mg/L) | 修正参考值范围(mg/L) |
| 正常人血清 | 0.4128～2.87 | 0～3 |
可以看出，本发明的试剂盒性能可靠，灵敏度高，线性范围宽，可配合全自动仪器使用。
上述实施例仅为本发明优选的实施案例，不能以此来限定本发明所要求保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的及替换均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种C反应蛋白定量测定试剂盒的制备方法，其特征在于：该试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；所述磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制成，所述发光底物是将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制成；
分别配制C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将C反应蛋白校准品、C反应蛋白质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物独立地置于包装容器内，得到C反应蛋白的定量测定试剂盒；
所述校准品、质控品、抗试剂按照如下方法制备而成：
A、校准品、质控品的配制：
用校准品缓冲液溶解C反应蛋白，配置C反应蛋白校准品和C反应蛋白质控品；其中，所述校准品缓冲液是通过在1L新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；
B、抗试剂的配制：
1)抗试剂缓冲液的制备：
将12.12mg～60.57mg的Tris、0.01g～0.05g的四环素、1g～5g的绵羊血清、3g～10g的新生牛血清、1g～5g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，制得抗试剂缓冲液；
2)异硫氰酸荧光素与C反应蛋白抗体偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体：
首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照质量比为C反应蛋白：异硫氰酸荧光素溶液＝1:1.1的二者转移到棕色玻璃瓶里，室温下搅拌1～2小时；充分反应后使用pH为8～9的碳酸氢盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体；
3)碱性磷酸酶与C反应蛋白抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体：
首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，按照摩尔比为碱性磷酸酶：C反应蛋白＝1:2～1:10的二者转移至棕色玻璃瓶中，室温下搅拌4～5小时，充分反应后使用pH为8～9的碳酸氢盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体；
4)将步骤2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的C反应蛋白包被抗体和步骤3)中获得的碱性磷酸酶标记的C反应蛋白标记抗体加入含有表面活性剂的Tris盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂；所述表面活性剂为Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种，表面活性剂的添加量为0.01％～0.5％。
2.根据权利要求1所述的C反应蛋白定量测定试剂盒的制备方法，其特征在于：该试剂盒还包括清洗液，所述清洗液的配置方法将12.12g的Tris、5.82g的氯化钠、50mL的Tween-20、50mL的曲拉通-100，加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解。
3.根据权利要求1所述的C反应蛋白定量测定试剂盒的制备方法，其特征在于所述磁微粒试剂是按照以下步骤制备的：
1)将充分混匀后的羧基磁珠浓缩液放入反应瓶中，将该反应瓶在磁场内放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入相当于反应瓶中羧基磁珠体积2～5倍的磁微粒缓冲液，震荡清洗20-30min；再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清；重复清洗羧基磁珠3遍；最后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混匀待用；所述磁微粒缓冲液的配置方法是将12.12mg的Tris，5.82mg的氯化钠，50g的甲基纤维醚加入到1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解即得；
2)连接反应：按照质量比羧基磁珠溶液：抗异硫氰酸荧光素抗体＝100:1的比例在步骤1)所制得的羧基磁珠溶液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，在2～8℃内保持混匀状态反应18小时；
3)反应瓶在磁场中放置15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液洗3遍，随后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需待用磁微粒试剂。
4.根据权利要求1所述的C反应蛋白定量测定试剂盒的制备方法，其特征在于：所述发光底物是用相当于ALPS体积4～10倍的发光底物缓冲液充分溶解ALPS制备而成的；所述发光底物缓冲液的配置方法是将12.12g～121.14g的Tris、5.82g的氯化钠、0.03g的光泽精加入到1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用盐酸调节pH至9.5即得。
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