CN103439515A

CN103439515A - 一种抗体效价的检测方法

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Publication number: CN103439515A
Application number: CN2013103549340A
Authority: CN
Inventors: 裘宇容; 付琳; 姜云飞
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2013-08-14
Filing date: 2013-08-14
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2033-08-14
Also published as: CN103439515B

Abstract

本发明公开了一种抗体效价的检测方法，包括如下步骤：1)将抗原偶联微球上，得到改性微球；2)将改性微球与抗体溶液混合反应；3)测定反应液的浊度，确定抗体效价。本发明的方法，利用生物素-链霉亲和素***将CCP修饰在聚苯乙烯微球表面成功制备颗粒型CCP抗原；采用本方法制备的颗粒型CCP抗原检测血清中抗CCP抗体效价，检测结果线性良好，检测过程20min即可完成，相对于现有ELISA检测方法需耗时2～3h，可以更为快捷的获得检测结果。

Description

一种抗体效价的检测方法

技术领域

本发明涉及一种抗体效价的检测方法，特别涉及利用改性固相载体检测抗体效价的方法。

背景技术

抗体效价是疾病诊断、特异性免疫球蛋白制备和疫苗评价等领域的重要指标，对其检测具有非常实际的意义。在众多的抗体效价测定技术中，ELISA法因为操作简单，速度快，应用最为广泛。

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis， RA)是一种累及周围关节为主的慢性多***性炎症性的自身免疫病，特征性的临床表现为多个周围关节慢性炎症性病变，可造成永久性的关节畸形，致残率高，被称为“不死的癌症”。因此早期诊断、早期治疗，可延缓病情进展，降低致残率，改善预后。

环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）是一条人工合成的含有21个氨基酸的多肽，其氨基酸序列为HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS，其中X代表瓜氨酸，其通过第3和第16位的半胱氨酸巯基氧化而形成环肽。瓜氨酸残基是类风湿关节炎特异的抗中间丝相关蛋白（filaggrin）抗体识别表位的必需组成部分。抗环瓜氨酸肽抗体（anti-cyclic citrullinated peptide antibody，anti-CCP）是环状聚丝蛋白的多肽片段，是以IgG型为主的抗体，对类风湿性关节炎（RA）具有很好的敏感性和特异性，且抗CCP抗体阳性的RA病人骨破坏较抗CCP抗体阴性者严重。2010年由美国风湿病学会（ACR）和欧洲抗风湿联盟（EULAR）一起宣布新的RA分类诊断标准，抗CCP 抗体被正式列入类风湿性关节炎的诊断标准之中。

目前，抗CCP 抗体的检测ELISA 法应用最广泛。其他检测方法多处于初步的摸索研究阶段，由于检测仪器设备、试剂价格等方面的限制，检测方法仍不成熟，影响检测及诊断性能的因素仍需进一步改进。然而，现有的ELISA法的检测时间还是过长，一般需要2个小时才可以获得结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗体效价的检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种抗体效价的检测方法，包括如下步骤：

1) 将抗原偶联微球上，得到改性微球；

2) 将改性微球与抗体溶液混合反应；

3) 测定反应液的浊度，确定抗体效价。

一种抗CCP抗体效价的检测方法，包括如下步骤：

1) 在CCP多肽上偶联特异性亲和小分子，在微球上偶联特异性亲和小分子的特异性靶标分子；

2) 将修饰后的CCP多肽和微球混合，得到颗粒型CCP多肽抗原；

3) 将颗粒型CCP多肽抗原与抗体溶液混合，反应；

4) 测定反应体系的浊度，确定抗体效价。

作为本发明的进一步改进，CCP多肽上偶联的特异性亲和小分子为生物素，微球上偶联的特异性靶标分子为链霉亲和素。

在CCP多肽偶联生物素包括如下步骤：

1) 将CCP多肽溶解于缓冲液中，酯化生物素用二甲基亚砜溶解，混合；

2) 室温搅拌反应完全，去除未反应的生物素；

3) 收集、纯化得到偶联生物素的CCP多肽。

在微球上偶联链霉亲和素包括如下步骤：

1) 将羧基化胶乳微球与乙磺酸缓冲液混合，加入EDC和NHS活化，洗涤得到活化微球；

2) 将链霉亲和素溶解于PBS缓冲液中，加入活化微球，室温反应，反应完全后洗涤；

3) 用赖氨酸封闭，得到SA修饰微球。

特别的，上述在微球上偶联链霉亲和素的反应中，链霉亲和素溶解于pH6.8～7.8的PBS缓冲液中。

更进一步的，EDC和NHS的摩尔比为1：（1～2）。

本发明的有益效果是：

本发明的方法，利用生物素-链霉亲和素***将CCP修饰在聚苯乙烯微球表面成功制备颗粒型CCP抗原；采用本方法制备的颗粒型CCP抗原检测血清中抗CCP抗体效价，检测结果线性良好，检测过程20min即可完成，相对于现有ELISA检测方法需耗时2～3h，可以更为快捷的获得检测结果。

本发明CCP多肽的生物素标记方法，反应条件温和，不会破坏CCP多肽的活性，具有很好的反应活性。

附图说明

图1为生物素修饰CCP结构示意图；

图2为验证生物素修饰CCP效果操作流程图；

图3和图5为实施例1、实施例2中生物素修饰CCP前后紫外吸收光谱变化曲线图；

图4和图6为ELISA验证实施例1、实施例2中生物素修饰CCP与抗体反应抗体浓度与吸光度值的变化关系图；

图7为CCP与聚苯乙烯微球连接过程示意图；

图8为通过颗粒增强免疫比浊法检测抗CCP抗体反应示意图；

图9和图10分别为实施例7、实施例8中通过免疫比浊法检测抗CCP抗体浓度与吸光度的变化值的变化关系图。

具体实施方式

CCP多肽的生物素修饰

合成的CCP多肽溶解于一定浓度一定pH范围的缓冲液中，酯化生物素用二甲基亚砜（DMSO）溶解，迅速与适量CCP多肽溶液混合，室温搅拌孵育4h，然后用脱盐柱去除多余的生物素示。放置收集管与脱盐柱下方，用一定浓度一定pH范围的 PBS缓冲液洗脱样品，收集洗脱液，工艺路线如图1所示。取洗脱收集液，根据紫外吸收光谱评价标记效果。ELISA法鉴定生物素化CCP效果，验证路线如图2所示。

链霉亲和素标记聚苯乙烯微球的制备

1) 取0.1mL羧基化胶乳微球，加入0.9mL乙磺酸缓冲液（MES）混合均匀后加入水溶性碳二亚胺类交联剂（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化，EDC浓度1.0-1.5g/L，EDC与NHS比例1:1-1:2之间，室温条件下温和搅拌，时间控制在15-30min；

2) 离心洗涤，转速12000-15000g离心10-30min，用0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)重复清洗沉淀三遍，去上清，沉淀经0.1mol/L PBS重悬、振荡、超声处理后即得到活化的胶乳微球；

3) 取2mg 链霉亲和素溶于pH6.5-7.8的PBS缓冲液中，加入到1mL经过活化的胶乳微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间2-4h；

4) 达到反应时间后，12000-15000g离心10-30min，沉淀用含有0.05-0.1%Tween20的PBS重复洗涤后的微球经超声分散重悬于PBS缓冲液中，加入30-40nmol赖氨酸，室温轻微震荡30-60min，12000-15000g离心10-30min洗涤三次，超声重悬于0.1M pH7.4 PBS缓冲液中备用。

下面结合实施例，进一步说明本发明。

CCP多肽的修饰：

实施例1

1) 溶解CCP多肽：制备好的CCP多肽溶解于0.15M pH9.0磷酸盐缓冲液中，4℃保存；

2) 溶解酯化生物素：用二甲基亚砜（DMSO）溶解酯化生物素；

3) 修饰：将溶解后的CCP多肽溶液与溶解后的酯化生物素溶液迅速混合，生物素与CCP的比例为10:1，室温搅拌孵育4h；

4) 用脱盐柱去除多余的生物素；

5) 用0.05M pH7.6的 PBS缓冲液洗脱样品。

收集洗脱液，根据紫外吸光谱评价标记结果：根据相同浓度(1mg/mL)生物素标记CCP产物与未经生物素标记CCP的紫外吸收光谱图比较，Biotin-CCP在210nm-230nm之间的吸光度值升高，如图3。用ELISA法鉴定生物素标记CCP效果：将制备的生物素化CCP包被到链霉亲和素包被的酶标板中，检测TMB显色后的OD值。如图4，随着血清中抗CCP抗体浓度的升高，TMB显色的OD值逐渐升高，并存在一定的正相关关系。说明CCP多肽成功标记生物素。

实施例2

1) 溶解CCP多肽：制备好的CCP多肽溶解于0.2M pH9.6磷酸盐缓冲液中，4℃保存；

2) 溶解酯化生物素：用二甲基亚砜（DMSO）溶解酯化生物素；

3) 修饰：将溶解后的CCP多肽溶液与溶解后的酯化生物素溶液迅速混合，生物素与CCP的比例为10:1。室温搅拌孵育4h；

4) 用脱盐柱去除多余的生物素；

5) 用0.1M pH7.2的 PBS缓冲液洗脱样品。

收集洗脱液，根据紫外吸光谱评价标记结果：根据相同浓度(1mg/mL)生物素标记CCP产物与未经生物素标记CCP的紫外吸收光谱图比较，Biotin-CCP在200nm-230nm之间的吸光度值升高，如图5。

用ELISA法鉴定生物素标记CCP效果：将制备的生物素化CCP包被到链霉亲和素包被的酶标板中，检测TMB显色后的OD值。如图6，随着血清中抗CCP抗体浓度的升高，TMB显色的OD值逐渐升高，并存在一定的正相关关系。说明CCP多肽成功标记生物素。

链霉亲和素标记聚苯乙烯微球的制备

实施例3

1) 活化：取0.1mL羧基化胶乳微球，加入0.9mL乙磺酸缓冲液（MES）混合。加入EDC和NHS活化，EDC浓度0.6g/L，EDC与NHS比例1:1，室温条件下温和搅拌15min；

2) 离心洗涤：PBS重复洗涤三遍，去上清，0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球；

3) 偶联反应：取2mg 链霉亲和素溶于pH6.8的PBS缓冲液中，加入到1mL经过活化的胶乳微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间2h；

4) 离心洗涤：PBS重复洗涤三遍，去上清，0.15M PBS超声重悬得到活化的胶乳微球；

5) 封闭：加入20nmol赖氨酸，室温轻微震荡30min，离心洗涤，超声重悬于0.15M pH7.0 PBS缓冲液中备用。

收集洗涤液，SA的浓度测定按照如下公式计算：C＝A₂₈₀／E (SA：E=3.4L/g)，计算偶联的SA含量。SA偶联量为0.5mg，偶联效率为25%。

实施例4

1) 活化：取0.1mL羧基化胶乳微球，加入0.9mL乙磺酸缓冲液（MES）混合。加入EDC和NHS活化，EDC浓度0.9g/L，EDC与NHS比例1:2，室温条件下温和搅拌15min；

3) 偶联反应：取2mg 链霉亲和素溶于pH7.2的PBS缓冲液中，加入到1mL经过活化的胶乳微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间3h；

5) 封闭：加入20nmol赖氨酸，室温轻微震荡30min，离心洗涤，超声重悬于0.15M pH7.0 PBS缓冲液中备用；

收集洗涤液，SA的浓度测定按照如下公式计算：C＝A₂₈₀／E (SA：E=3.4L/g)，计算偶联的SA含量。SA偶联量为0.8mg，偶联效率为40%。

实施例5

1) 活化：取0.1mL羧基化胶乳微球，加入0.9mL乙磺酸缓冲液（MES）混合。加入EDC和NHS活化，EDC浓度1.2g/L，EDC与NHS比例2:3，室温条件下温和搅拌15min；

3) 偶联反应：取2mg 链霉亲和素溶于pH7.6的PBS缓冲液中，加入到1mL经过活化的胶乳微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间4h；

收集洗涤液，SA的浓度测定按照如下公式计算：C＝A280／E (SA：E=3.4L/g)，计算偶联的SA含量。SA偶联量为1.1mg，偶联效率为55%；

实施例6

1) 活化：取0.1mL羧基化胶乳微球，加入0.9mL乙磺酸缓冲液（MES）混合。加入EDC和NHS活化，EDC浓度1.5g/L，EDC与NHS比例3:4，室温条件下温和搅拌15min；

3) 偶联反应：取2mg 链霉亲和素溶于pH7.8的PBS缓冲液中，加入到1mL经过活化的胶乳微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间4h；

收集洗涤液，SA的浓度测定按照如下公式计算：C＝A280／E (SA：E=3.4L/g)，计算偶联的SA含量。SA偶联量为1.0mg，偶联效率为50%。

颗粒型CCP抗原的制备

制备流程如图7所示，具体操作如下：

1) 洗涤胶乳微球：链霉亲和素标记微球用0.15M pH7.6 PBS缓冲液洗涤；

2) 微球与修饰的CCP结合：1mL10%自制的链霉亲和素化胶乳微球与1mg生物素标记CCP多肽，通过室温轻微震荡孵育30min；

3) 离心洗涤：12000g离心30min洗涤3次，超声重悬，制备颗粒型CCP抗原。

颗粒型CCP抗原的效果评价

通过检测不同效价的抗CCP抗体血清的吸光度值得变化关系，免疫比浊法检测过程如图8所示，具体操作为：

取不同效价的标准抗CCP抗体样品6μl，与200μl试剂R₁混合，25℃温育5min；

加入50μl试剂R₂，测定其在560nm下的浊度A₁；

37℃温育15min，测定其在560nm下的浊度A₂；

根据ΔA（A₂- A₁）值，计算抗体的效价；

其中，各试剂组成成分如下表：

组成成分	试剂R₁	试剂R₂
			缓冲液	pH8.0 PBS	pH8.0 PBS
颗粒型CCP抗原（纳米微球）	—	0.5%
			PEG6000	3.6%	—
Tween-20	0.1%	0.1%
			BSA	0.05%	0.05%
叠氮钠（NaN₃）	0.05%	0.05%

整个检测过程20min即可完成。

实施例7

取实施例1的生物素标记CCP多肽和实施例3的链霉亲和素标记微球，按上述反应制备得到颗粒型CCP抗原。使用该颗粒型CCP抗原（浓度为0.5%）用于检测抗体的效价，检测过程耗时20min。颗粒型CCP多肽抗原的检测效果如图9，以数据点拟合直线方程为y=0.0009x+0.0329(相关系数r=0.9729)，线性良好。

实施例8

取实施例2的生物素标记CCP多肽和实施例4的链霉亲和素标记微球，按上述反应制备得到颗粒型CCP抗原。使用该颗粒型CCP抗原（浓度为0.5%）用于检测抗体的效价，检测过程耗时20min。颗粒型CCP多肽抗原的检测效果如图10所示，以数据点拟合直线方程为y=0.001x+0.0667(相关系数r=0.9906)，线性良好。

Claims

1.一种抗体效价的检测方法，包括如下步骤：

1)将抗原偶联微球上，得到改性微球；

2)将改性微球与抗体溶液混合反应；

3)测定反应液的浊度，确定抗体效价。

2.一种抗CCP抗体效价的检测方法，包括如下步骤：

1)在CCP多肽上偶联特异性亲和小分子，在微球上偶联特异性亲和小分子的特异性靶标分子；

2)将修饰后的CCP多肽和微球混合，得到颗粒型CCP多肽抗原；

3)将颗粒型CCP多肽抗原与抗体溶液混合，反应；

4)测定反应体系的浊度，确定抗体效价。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：CCP多肽上偶联的特异性亲和小分子为生物素，微球上偶联的特异性靶标分子为链霉亲和素。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：在CCP多肽偶联生物素包括如下步骤：

1)将CCP多肽溶解于缓冲液中，酯化生物素用二甲基亚砜溶解，混合；

2)室温搅拌反应完全，去除未反应的生物素；

3)收集、纯化得到偶联生物素的CCP多肽。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：在CCP多肽偶联生物素包括如下步骤：

1)将CCP多肽溶解于pH9.0～9.6磷酸盐缓冲液中，4℃保存；将酯化生物素溶解2)二甲基亚砜；按生物素：CCP=10:1的摩尔比混合两种溶液；

3)室温搅拌4h，使用脱盐柱去除未反应的生物素；

4)用pH7.2～7.6的 PBS缓冲液洗脱，得到偶联生物素的CCP多肽。

6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于：在微球上偶联链霉亲和素包括如下步骤：

1)将羧基化胶乳微球与乙磺酸缓冲液混合，加入EDC和NHS活化，洗涤得到活化微球；

2)将链霉亲和素溶解于PBS缓冲液中，加入活化微球，室温反应，反应完全后洗涤；

3)用赖氨酸封闭，得到SA修饰微球。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：链霉亲和素溶解于pH6.8～7.8的PBS缓冲液中。

8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于：EDC和NHS的摩尔比为1：（1～2）。