CN104313083A - 一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多糖提取技术领域，具体涉及一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法。一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步骤：（1）原料预处理；（2）酶解；（3）非水溶性多糖转化；（4）离心分离；（5）可溶性多糖提取。采用酶作用条件温和，采用各种不同的酶将牡丹皮中的脂肪、纤维素酶解，将其中的多糖提取出来，提高了牡丹皮的利用率，采用本发明的方法得到丹皮多糖不仅得率高，而且纯度也高。
Description
技术领域
本发明属于多糖提取技术领域，具体涉及一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法。
背景技术
牡丹皮为毛莨科植物牡丹的根皮，载于《神农本草经》，具有清热凉血，活血化瘀的功效，用于治疗温毒发斑，痈肿疮疡，经闭痛经，跌扑损伤等症，据《中药大辞典》等文献报道，牡丹皮中有效成分有丹皮原甙、牡丹酚、芍药甙，羟基芍药甙、苯甲酰芍药甙、挥发油以及苯甲酸、植物甾醇、蔗糖、葡萄糖、***糖等。植物多糖在提高人体免疫力、降血糖、抗辐射等方面均有作用，有关优选超声波提取牡丹皮多糖条件工艺鲜见，同样，将微波用于提取牡丹皮多糖的报道也鲜见 ，结合酶法与微波法提取丹皮多糖的报道尚未出现。
CN103045372B披露了牡丹饼粕的综合利用方法，该方法中包括下述的步骤a. 牡丹饼粕用粉碎机粉碎至40 目，装萃取釜，所述的牡丹皮是牡丹籽仁初榨后剩下的残留粕渣；
b. 用食品级CO2，其纯度为99.99%，流量为12L/ 小时，设定萃取压力为20MPa、温
度为25℃，分离条件是：分离器Ⅰ压力10KPa、温度50℃，分离器Ⅱ压力4KPa、温度40℃，萃取时间0.5 小时；
c. 提取完毕，收集萃取物，得到牡丹籽油；
d. 取步骤c 中剩下的残渣脱水处理至其水分含量为20%，得牡丹饼粕；
步骤d 中得到的牡丹粕提取多糖，将粉碎的牡丹皮置入多功能提取罐中，加入原料10 倍量的水，在提取罐夹套内通入饱和水蒸汽，蒸汽压力为2—2.5kg，开启电机搅拌，待沸腾后，将蒸汽压力降到1.5—2kg，保持沸腾状态，并关闭搅拌电机，进行常压蒸馏；
收集馏出液，将溜出液通过管道流入粗结晶罐中，开启电机搅拌冷却，粗结晶罐夹
套中的循环盐水温度为-2—-5℃，直至馏出液中无白色浑浊液出现为止，此时收集的馏出
液重量约为饼粕量的5-10 倍；即可得到粗多糖，粗品经糖含量、蛋白含量测定后，加水重新
溶解，加0.5 倍体积的酒精摇匀，静置片刻后，6000r/min 离心15min，除去蛋白杂质；
上清液中再加入酒精，至乙醇体积分数约60%，摇匀后静置，待沉淀后，小心将上清
液倒出，沉淀中加入适量90% 酒精和无水乙醇2 次脱水，过滤后沉淀再用无水乙醇洗2 次，
摊于平皿上，50℃烘干，得到多糖精品。
上述的方法主要是以牡丹皮为原料，进一步超临界二氧化碳萃取，提取牡丹籽油，然后再对残渣脱水处理，以得到的牡丹皮为原料提取多糖，其提取方法为热水浸提。
本申请将微波法与复合酶法相结合，提取丹皮多糖。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种得率和纯度较高的生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法。
本发明生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法是通过下述的技术方案来实现的：
一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步骤：
（1）原料预处理
牡丹皮经烘干至其水分含量为2-4%，再粉碎至80-200目；
（2）酶解
将粉碎后的牡丹皮，加水混匀，牡丹皮与水的重量比例为1：6-12，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.3-0.5％，酶解温度45℃，调pH 5.5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1-0.5h；
再加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.4-0.6％、酶解温度40℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1-0.5h；
再加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为0.4-1.0%，酶解温度为45℃，pH值8.2，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1-0.5h；
再加入无花果蛋白酶，无花果蛋白酶的添加量为0.1-0.7%，酶解温度为50℃，pH值7.0，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h，酶解后在100℃下灭酶8min；
再加入无花果蛋白酶，无花果蛋白酶的添加量为0.5%，酶解温度为50℃，pH值7.0，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h，酶解后在100℃下灭酶8min；
（3）非水溶性多糖转化
淀粉酶的添加量为1.0-1.2％、酶解温度40℃、pH值5，酶解1.5-2.0h后，100-105℃灭酶5-10min；
（4）离心分离
将酶解后的牡丹皮，离心10-20 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
（5）可溶性多糖的提取
取步骤（5）中的上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在60-70℃下浓缩，浓缩至其浓度为60-70%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置10-20小时、离心10-20 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为4-6%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
优选的，脂肪酶的用量为0.4%。
优选的，纤维素酶的用量是0.5%。
优选的，淀粉酶的添加量为1.0%。
优选的，一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步骤：
（1）原料预处理
牡丹皮经烘干至其水分含量为3%，再粉碎至100目；
（2）酶解
将粉碎后的牡丹皮，加水混匀，牡丹皮与水的重量比例为1：8，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.4％，酶解温度45℃，调pH 5.5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h；
再加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.5％、酶解温度40℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h；
再加入酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶，酸性蛋白酶的添加量为0.8%，木瓜蛋白酶的添加量为0.5%，酶解温度为45℃，pH值5.0，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h；
再加入无花果蛋白酶，无花果蛋白酶的添加量为0.4%，酶解温度为50℃，pH值7.0，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h，酶解后在100℃下灭酶8min；
（3）非水溶性多糖转化
淀粉酶的添加量为1％、酶解温度40℃、pH值5，酶解1.8h后，100℃灭酶6min；
（4）离心分离
将酶解后的牡丹皮，离心15 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
（5）可溶性多糖的提取
取步骤（5）中的上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在65℃下浓缩，浓缩至其浓度为65%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置15小时、离心15 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为5%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
酶解脂肪、纤维顺序也是本发明的创新之处，由于将脂肪酶解以后，油脂不会包裹在牡丹皮外，从而有利于各种成分与酶相接触，从而提高酶解的效率；因此，先酶解脂肪再酶解纤维素有利于脂肪和纤维的去除；
普通方法中对脂肪的处理方法一般是采用加有机溶剂的方式，有机溶剂虽然对油脂的去除也较为彻底，但是其作用的条件较强烈，而且后续的回收过程也较复杂，另外还容易造成有机溶剂危害环境的问题；另外采用有机溶剂去除油脂其成本也较高；
本发明采用酶作用于残留在牡丹皮中的油脂上，作用条件温和，而且对油脂的去除也较为彻底，并且不存在后续的有机溶剂回收及带来环境污染的问题；
再加入纤维素酶将牡丹皮中的纤维素降解生成溶于水的葡萄糖；
将非可溶性的多糖酶解为可溶性多糖之后，糖类溶于水中，再取上清液，过滤，浓缩，醇沉，将其中的多糖提取出来。
本发明的酶的种类及用量的选择及酶解顺序的选择并不是偶然的，而是发明人付出了创造性的劳动得到了，酶及各种比例的调整均会影响最终多糖的提取效果，只有采用本发明所给的酶及酶的相应比例对牡丹皮进行处理，而且按照本发明的顺序进行，才能得到本发明的结果，将酶进行替换或者是加酶顺序替换，均得不到最大的多糖提取率。
因此，本发明中采用冷冻粉碎的方法对提取得到的多糖，保持了多糖的质量不受影响。
本发明的有益效果在于，采用酶作用条件温和，采用各种不同的酶将牡丹皮中的脂肪、纤维素酶解，同时从牡丹皮中提取多糖，最大限度的利用牡丹皮，而且采用本发明的方法得到的多糖，其得率和纯度高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
以下的检测方法，如无特殊说明，采用苯酚-硫酸法测多糖的含量。
实施例1
一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步骤：
（1）原料预处理
牡丹皮经烘干至其水分含量为3%，再粉碎至100目；
（2）酶解
将粉碎后的牡丹皮，加水混匀，牡丹皮与水的重量比例为1：8，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.4％，酶解温度45℃，调pH 5.5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h；
再加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.5％、酶解温度40℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h；
再加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为0.8%，酶解温度为45℃，pH值8.2，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.3h；
再加入无花果蛋白酶，无花果蛋白酶的添加量为0.4%，酶解温度为50℃，pH值7.0，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h，酶解后在100℃下灭酶8min；
（3）非水溶性多糖转化
淀粉酶的添加量为1％、酶解温度40℃、pH值5，酶解1.8h后，100℃灭酶6min；
（4）离心分离
将酶解后的牡丹皮，离心15 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
（5）可溶性多糖的提取
取步骤（4）中的上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在65℃下浓缩，浓缩至其浓度为65%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置15小时、离心15 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为5%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
采用苯酚-硫酸法测得所得的多糖中糖的含量为94.5%；
多糖的提取率为： 9.57%。
实施例2
一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步骤：
（1）原料预处理
牡丹皮经烘干至其水分含量为2%，再粉碎至80目；
（2）酶解
将粉碎后的牡丹皮，加水混匀，牡丹皮与水的重量比例为1：6，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.3％，酶解温度45℃，调pH 5.5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400W，频率为800MHZ，酶解0.1h；
再加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.4％、酶解温度40℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400W，频率为800MHZ，酶解0.2h；
再加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为0.4%，酶解温度为45℃，pH值8.2，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400W，频率为800MHZ，酶解0.1h；
再加入无花果蛋白酶，无花果蛋白酶的添加量为0.2%，酶解温度为50℃，pH值7.0，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h，酶解后在100℃下灭酶8min；
（3）非水溶性多糖转化
淀粉酶的添加量为0.8％、酶解温度40℃、pH值5，酶解1.8h后，100℃灭酶6min；
（4）离心分离
将酶解后的牡丹皮，离心15 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
（5）可溶性多糖的提取
取步骤（4）中的上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在65℃下浓缩，浓缩至其浓度为65%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置15小时、离心15 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为5%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
采用苯酚-硫酸法测得所得的多糖中糖的含量为94.5%；
多糖的提取率为： 9.29%。
实施例3
一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步骤：
（1）原料预处理
牡丹皮经烘干至其水分含量为4%，再粉碎至200目；
（2）酶解
将粉碎后的牡丹皮，加水混匀，牡丹皮与水的重量比例为1： 12，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.5％，酶解温度45℃，调pH 5.5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为600W，频率为800MHZ，酶解0.5h；
再加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.6％、酶解温度40℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为600W，频率为800MHZ，酶解0.5h；
再加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为1.0%，酶解温度为45℃，pH值8.2，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为600W，频率为800MHZ，酶解0.5h；
再加入无花果蛋白酶，无花果蛋白酶的添加量为0.7%，酶解温度为50℃，pH值7.0，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h，酶解后在100℃下灭酶8min；
（3）非水溶性多糖转化
淀粉酶的添加量为1.2％、酶解温度40℃、pH值5，酶解1.8h后，100℃灭酶6min；
（4）离心分离
将酶解后的牡丹皮，离心15 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
（5）可溶性多糖的提取
取步骤（4）中的上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在65℃下浓缩，浓缩至其浓度为65%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置15小时、离心15 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为5%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
采用苯酚-硫酸法测得所得的多糖中糖的含量为94.5%；
多糖的提取率为： 9.34%。
Claims (5)
1.一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，包括下述的步骤：
（1）原料预处理
牡丹皮经烘干至其水分含量为2-4%，再粉碎至80-200目；
（2）酶解
将粉碎后的牡丹皮，加水混匀，牡丹皮与水的重量比例为1：6-12，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.3-0.5％，酶解温度45℃，调pH 5.5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1-0.5h；
加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.6-1.2％、酶解温度40℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1-0.5h；
加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为0.4-1.0%，酶解温度为45℃，pH值8.2，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1-0.5h；
再加入无花果蛋白酶，无花果蛋白酶的添加量为0.1-0.7%，酶解温度为50℃，pH值7.0，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h，酶解后在100℃下灭酶8min；
（3）非水溶性多糖转化
淀粉酶的添加量为0.8-1.2％、酶解温度40℃、pH值5，酶解1.5-2.0h后，100-105℃灭酶5-10min；将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400-600W，频率为800MHZ，酶解0.1-0.5h，酶解后在100-105℃下灭酶5-10min；
（4）离心分离
将酶解后的牡丹皮，离心10-20 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
（5）可溶性多糖的提取
取步骤（5）中的上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在60-70℃下浓缩，浓缩至其浓度为60-70%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置10-20小时、离心10-20 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为4-6%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
2.如权利要求1所述一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，其特征在于，所述的脂肪酶的用量为0.4%。
3.如权利要求1所述的一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，其特征在于，所述的纤维素酶的用量是0.5%。
4.如权利要求1所述的一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，其特征在于，所述的淀粉酶的添加量为1.0%。
5.如权利要求1-4中任一项所述的一种生物酶法从牡丹皮中提取丹皮多糖的方法，其特征在于，所述的方法包括下述的步骤：
（1）原料预处理
牡丹皮经烘干至其水分含量为3%，再粉碎至100目；
（2）酶解
将粉碎后的牡丹皮，加水混匀，牡丹皮与水的重量比例为1：8，并加入脂肪酶，脂肪酶的添加量0.4％，酶解温度45℃，调pH 5.5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h；
再加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.5％、酶解温度40℃、pH值5，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h；
再加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为0.8%，酶解温度为45℃，pH值8.2，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.3h；
再加入无花果蛋白酶，无花果蛋白酶的添加量为0.4%，酶解温度为50℃，pH值7.0，将上述的原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为500W，频率为800MHZ，酶解0.2h，酶解后在100℃下灭酶8min；
（3）非水溶性多糖转化
淀粉酶的添加量为1％、酶解温度40℃、pH值5，酶解1.8h后，100℃灭酶6min；
（4）离心分离
将酶解后的牡丹皮，离心15 min ，离心转速为4500 rpm，将上清液与沉淀分别收集；
（5）可溶性多糖的提取
取步骤（5）中的上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在65℃下浓缩，浓缩至其浓度为65%，浓缩液按1：4比例加入95%乙醇沉淀静置15小时、离心15 min ，离心转速为4500 rpm，收集沉淀并用乙醇反复清洗2-3次，冷冻干燥至水分含量为5%后，再在-1-4℃下进行粉碎，得可溶性多糖；
上述的加酶量均为酶占超微粉碎后的牡丹皮的重量百分比。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150128 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |