CN116948932A - 一种以葡萄糖为底物从头合成咖啡酸菌株的构建与应用 - Google Patents
一种以葡萄糖为底物从头合成咖啡酸菌株的构建与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种以葡萄糖为底物从头合成咖啡酸菌株的构建与应用，属于生物化工领域。本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌以敲除了酪氨酸合成途径上的转录抑制子基因tyrR，并过表达了大肠杆菌来源的3‑脱氧‑D‑***庚酮糖酸‑7‑磷酸合成酶突变体aroGfbr和预苯酸脱水酶tyrAfbr的大肠杆菌为底盘细胞，同时过表达了来源于黄杆菌属的酪氨酸氨基裂解酶，来源于塔尔波嗜热菌的4‑羟苯乙酸酯‑3‑羟化酶氧化酶成分TtHpaB，及来源于嗜热菌的4‑羟苯乙酸酯‑3‑羟化酶还原酶成分TtHpaC。本发明获得的高产咖啡酸菌株，咖啡酸的积累达到14g/L，为目前报道的最高水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种以葡萄糖为底物从头合成咖啡酸菌株的构建与应用，属于生物化工领域。
背景技术
咖啡酸又称3,4-二羟基苯丙烯酸，属于羟基肉桂酸类化合物。咖啡酸具有天然抗氧化、抗肿瘤、抗炎和抗病毒等功效，广泛应用于生物医药及化妆品行业。咖啡酸也是一种天然杀菌剂，能够有效抑制真菌及细菌感染，其抑菌机制与其强抗氧化性有关。此外，咖啡酸能作为前体化合物，用于合成更高附加值的咖啡酸衍生物。
目前，咖啡酸的来源主要依靠天然植物提取和化学合成，然而植物中咖啡酸的含量较低，且提取效率有限；而化学合成成本较高，易造成环境污染等问题。近年来，随着合成生物学的快速发展，利用微生物细胞工厂合成动植物天然成分已成为研究热点，且研究人员已经成功实现了萜类、黄酮、生物碱、皂苷等多种天然产物的生物合成和转化。近30年来，芳香族类化合物的微生物合成已取得了一系列重要的研究进展，并且许多芳香族类化合物已经实现了工业化发酵生产，这为咖啡酸的工业化生产奠定了坚实的基础。
利用合成生物学的技术手段，在微生物细胞中实现咖啡酸的从头合成是目前主要的研究思路，咖啡酸生物合成代谢途径如图1。现今报道的咖啡酸合成工程菌株产量低、效率慢，为突破这一生产瓶颈，本发明构建了一株能以葡萄糖为底物，高效生产咖啡酸的大肠杆菌工程菌株，有助于解决当前咖啡酸生物合成产量低的问题，对扩大咖啡酸及其衍生物的应用场景具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种以葡萄糖为底物的生物合成咖啡酸的方法，该方法咖啡酸的产量和生产效率高，适于规模化工业生产。
本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌同时过表达了来源于约氏黄杆菌属的酪氨酸氨基裂解酶FjTAL，来源于塔尔波嗜热菌的4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶氧化酶成分TtHpaB，及来源于嗜热菌的4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶还原酶成分TtHpaC。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌同时过表达了氨基酸序列如SEQID NO.3所示的酪氨酸氨基裂解酶FjTAL、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶氧化酶TtHpaB和氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶还原酶TtHpaC。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以敲除了酪氨酸合成途径上的转录抑制子基因tyrR，并过表达了大肠杆菌来源的3-脱氧-D-***庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体aroGfbr和预苯酸脱水酶tyrAfbr的大肠杆菌为底盘细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli. BW25113。
在本发明的一种实施方式中，所述底盘细胞为，以BW25113菌株为出发菌株，先敲除了酪氨酸合成途径上的转录抑制子基因tyrR，获得菌株TYR1；再过表达了大肠杆菌来源的3-脱氧-D-***庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体aroGfbr和预苯酸脱水酶突变体tyrAfbr，以解除产物酪氨酸的反馈抑制效果，所述基因aroGfbr的核苷酸序列分别是SEQ ID NO.1，基因tyrAfbr的核苷酸序列分别是SEQ ID NO.2，得到了高产酪氨酸底盘菌株TYR2。并对TYR2菌株进了发酵试验，评估了其生产酪氨酸的能力。
在本发明的一种实施方式中，编码所述3-脱氧-D-***庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体aroGfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述预苯酸脱水酶tyrAfbr的核苷酸序如SEQ ID NO.2所示，所述转录抑制子基因tyrR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述酪氨酸氨基裂解酶FjTAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码所述4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶氧化酶TtHpaB的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，编码所述4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶还原酶TtHpaC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
在本发明的一种实施方式中，将上述编码TtHpaBC和FjTAL的基因通过同源重组无缝拼接技术克隆至表达载体pBAD， 构建获得的重组质粒pBAD-TthpaBC-Fjtal。将pBAD-TthpaBC-Fjtal重组质粒转化到TYR2菌株中，获得从头合成咖啡酸的菌株CA2。
在本发明的一种实施方式中，将上述编码TtHpaBC和FjTAL的基因通过同源重组无缝拼接技术克隆至表达载体pBAD，构建获得的重组质粒pBAD-TthpaBC-Fjtal；转化该重组质粒到BW25113原始菌株中，获得CA1菌株，在M9无机盐培养基中评价TtHpaBC和FjTAL的催化效率。M9培养基中含有：葡萄糖，NH4Cl，Na2HPO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4，CaCl2，VB1和微量元素。
本发明还提供了一种咖啡酸的制备方法，所述方法为，以上述重组大肠杆菌为催化剂，以葡萄糖为底物，全细胞转化制备得到咖啡酸。
在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖的添加量为：10～20g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌的添加量为：5％～10％。
在本发明的一种实施方式中，反应条件为：30～37℃，搅拌桨转速300～700rpm，发酵液pH6.5～7.4，通气量0.5～1.5vvm。
在本发明的一种实施方式中，CA2菌株在37℃下活化后再转接到ZYM培养基中，添加2g/L的L-***糖诱导，在30℃，200rpm下发酵至少72h。ZMY培养基中含有：胰蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，甘油，Na2HPO4，KH2PO4，NH4Cl，Na2SO4，MgSO4和微量元素。
在本发明的一种实施方式中，将CA2菌株在5L发酵罐上进行的补料分批发酵，评估其在工业上的产潜能，发酵培养基是无机盐培养基，包括：葡萄糖，KH2PO4，(NH4)2HPO4，MgSO47H2O，柠檬酸，微量元素，消泡剂和补料。
在本发明的一种实施方式中，本发明中咖啡酸及代谢中间产物由HPLC法检测，如图2是咖啡酸及中间产物的液相色谱峰图。
本发明还提供了一种提高大肠杆菌制备咖啡酸的产量的方法，所述方法为，以敲除了酪氨酸合成途径上的转录抑制子基因tyrR，并过表达了大肠杆菌来源的3-脱氧-D-***庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体aroGfbr和预苯酸脱水酶tyrAfbr的大肠杆菌为底盘细胞，同时过表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的酪氨酸氨基裂解酶FjTAL、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶氧化酶TtHpaB和氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶还原酶TtHpaC。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli.BW25113。
在本发明的一种实施方式中，编码所述3-脱氧-D-***庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体aroGfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述预苯酸脱水酶tyrAfbr的核苷酸序如SEQ ID NO.2所示，所述转录抑制子基因tyrR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述酪氨酸氨基裂解酶FjTAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码所述4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶氧化酶TtHpaB的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，编码所述4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶还原酶TtHpaC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提供了上述重组大肠杆菌在制备咖啡酸或含有咖啡酸的化学品中的应用。
有益效果
(1)本发明通过敲除酪氨酸合成途径上的转录抑制基因tyrR，过表达解除反馈抑制的tyrAfbr和aroGfbr基因，获得了高产酪氨酸的底盘菌株；
(2)本发明在大肠杆菌中异源表达约氏黄杆菌的酪氨酸解氨酶FjTAL和筛选获得的嗜热菌来源的TtHpaBC，实现更高产量的咖啡酸的合成；
(3)本发明获得的高产咖啡酸菌株CA2在摇瓶中发酵咖啡酸的产量可达到1.25 g/L，在5L发酵罐中进行补料分批发酵，发酵83h，咖啡酸的积累达到14g/L，为目前报道的最高水平。
附图说明
图1：咖啡酸生物合成代谢流程图。
图2：咖啡酸及其中间产物的色谱图；其中，A为标准品(依次为酪氨酸、左旋多巴、对香豆酸和咖啡酸)液相色谱图；B为发酵样品中咖啡酸液相色谱图。
图3：TYR2菌株的酪氨酸产量评价。
图4：CA1菌株催化酪氨酸合成咖啡酸产量评价。
图5：CA2菌株摇瓶中从头合成咖啡酸产量评价。
图6：CA2菌株发酵罐上从头合成咖啡酸产量评价。
图7：TtHpaBC与EcHpaBC产多巴与咖啡酸比较。
具体实施方式
下述实施例中用到的主要试剂、仪器、遗传材料和培养基：咖啡酸标准品(源叶生物)，过表达的aroGfbr和tyrAfbr是以大肠杆菌BW25113菌株基因组为模版扩增获得，序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，Fjtal、TthpaB和TthpaC基因针对E.coli-K12菌株密码子优化后由擎科生物公司合成。
下述实施例中所涉及的pTargetF、大肠杆菌BW25113、pBAD/HisA质粒购自赛默飞世尔科技有限公司。
下述实施例中培养基如下：
种子培养基(LB)(1L)：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g。
M9培养基(1L)：葡萄糖10g，NH4Cl 1g，Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g，NaCl 0.5g，MgSO4240mg，CaCl2 5.35mg，VB1 2mg，微量元素(H3BO3 1.25mg，
摇瓶发酵培养基(ZYM)(1L)：胰蛋白胨10g，酵母粉2g，葡萄糖0.5g，甘油5mL，Na2HPO43.55g，KH2PO43.4g，NH4Cl2.68g，Na2SO40.71g；MgSO4240mg,微量元素(1mM FeCl3，0.4mM CaCl2，0.2mM MnCl2，0.2mM ZnSO4，CoCl2、NiCl2、Na2MoO4、Na2SeO3和H3BO3各0.04mM)。
发酵罐发酵培养基(无机盐)(1L)：葡萄糖5.0g，KH2PO46.65g，(NH4)2HPO42.0g，柠檬酸0.85g，微量元素(/> (NH4)6Mo7O241mg)，消泡剂，补料(0.5g/mL的葡萄糖溶液)。
下述实施例中所涉及的菌株信息如下表1所示：
表1：本发明中涉及的菌株、基因
下述实施例中所涉及的引物序列如表2～表3所示：
表2：实施案例1中用到的引物
表3：实施案例2中用到的引物
下述实施例中所涉及的咖啡酸、酪氨酸、左旋多巴、对香豆酸检测方法如下：
1、样品准备：将发酵液样品12000rpm离心1min，取上清，以5％甲醇和85％ddH2O稀释10倍后，使用0.22μm滤膜过滤。
2、液相条件：色谱柱：InfinityLab Poroshell HPH-C18,4.6×150mm,2.7-Micron；流动相A：ddH2O(0.1％乙酸)，流动相B：甲醇。洗脱程序：0～4min，5％B；4～14min，5～85％B；14～16min，85～5％B；16～20min，5％B。流速：1.0mL/min，柱温：30℃，进样体积：10μL。检测器：二极管阵列检测器，检测波长：323nm(咖啡酸)，274nm(酪氨酸)，280nm(左旋多巴)，308nm(对香豆酸)。通过与标准品的保留时间和光谱图进行比对，确定目标物质，并根据峰面积对所测物质进行定量分析。
实施例1：底盘细胞即高产酪氨酸菌株TYR2的构建与产量评价
具体步骤如下：
(1)以大肠杆菌BW25113菌株的基因组为模板，用引物tyrR-up-F和tyrR-up-R以及tyrR-down-F和tyrR-down-F，分别扩增得到tyrR基因上游和下游500bp的DNA片段，再利用重叠PCR将两个片段连接起来用作基因编辑的Donor DNA。
(2)以pTargetF原始质粒为模板，用引物pTargetF-tyrR-N20-F和pTargetF-tyrR-N20-R经反向PCR扩增得到pTargetF-tyrR质粒。用电转化法，将得到的DonorDNA和pTargetF-tyrR质粒共转化到表达Cas9蛋白的大肠杆菌BW25113感受态菌株中。用引物tyrR-JD-F和tyrR-JD-R对获得的单菌落PCR鉴定，根据PCR结果并结合测序比对分析，得到了敲除tyrR基因的菌株：BW25113ΔtyrR，命名为TYR1。
(3)为了在基因组aldA位点(NCBI编号为：945672)上***点突变的tyrAfbr(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和aroGfbr(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)基因簇，需要先获得能表达tyrAfbr和aroGfbr基因簇的Donor DNA片段。本研究先连接构建原始的tyrA和aroG基因簇，再对其中位点进行点突变，得到点突变的tyrAfbr和aroGfbr基因簇。具体操作如下：
1)以pBAD质粒为模板，参照同源重组质粒构建的方法，利用引物pBAD-ZT-F和pBAD-ZT-R扩增pBAD载体，将其线性化，再以BW25113菌体为模板利用引物araBADrbs-tyrA-F和tyrA-araBADrbs-R去扩增tyrA基因片端，得到1122bp的核酸序列，利用引物araBADrbs-aroG-F和aroG-pBAD-R去扩增得到aroG基因片段，得到1053bp的核酸序列，再利用同源重组酶将上述载体与片段连接得到了pBAD-AG质粒。
2)接着利用单点突变引物tyrA-Mu1-F、tyrA-Mu1-R、tyrA-Mu2-F、tyrA-Mu2-R、aroG-Mu-F、aroG-Mu-R将pBAD-AG质粒线性化，对tyrA上的M53I和A354V位点以及aroG上的D146N位点进行点突变，扩增出长度分别为919bp、538bp和4408bp的核酸片段，再利用同源重组技术将得到的片段连接，获得了tyrA和aroG点突变完成的重组质粒pBAD-MuAG。测序成功之后，利用引物tyrA-F和aroG-R以pBAD-MuAG质粒为模板进行PCR扩增，得到了成功点突变的tyrAfbr和aroGfbr串联的片段。
再得到DNA片段与PCR扩增得到的上下游同源区，PJ23119启动子片段，利用重叠PCR将短片段连接，得到Donor DNA。
3)以原始pTargetF质粒为模板，利用引物pTargetF-aldA-N20-F和pTargetF-aldA-N20-R进行反向PCR扩增得到pTargetF质粒。将Donor DNA片段与pTargetF质粒共转化到表达Cas9蛋白的TYR1菌株中，对得到的单菌落PCR鉴定，获得了在基因组aldA位点上***点突变的tyrAfbr和aroGfbr基因簇的菌株BW25113ΔtyrR-tyrAfbr-aroGfbr，命名为TYR2。
(4)酪氨酸的制备
将TYR2菌株按1％接种量接种到ZYM培养基中，在30℃，200rpm条件下进行培养，每隔12h取样。利用HPLC检测方法，测定酪氨酸的生成情况。
结果显示，在摇瓶中发酵72h后，酪氨酸的累积量逐渐增加，达到了3.3g/L(图3)，且未检测出其他芳香族氨基酸。
说明TYR2菌株作为底盘细胞，能为咖啡酸的合成提供充足的前体物质酪氨酸，因此该底盘细胞能满足后续研究的要求。
实施例2：重组质粒pBAD-TthpaBC-Fjtal及重组菌株CA1、CA2的获得
具体步骤如下：
(1)利用引物pBAD-ZT-F和pBAD-TthpaB-R以pBAD质粒为模板，PCR扩增获得线性化的pBAD载体，分别以引物TthpaB-T7rbs-F和TthpaB-R，TthpaC-F和TthpaC-R，Fjtal-F和Fjtal-ZT-R扩增获得了TthpaB，TthpaC和Fjtal序列片段(编码所述酪氨酸氨基裂解酶FjTAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码所述4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶氧化酶TtHpaB的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码所述4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶还原酶TtHpaC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，再将得到的片段与上述获得的pBAD线性化载体用同源重组酶连接，转化克隆宿主后，经菌落PCR鉴定和测序，获得重组质粒pBAD-TthpaBC-Fjtal。
(2)将构建获得的pBAD-TthpaBC-Fjtal质粒转化到BW25113野生型大肠杆菌中，获得了菌株：BW25113/pBAD-TthpaBC-Fjtal，命名为CA1。
(3)将构建获得的pBAD-TthpaBC-Fjtal转化到酪氨酸合成菌株TYR2中，得到了菌株菌株：BW25113ΔtyrR-tyrAfbr-aroGfbr/pBAD-TthpaBC-Fjtal，命名为CA2。
实施例3：TAL与HpaBC催化酪氨酸产咖啡酸转化效率评价
具体步骤如下：
(1)将实施例2制备得到的重组菌CA1转接至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8h，制备得到种子液。
(2)以1％(v/v)的接种量，将制备得到的种子液转接至含有100mL LB液体培养基的试管中，并添加终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素，37℃、200rpm培养大约2h至OD600约0.5，随后添加终浓度为2g/L的L-***糖作为诱导剂，将三角瓶转移至30℃、200rpm下继续培养24h后，得到发酵液；
将发酵液在5000rpm、4℃条件下离心5min后收集菌体，将菌体重悬于M9培养基(含有50mM pH 7.0磷酸钠盐缓冲液)中，最终菌体OD600为10，得到全细胞催化剂。
(3)将制备得到的全细胞催化剂添加至含有终浓度为1.8g/L的酪氨酸的反应体系中，在30℃、200rpm恒温摇床上进行反应。每12h取样，测定咖啡酸的生成情况，结果如图4所示。
结果显示，在M9培养基中咖啡酸的生成不断提高，积累少量对香豆酸，无副产物的积累，72h时咖啡酸的含量达到1.67g/L，转化效率高达92.8％。
实施例4：咖啡酸的从头合成产量
具体步骤如下：
(1)将实施例2制备得到的重组菌CA2菌株接种在ZYM培养基中，在37℃条件下培养8h，制备得到种子液；
(2)将制备得到的种子液按1％(v/v)接种量接种至ZYM培养基中，在30℃，200rpm条件下摇瓶发酵，添加2g/L的L-***糖作诱导剂，每隔12h取样；HPLC检测咖啡酸及对香豆酸的生成情况。
结果表明在发酵期间，CA2的发酵液中咖啡酸累积量逐渐提高，72h咖啡酸累积量达到1.25g/L，中间产物对香豆酸的积累维持在较低水平(图5)。
实施例5：CA2菌株从头合成咖啡酸的补料分批发酵验证
鉴于在实施例4的摇瓶实验中，从头合成咖啡酸得到了较好的实验结果，在本实施案例中评估咖啡酸的生产放大潜力，使用CA2菌株在5L的发酵罐中进行补料分批发酵，具体如下：
(1)将实施例2制备得到的重组菌CA2菌株接种在LB培养基中，在37℃，200rpm条件下培养8h，制备得到一级种子液；
再将一级种子液按1％(v/v)的接种量，接种在250mL的LB培养基中，在37℃，200rpm条件下培养8h，获得二级种子液；
(2)将制备得到的二级种子液按10％(v/v)的接种量，接种到含有无机盐发酵培养基的5L发酵罐中，发酵开始前，将发酵温度控制在37℃，发酵起始转速设定为400rpm，起始pH调至为6.8，溶氧设定为100％，使得发酵过程中的溶氧在30％左右波动。菌株生长阶段，菌体密度逐渐升高，对氧的需求逐渐提高，因此需要逐渐提高搅拌转速。发酵6h后，发酵罐内的葡萄糖耗尽，罐内溶氧急剧上升时，开始流加葡萄糖，并用氨水控制罐内的pH维持在7.0左右。初始的补糖速度可以控制在1g/L/h，使得溶氧在30％左右波动，随着菌体的生长，按每0.5～1h的频率，逐渐提高补糖速度和搅拌桨转速，直到葡萄糖的流加速度最高达到4g/L/h，搅拌转速不高于750rpm。取样测定发酵液的菌体密度，当OD600达到30时(约20h)，将发酵温度降低至30℃，由于此时菌株的活力有所下降，适当的降低补糖速度和搅拌转速，向发酵罐中添加终浓度2g/L的L-***糖，诱导蛋白质的表达。间隔一定的时间，取样，用HPLC测定咖啡酸及中间产物的含量。
结果显示，诱导6h后取样检测到0.43g/L咖啡酸。随发酵时间的延长，咖啡酸的积累量不断增加。发酵83h时，咖啡酸的累积达到14.0g/L，酪氨酸和对香豆酸的积累水平较低(图6)。
实施例6：从头合成咖啡酸的发酵
具体实施方式同实施例1～5，区别在于，调整实施例2中的4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶氧化酶TtHpaB、4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶还原酶TtHpaC为：来源于大肠杆菌的EcHpaBC(NCBI编号为：Z29081.2)；制备得到重组菌株BW25113ΔtyrR-tyrAfbr-aroGfbr/pBAD-EchpaBC-Fjtal；
将上述重组菌株按照实施例5的方法制备咖啡酸，结果显示：在利用大肠杆菌内源的EcHpaBC蛋白时，酪氨酸被催化生成了大量的L-Dopa，L-Dopa转化为咖啡酸的效率低，并且L-Dopa容易在EcHpaBC酶的催化下生成多巴醌，进而形成黑色素，造成物质和能量的流失；而使用本发明的TtHpaBC后，多巴的累积量很低，几乎可以忽略不计，咖啡酸的积累量提高了93％(图7)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时过表达了氨基酸序列如SEQID NO.3所示的酪氨酸氨基裂解酶FjTAL、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶氧化酶TtHpaB和氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶还原酶TtHpaC。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以敲除了酪氨酸合成途径上的转录抑制子基因tyrR，并过表达了大肠杆菌来源的3-脱氧-D-***庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体aroGfbr和预苯酸脱水酶tyrAfbr的大肠杆菌为底盘细胞。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli.BW25113。
4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述3-脱氧-D-***庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体aroGfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述预苯酸脱水酶tyrAfbr的核苷酸序如SEQ ID NO.2所示，所述转录抑制子基因tyrR的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述酪氨酸氨基裂解酶FjTAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码所述4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶氧化酶TtHpaB的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码所述4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶还原酶TtHpaC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
6.一种咖啡酸的制备方法，其特征在于，所述方法为，向含有底物葡萄糖的反应体系中添加权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌，反应制备得到咖啡酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖的添加量为：10～20g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌在反应体系中的添加量为：5％～10％。
9.一种提高大肠杆菌制备咖啡酸的产量的方法，其特征在于，所述方法为，以敲除了酪氨酸合成途径上的转录抑制子基因tyrR，并过表达了大肠杆菌来源的3-脱氧-D-***庚酮糖酸-7-磷酸合成酶突变体aroGfbr和预苯酸脱水酶tyrAfbr的大肠杆菌为底盘细胞，同时过表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的酪氨酸氨基裂解酶FjTAL、氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示的4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶氧化酶TtHpaB和氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的4-羟苯乙酸酯-3-羟化酶还原酶TtHpaC。
10.权利要求1～5任一项所述的重组大肠杆菌在制备咖啡酸或含有咖啡酸的化学品中的应用。
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2023
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