CN104292233A

CN104292233A - 一种吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物及其抗肿瘤用途

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Publication number: CN104292233A
Application number: CN201410532741.4A
Authority: CN
Inventors: 洪学传; 王洪波; 朱曦; 丁明敏; 吕光耀; 张剑桥; 闻萌; 瞿春容; 朱进妹; 胡先明
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan Lv Hai palm fibre bio tech ltd
Priority date: 2014-10-09
Filing date: 2014-10-09
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2034-10-09
Also published as: CN104292233B; US9499552B2; US20160102095A1

Abstract

本发明涉及一种具有通式1的吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物及其药学上可用盐。本发明还涉及式1化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

Description

一种吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物及其抗肿瘤用途

技术领域

本发明属于有机合成领域，涉及一种抗肿瘤药物吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物及其用途。

背景技术

随着人类寿命的延长，癌症跃升为近年的主要死亡原因。《2012中国肿瘤登记年报》显示，中国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡的人数约250万。全国恶性肿瘤发病第一位的是肺癌，其次为胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌。癌症已成为我国人口死亡的首要原因

关于癌症的治疗，科学家们展开了大量的研究工作。新的抗癌药品不断发现。目前已有20余种肿瘤的治愈率达到30％以上。而药物作用机理的亚细胞水平及分子水平的研究，大大开拓了抗癌药物在应用方面的研究。细胞动力学、药物作用动力学及免疫学方面研究的快速发展，也使得药物的筛选、剂量的调整、给药途径的确定日趋完善。现已联合用药、大剂量间歇用药、辅助化疗以及配合中药的治疗，使恶性肿瘤治疗取得很好的疗效。当今，对恶性肿瘤治疗以手术、放射治疗、化学药物治疗、中医中药的治疗及免疫治疗等手段为主。对抗癌药物的选择、毒性作用及抗药性等方面起着影响其疗效，因为抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也对正常组织的细胞有杀伤，尤其是增殖旺盛的骨髓造血细胞及胃肠道细胞，这样一来限制抗癌药的剂量，并且使患者免疫功能降低，甚至患者难以忍受胃肠反应，而被迫中断治疗，使治疗失败。抗癌药物能杀伤癌细胞，但由于其细胞毒性，所以要找到一种既能治疗癌症同时又不对人体造成伤害或者伤害较小的药物一直是科学家们奋斗的目标。最近，作为瞬时受体电位通道亚族组成之一的TRPC6蛋白与胞内钙浓度的改变、肿瘤的发生发展、肿瘤细胞周期改变的相关研究有了新的进展，有望成为肿瘤治疗新的靶点。

瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)是普遍存在于细胞膜上的一种非选择性的阳离子通道蛋白家族，具有介导感觉传导、参与细胞信号转导及调节发育等重要作用，是目前离子通道领域研究的热点之一。TRP通道蛋白是一个庞大的家族，广泛表达于多种生物、组织及细胞中。仅就哺乳动物TRP通道而言，这个家族就包括7个相互关联的亚家族：TRPC、TRPV、TRPM、TRPN、TRPA、TRPP和TRPML，其中每一个亚家族又包括众多家族成员。TRP离子通道以往的研究工作多局限于神经***，近年研究发现，TRP通道不仅在机体中参与细胞信号转导、介导伤害性感受等方面发挥着重要的功能，而且在肿瘤的发生、发展中也起着重要的作用。该家族对细胞起着稳定和调控作用，其表达升高有利于恶性肿瘤的生长。

TRPC即传统型TRP通道，它是第一个被研究分离出的TRP通道蛋白。TRPC共7个亚型，TRPC(1～7)，其中TRPC3和TRPC6在结构和功能上非常接近，氨基酸一致程度高达70％-80％，在药理学性质和信号调节功能方面也比较相似，在TRPC亚家族中比较有代表性，也是目前国际研究中很受关注的2个亚型。而TRPC6被认为是选择性最强的通道蛋白。人TRPC6定位于染色体11q212q22,共132287个碱基(基因库：NC000011)，含13个外显子。TRPC6的转录产物mRNA含4564个碱基，其中第1－427位为5’未翻译区，第428-3223位为编码区，第3224-4564位为3’未翻译区(基因库：NM004621)。TRPC6可特异性的被磷脂酶C(PLC)激活，通过G-蛋白偶联受体(GPCR)介导的信号传导通路使配体与膜受体结合，激活磷脂酶C生成1,4,5-三磷酸肌醇，后者与受体结合促使内质网释放Ca²⁺.TRPC6是一种非选择性的阳离子通，钙离子可以通过，在多组织中都有表达。它能直接被第二信使甘油二酯酶激活，通过特定的酪氨酸/丝氨酸磷酸化调节改变胞内钙流。细胞内游离Ca²⁺升高，激活一些蛋白磷酸酶，使底物蛋白磷酸化，将外界信号级联放大，进入核内，影响DNA复制，导致细胞恶变及肿瘤细胞的增殖分化。细胞内Ca²⁺直接参与调控肿瘤的生长，侵袭，转移和分化。所以，TRPC6抑制剂有望成为治疗癌症的新药物。但是关于TRPC6抑制剂的报道甚少。

近年来，关于TRPC6与人类肿瘤的关系，科学家们进行了一系列的研究。结果证明，TRPC6与发病率较高的胃癌，肝癌，食管癌等都有着重要的联系。David G.W.在2013年报道了TRPC3和TRPC6的抑制剂，他们合成的化合物对hTRPC3和hTRPC6的IC₅₀值可以达到纳摩尔级别，但是在进行动物实验的时候，发现该系列药物口服利用度低，体内清除率过高，虽然经过一系列的结构改造，但是仍然无法找到一个平衡点，使活性和口服利用率均处于较好的水平。

经过大量的筛选，我们发现，化合物1具有优异的TRPC6抑制作用，是潜在的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明旨在提供一种吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物。本发明还提供上述化合物的细胞水平及靶点水平的活性筛选结果及其抗肿瘤应用。

本发明涉及的一种吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物，具有通式1所示的结构：

其中：

R₁为氢、烷基羰基、烷氧基羰基、烷基硫代羰基；

R₂为氢、烷基、卤代烷基；

R₃为氢、卤素、三氟甲基；

所述的烷基为C₁-C₆直链、支链或环状烷基，如甲基，乙基，正丙基，异丙基、正丁基，环己基等；

所述的卤代烷基为1-5个卤原子取代的卤代烷基，如一氯甲基，三氟乙基等；

所述的烷氧羰基为C₁-C₆烷氧基羰基，如甲氧羰基，乙氧羰基，叔丁氧羰基等；

所述的烷基羰基为C₁-C₆烷基羰基，如甲酰基，乙酰基，丙酰基，异丁酰基等；

所述的卤素为氟，氯，溴。

本发明提供式1所示化合物或其药学上可接受的盐。

本发明中所采用的述语“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益/风险比例，通常是水或油的或可分散的，并可有效的用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可用的并与式1化合物的化学性质相容的。

本发明还提供式1所示的吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的制备方法。

1)当R₂＝H时，按如下路线制备：

(1)向化合物2中滴加5M NaOH，在30-60摄氏度条件下搅拌12-48小时，然后向溶液中滴加1M-3M HCl至pH3，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色油状液体4。

(2)将化合物4,N,N'-羰基二咪唑溶于四氢呋喃，室温搅拌3-5小时；将化合物丙二酸单乙酯钾盐，无水氯化镁和4-二甲氨基吡啶溶于乙腈和四氢呋喃，室温搅拌4-8小时；上述两种混合液反应好后，降低到0摄氏度，将上述第一种溶液与三乙胺同时加到上述第二种溶液中，室温搅拌过夜。反应完成后，旋干溶剂，用水稀释，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，得黄色油状液体5。

(3)中间体6的制备：将化合物61，62溶于少量二氯甲烷后在100℃下回流反应8－24小时，冷却到室温后，再将此反应液加入到溶于50％EtOH的盐酸肼溶液中，80℃回流过夜，反应结束后冷却至室温，用饱和NaHCO₃碱化，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，用石油醚和乙酸乙酯重结晶得白色至浅黄色固体6。

(4)将化合物5与化合物6溶于无水乙醇，再加入三氟乙酸，80摄氏度加热，反应8-24小时后停止加热。冷却到室温后旋干溶剂。用水稀释，1M NaOH调pH8，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，分离得到化合物7。

(5)将化合物7溶于二氯甲烷，0摄氏度条件下加入三氟乙酸，在该温度下反应2－5小时，旋干溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液调pH10，过滤，滤渣用水洗，少量乙酸乙酯洗，真空干燥箱干燥，得白色固体8。

(6)将化合物8与相应的酸或酰氯或者烷基卤代烃，1-羟基苯并***，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐溶于DMF，室温搅拌，加入二异丙基乙基胺，反应12小时后，用乙酸乙酯溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，得白色固体为1。

2)当R₂≠H时，按如下路线制备：

(1)将圆底烧瓶无水无氧，在氮气氛围下加入二异丙基胺，四氢呋喃，0摄氏度搅拌，在该温度下慢慢滴加1.6M正丁基锂，滴加完毕后，0℃搅拌15-30分钟，然后置于-78摄氏度环境下，将溶于四氢呋喃的化合物2慢慢滴加到上述溶液中，搅拌1h后，将溶于四氢呋喃的碘甲烷滴加到上述溶液中，让其缓慢升至室温。反应完毕后，用饱和氯化铵溶液淬灭，旋干溶剂，用水稀释，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得棕色油状液体3。

(2)向化合物3中滴加5M NaOH，在30-60摄氏度条件下搅拌12-48小时，然后向溶液中滴加1M-3M HCl至pH3，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色油状液体4。

(3)将化合物4,N,N'-羰基二咪唑溶于四氢呋喃，室温搅拌3-5小时；将化合物丙二酸单乙酯钾盐，无水氯化镁和4-二甲氨基吡啶溶于乙腈和四氢呋喃，室温搅拌4-8小时；上述两种混合液反应好后，降低到0摄氏度，将上述第一种溶液与三乙胺同时加到上述第二种溶液中，室温搅拌过夜。反应完成后，旋干溶剂，用水稀释，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，得黄色油状液体5。

(4)中间体6的制备：将化合物61，62溶于少量二氯甲烷后在100℃下回流反应8－24小时，冷却到室温后，再将此反应液加入到溶于50％EtOH的盐酸肼溶液中，80℃回流过夜，反应结束后冷却至室温，用饱和NaHCO₃碱化，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，用石油醚和乙酸乙酯重结晶得白色至浅黄色固体6。

(5)将化合物5与化合物6溶于无水乙醇，再加入三氟乙酸，80摄氏度加热，反应8-24小时后停止加热。冷却到室温后旋干溶剂。用水稀释，1M NaOH调pH8，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，分离得到化合物7

(6)将化合物7溶于二氯甲烷，0摄氏度条件下加入三氟乙酸，在该温度下反应2－5小时，旋干溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液调pH10，过滤，滤渣用水洗，少量乙酸乙酯洗，真空干燥箱干燥，得白色固体8。

(7)将化合物8与相应的酸或酰氯或者烷基卤代烃，1-羟基苯并***，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐溶于DMF，室温搅拌，加入二异丙基乙基胺，反应12小时后，用乙酸乙酯溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过硅胶柱，得白色固体1。

本发明中，特别优选的部分化合物对应的结构如下：

附图说明

图1本发明的部分化合物激活TRPC6离子通道的细胞荧光膜电位实验结果。

图2本发明的部分化合物激活TRPC6离子通道的全细胞膜片钳检测结果。

图3本发明的部分化合物阻断TRPC6离子通道的细胞试验结果。

具体实施方式

通过下述实施例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容。

实施例1：R₁＝-COCHPh₂，R₂＝H，R₃＝F。

(1)向化合物2(24.33g，0.1mol)中滴加5M NaOH(60mL，0.3mol)，在50摄氏度条件下搅拌24小时，然后向溶液中滴加3M HCl到pH3，用乙酸乙酯(3*200mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色油状液体4(19.72g，96％)

(2)将化合物4(14.56g，63.5mmol),N,N'-羰基二咪唑(24.00g，86mmol)溶于四氢呋喃(100mL)，室温搅拌4小时；将化合物丙二酸单乙酯钾盐(28.10g，165mmol)，无水氯化镁(18.15g，191mmol)和4-二甲氨基吡啶(800mg，6.35mmol)溶于乙腈(100mL)和四氢呋喃(200mL)，室温搅拌6小时；上述两种混合液反应好后，均降低到0摄氏度，将上述第一种溶液与三乙胺(52mL，254mmol)同时加到上述第二种溶液中，室温搅拌过夜。反应完成后，旋干溶剂，用水(200mL)稀释，乙酸乙酯(3*200mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，得黄色油状液体5(18.06g，95％)。

(3)中间体6的制备：将化合物61(21.6mL)，62(21.9mL)溶于二氯甲烷(10mL)后在100℃下回流反应24小时，冷却到室温后，再将此反应液加入到溶于50％EtOH(50mL)的盐酸肼溶液中，80℃回流过夜，反应结束后冷却至室温，用饱和NaHCO₃碱化，乙酸乙酯(3*100mL)萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，用石油醚和乙酸乙酯重结晶得白色固体6(21.2g,78％)

(4)将化合物5(15g，45mmol)与化合物6(9.45g，49.5mmol)溶于无水乙醇(400mL)，再加入三氟乙酸(20mL)，80摄氏度加热，反应12小时后停止加热。冷却到室温后旋干溶剂。用水(100mL)稀释，1M NaOH调pH8，乙酸乙酯(3*200mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用甲醇：二氯甲烷＝1：20过硅胶柱，分离得到化合物7(13.82g，72％)

(5)将化合物7(6.18g，15mmol)溶于二氯甲烷(100mL)，0摄氏度条件下加入三氟乙酸(35mL)，在该温度下反应2小时，旋干溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液调pH10，过滤，滤渣用水洗，少量乙酸乙酯洗，真空干燥箱干燥，得到白色固体8(4.50g，92％)

(6)将化合物8(3.27g，10mmol)，二苯基乙酸(2.55g)，1-羟基苯并***(4.1g，30mmol)，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(11.4g，30mmol)溶于DMF(50mL)，室温搅拌，加入二异丙基乙基胺(15.6mL，90mmol)，反应12小时后，用乙酸乙酯(300mL)稀释，水(4*200mL)洗，饱和食盐水(100mL)洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用二氯甲烷：甲醇＝30：1过硅胶柱，得白色固体为M114(2.97g，57％)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ＝7.34-7.28(q,4H),7.25-7.22(t,J＝14,5Hz,5H),7.18-7.08(m,5H),5.47-5.45(d,J＝7.6Hz,1H),4.72-4.69(d,J＝13.2Hz,1H),4.18-4.15(d,J＝13.2Hz,1H),3.28-3.27(t,J＝3.2Hz,1H),3.00-2.94(t,J＝25Hz,1H),2.83-2.77(t,J＝24Hz,1H),2.66-2.60(t,J＝24Hz,1H),1.95-1.92(d,J＝12.4Hz,1H),1.72-1.69(d,J＝12.4Hz,1H),1.55-1.47(m,1H),1.15-1.06(m,1H).¹³C NMR(101MHz,CD₃OD)δ＝172.5,141.2,140.9,131.8,131.8,130.3,129.7,129.4,128.2,127.9,115.9,115.7,55.7,47.7,44.7,44.0,32.7,32.5,14.0.实施例2：R₁＝-COOCH₂Ph，R₂＝-CH₃，R₃＝Cl，步骤同实施例1，所不同的是R3由F变为Cl。所得白色固体为M121(收率69％。¹H NMR(400MHz,(CD₃)₂SO)δ＝7.94-7.90(m,2H),7.39-7.31(m,7H),5.44(s,1H),5.10(s,2H),4.13-4.10(d,J＝13.0Hz,2H),2.91(s,2H),2.63-2.56(m,1H),2.47(s,3H),1.85-1.82(d,J＝11.6Hz,2H),1.67-1.60(m,2H).¹³CNMR(101MHz,(CD₃)₂SO)δ＝165.5,158.4,154.5,149.2,147.5,137.1,134.4,128.4,128.2,127.8,127.8,127.7,127.5,101.5,90.5,66.1,43.9,43.4,31.2,15.3.

实施例3：R₁＝-COOEt，R₂＝-CH₃，R₃＝-F

(1)500mL圆底烧瓶，无水无氧，在氮气氛围下加入二异丙基胺(16.8mL，120mmol)，溶于四氢呋喃(150mL)，0摄氏度搅拌，在该温度下慢慢滴加1.6M正丁基锂(75mL，120mmol)，滴加完毕后，0℃搅拌15分钟，然后置于-78摄氏度环境下，将溶于四氢呋喃(60mL)的化合物2(24.3g)慢慢滴加到上述溶液中，搅拌1h后，将溶于四氢呋喃(60mL)的碘甲烷(9.38mL，150mmol)滴加到上述溶液中，让其缓慢升至室温。反应完毕后，用饱和氯化铵溶液淬灭，旋干溶剂，用水(250mL)稀释，乙酸乙酯(3*250mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得棕色油状液体3(24.18g，94％)。

(2)向化合物3(20.58g，80mol)中滴加5M NaOH(80mL，0.4mol)，在60℃条件下搅拌24小时后，向溶液中滴加3M HCl到pH3,用乙酸乙酯(3*200mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色油状液体4(17.91g,92％)。

(3)将化合物4(12.65g，52mmol)，N，N'-羰基二咪唑(19.2g，69mmol)溶于四氢呋喃(80mL)，室温搅拌4小时；将化合物丙二酸单乙酯钾盐(22.48g，13.2mmol)，无水氯化镁(14.52g，15.28mmol)和4-二甲氨基吡啶(416mg,0.52mmol)溶于乙腈(80mL)和四氢呋喃(150mL)，室温搅拌6小时；上述两种混合液反应好后，将均降低到0度，将上述第一种溶液与三乙胺(41.6mL，203mmol)同时加到上述第二种溶液中，室温搅拌过夜。反应完成后，旋干溶剂，用水(150mL)稀释，乙酸乙酯(3*150mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤旋干，得黄色油状液体5(14.99g，93％)。

(4)中间体6的制备同实施例1(3)

(5)将化合物5(12.54g，40mmol)与化合物6(8.41g，44mmol)溶于无水乙醇(300mL)，再加入三氟乙酸(15mL)，80℃加热，反应12小时后停止加热。冷却到室温后旋干溶剂。用水(100mL)稀释，用1M NaOH调pH 8，用乙酸乙酯(3*200mL)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用甲醇：二氯甲烷＝1：20过硅胶柱，分离得到化合物7(12.69g，72％)。

(6)将化合物7(8.81g，20mmol)溶于二氯甲烷(120mL)，0℃条件下加入三氟乙酸(40mL)，在该温度下反应2小时，旋干溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液调pH10，过滤，滤渣用水洗，少量乙酸乙酯洗，真空干燥箱干燥，得到白色固体8(6.18g，91％)。

(7)将化合物8(3.40g，0mmol)，氯甲酸乙酯(1.15mL),1-羟基苯并***(4.1g，30mmol)，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(11.4g，30mmol)溶于DMF(50mL)，室温搅拌，加入二异丙基乙基胺(15.6mL，90mmol)，反应12小时后，用乙酸乙酯(300mL)稀释，水(4*200mL)洗，饱和食盐水(100mL)洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用二氯甲烷：甲醇＝30：1过硅胶柱，得白色固体M110(2.14g，52％)¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝9.84(s,1H),7.16-7.13(t,J＝12.4Hz,2H),6.93-6.88(t,J＝16.8Hz,2H),5.70(s,1H),4.10-4.05(q,J＝21.2Hz,2H),3.60-3.58(d,J＝8Hz,2H),3.47-3.43(q,J＝16.8Hz,2H),2.14(s,5H),1.75-1.74(d,J＝5.2Hz,2H),1.45(s,3H),1.25-1.21(t,J＝14Hz).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ＝162.7,160.2,157.1,155.4,151.5,138.7,131.2,127.0,115.1,114.9,103.4,94.1,61.4,40.1,37.7,34.7,29.7,25.2,14.6,12.8.

实施例4：本发明的部分化合物(M085、M086、M091、M092)激活TRPC6离子通道的细胞实验

吡唑并嘧啶及其衍生物激活TRPC6离子通道(图1)。在永久性转染TRPC6离子通道的HEK293细胞中，使用M085作为激活剂，并检测荧光膜电位。先用FLIPR膜电位染料(FMP)对细胞进行染色，在第30s时分别加入0.1μM、0.4μM、1.1μM、3.3μM、10μM、30μM的M085，在0.4μM～30μM的M085作用下，永久性转染TRPC6离子通道的HEK293细胞中荧光增强说明膜去极化的增加(图1B)，而未转染TRPC6离子通道的HEK293细胞(对照)中未显示出明显的荧光变化(图1A)。

应用类似的荧光钙流检测M085对表达小鼠TRPC6的HEK293细胞内[Ca²⁺]浓度的影响，对细胞使用Ca²⁺指示Fluo4染色，在30s时加入0.1μM、0.4μM、1.1μM、3.3μM、10μM、30μM的M085，细胞内[Ca²⁺]在3.3μM～30μM的M085作用下有明显升高(图1C)。荧光钙流检结果表明，吡唑并嘧啶及其衍生物中对TRPC6离子通道存在激活作用的化合物有M085、M086、M091及M092；其浓度响应曲线见图1D。其中，对M086分别进行荧光钙流检测和荧光膜电位检测结果见图1E。

全细胞膜片钳检测结果显示，吡唑并嘧啶及其衍生物(M085、M086、M091及M092)对TRPC6通道的激活作用(以M085为代表，图2A)，HEK293细胞全细胞记录模式下钳制在-100～+100mV，不同浓度下(0.04μM、0.12μM、0.37μM、1.1μM、3.3μM及10μM)M085对TRPC6的激活作用，其电流-电压关系见图2B，其浓度响应曲线见图2C，EC₅₀＝2.5μM(n＝5-7)。

实施例5：本发明部分化合物(M107、M110)阻断TRPC6离子通道的细胞试验吡唑并嘧啶及其衍生物(M107、M110)能阻断TRPC6离子通道(图3)。永久转染M5毒蕈碱受体和TRPC6离子通道的HEK293细胞中，应用激动剂激活通道并检测荧光膜电位。细胞用0μM、10μM、30μM的M107处理3分钟后，加入10μM的M085，荧光强度的增强表示膜电位去极化增加，而M107处理的细胞膜电位去极化被抑制(图3A)。

全细胞膜片钳检测结果显示，吡唑并嘧啶及其衍生物(M107、M110)对TRPC6通道的抑制作用，以M107为代表(图3B,C)。HEK293细胞全细胞记录模式下钳制在-100～+100mV，用氨甲酰胆碱(CCh，30μM)激活的TRPC6离子通道被M107(20μM)抑制，并给出了20μM的M107在-100～+100mV下对CCh的抑制率60％与20％(n＝5)。

实施例6本发明的化合物细胞水平的细胞毒活性筛选实验

将对数生长期的细胞，用0.25％胰酶-EDTA消化后，配制成一定浓度的单细胞悬液，根据细胞生长速度的差异，按1000-2000个/孔接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100μL。24h后，加入含不同浓度化合物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100μL(DMSO终浓度<0.1％)，每种受试化合物设5～7个剂量组，每组至少设3个平行孔，于37℃继续培养72h后，弃上清，每孔加入100μL新鲜配制的含0.5mg/mL MTT的无血清培养基，继续培养2h，弃上清后，每孔加入200μL DMSO溶解MTT甲簪沉淀，微型振荡器振荡混匀后，酶标仪在参考波长450nm，检测波长570nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用以下公式计算化合物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算IC₅₀：

(结果列于表1中)

表1.本发明的部分化合物的体外细胞毒活性结果

MCF7为人乳腺癌细胞株；H460为人肺癌细胞株；Lncap、Pc3、Du145为人***癌细胞株；KB为人口腔上皮癌细胞株；RM-1为小鼠***癌细胞株。

实施例7本发明的化合物的动物体内活性实验

选用雄性C57/BL6小鼠，18-22g。实验过程简述如下：取生长良好的小鼠***癌RM-1的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下剥取长势良好的瘤块，匀浆，用生理盐水1：4稀释，给每只小鼠腋下背部接种0.2mL瘤液(约2×10⁶细胞)，次日将动物随机分组并开始给药。化合物M11050mg/kg于接种24h后腹腔注射给药，给药体积为0.1mL/10g；同时设多西紫杉醇对照组及溶剂对照组，多西紫杉醇组以10mg/kg剂量给动物腹腔注射，给药体积为0.1mL/10g。连续给药10天后，颈椎脱臼处死，分别称量体重、瘤重。计算肿瘤生长抑制率(％)，并将结果进行统计学处理。

表1本发明化合物对小鼠***癌RM-1移植瘤瘤重和动物体重的影响

上述实验结果表明，具有本发明通式的化合物M110具有体内抑制小鼠***癌RM-1移植瘤生长的药理学活性。

Claims

1.一种吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐或前药，其特征在于，所述吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物具有通式1所示的结构：

其中，

R₁为氢、烷基羰基、烷氧基羰基、烷基硫代羰基；

R₂为氢、烷基、卤代烷基；

R₃为氢、卤素、三氟甲基。

2.根据权利要求1所述的吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于：所述的卤代烷基为一氯甲基或三氟乙基。

3.根据权利要求1所述的吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于：所述的烷氧羰基为甲氧羰基、乙氧羰基或叔丁氧羰基。

4.根据权利要求1所述的吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于：所述的烷基羰基为甲酰基、乙酰基、丙酰基或异丁酰基。

5.根据权利要求1所述的吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于：所述的卤素为氟、氯或溴。

6.权利要求1所述的吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物上的应用。