ES2899726T3 - Compuesto antiangiogénesis, intermediario y uso del mismo - Google Patents

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Abstract

Un compuesto representado por la Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, **(Ver fórmula)** en donde, R1 se selecciona de H, amino, hidroxi o sulfhidrilo, R2 se selecciona de H, amino, hidroxi, sulfhidrilo o -(CH2)nNHR8, en donde n=1-5, R8 es H o alquilo C1-3; R3 se selecciona de H o alquilo C1-6; R4, R5 y R6 se seleccionan cada uno independientemente de H, halógeno, alquilo C1-6 o alquilo sustituido con halógeno; y R7 se selecciona de H, alquilo C1-6 o halógeno; o, R2 y R3 junto con el átomo de carbono que los conecta forman un anillo de 5 o 6 miembros sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 2 heteroátomos, en donde los heteroátomos son N, O o S, y el sustituyente es alquilo C1-6.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuesto antiangiogénesis, intermediario y uso del mismo
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos y su uso contra enfermedades relacionadas con la angiogénesis. Antecedentes de la invención
La angiogénesis es un proceso de brotación en un nuevo vaso a partir de un vaso existente. Este proceso está asociado a la migración y proliferación de la célula endotelial vascular. La angiogénesis se relaciona con muchas enfermedades humanas graves, tales como el tumor maligno. Hasta ahora, se encontró que las enfermedades de la angiogénesis ocular comprenden la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la retinopatía diabética, el glaucoma neovascular, etc. La característica común de estas enfermedades radica en la proliferación anormal de la angiogénesis ocular (Xiao Jin, y otros, "Research Progress on the Clinical Application and Basic Mechanism of Anti-VEGF Drug", CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT, 2012).
La degeneración macular se divide principalmente en dos tipos, seca y húmeda, en donde la degeneración macular húmeda (DMAE) se caracteriza por la entrada de nuevos vasos de coroides en la retina y los cambios patológicos posteriores tales como sangrado, exudación y edema. La degeneración macular húmeda provocará una pérdida rápida de la visión, que es más grave que la degeneración macular seca. Actualmente, hay un buen avance en el tratamiento de la degeneración macular húmeda. La hemostasia de cauterización con láser temprana se reemplaza por antagonistas de VEGF, sin embargo, la última se reemplaza pronto por terapia fotodinámica debido a su escaso efecto. Aunque la terapia fotodinámica tiene una eficacia mejorada, sigue siendo insatisfactoria. Recientemente, se desarrolló un nuevo antagonista de VEGF, Lucentis, que es un fragmento de anticuerpo monoclonal del subtipo de VEGF de origen humano recombinante, que podría reducir la angiogénesis. Este medicamento se aprobó por la FDA de los EE. UU. para el tratamiento de la degeneración macular húmeda en 2006, que tiene una buena eficacia; y mientras tanto, se encontró que este fármaco anti-VEGF también tiene un efecto terapéutico sobre la retinopatía diabética y el glaucoma neovascular. Sin embargo, dado que Lucentis es un fármaco de anticuerpos con un precio extremadamente alto, no puede popularizarse en todo el mundo. Por lo tanto, es un intenso foco de competencia en la industria farmacéutica internacional actual desarrollar un medicamento inhibidor de la angiogénesis de molécula pequeña que tenga una eficacia excelente y un bajo precio.
La proteína quinasa también se conoce como proteína fosfoquinasa, que es una enzima que cataliza la fosforilación de proteínas. La proteína quinasa podría transferir ácido Y-fosfórico en el ácido adenosina trifosfórico (ATP) al residuo de aminoácido de una molécula de proteína, por ejemplo, al hidroxi en ciertos residuos de serina, treonina o tirosina, para cambiar de esta manera la conformación y actividad de la proteína y enzima. La fosforilación de proteínas es importante para varias vías de transducción de señales, y la mayoría de los procesos de actividad vital intracelular importantes no pueden prescindir de la fosforilación de proteínas.
Las proteínas quinasas se dividen en cinco clases: proteína serina/treonina quinasas, proteína tirosina quinasas, proteína histidina quinasas, proteína triptófano quinasas y proteína aspartil/glutamoil quinasas. Las proteínas quinasas juegan un papel importante en la regulación y mantenimiento de los procesos celulares. Se observa una actividad anormal de la quinasa en muchos estados de enfermedad, que comprenden tumores malignos, enfermedades inmunitarias, enfermedades cardiovasculares, diabetes, enfermedades infecciosas, artritis y otros trastornos inmunológicos, enfermedades del sistema nervioso tales como la demencia senil, la enfermedad de Alzheimer (AD), etc. Se ha descubierto que más de 400 enfermedades humanas están asociadas con proteína quinasas.
Los miembros de la familia de VEGFR (receptor del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares) son receptores tirosina quinasas, por ejemplo, VEGFR1, VEGFR2, etc. Estos receptores juegan un papel importante en el crecimiento y metástasis de tumores malignos, así como también en el proceso de desarrollo de enfermedades tales como enfermedades vasculares proliferativas (por ejemplo, degeneración macular y tumor).
Los miembros de la familia del PDGFR (receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas) son receptores tirosina quinasas, por ejemplo, PDGFRa y PDGFRp, y el receptor del factor 1 estimulante de colonias, el receptor del factor de crecimiento de células madre KIT, etc. Se encontró que estas quinasas están estrechamente asociadas con la aparición y desarrollo de tumores. La expresión anormal de PDGFR se ha encontrado en melanoma, meningeoma, neoplasia neuroendocrina, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón y cáncer de páncreas. La activación anormal de KIT es una inducción directa de la aparición y desarrollo de muchos tumores. Los miembros de la familia del FGFR (receptor del factor de crecimiento de fibroblastos) comprenden FGFR1, FGFR2, etc., que están estrechamente asociados con los cánceres. Por ejemplo, la activación anormal de FGFR2 se ha encontrado en cáncer de endometrio, cáncer de cuello uterino, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de estómago. La familia de quinasas SRC comprende proteínas que tienen actividad de proteína tirosina quinasa. La familia de quinasas SRC, como una proteína de un solo gen, se encuentra inicialmente en el virus del sarcoma de Rous. Se ha descubierto que la inhibición de SRC tiene algún efecto de tratamiento y mejora en cánceres u otras enfermedades. La vía de la proteína quinasa activada por mitógeno p38 (MAPK) es la vía de la señal de respuesta al estrés intracelular, que está estrechamente asociada con la respuesta inflamatoria.
El documento WO2007104538 (NOVARTIS AG) describe compuestos y su uso en el tratamiento de enfermedades dependientes de proteína quinasa, especialmente de enfermedades proliferativas, tales como en particular enfermedades tumorales. Los compuestos descritos tienen un núcleo de pirimidina-O-naftalen-amida-fenilo y actividad inhibidora de VEGFR2 y otras quinasas, y se describen para usar en tratamiento de la angiogénesis y afecciones tales como neovascularización ocular, retinopatía diabética y degeneración macular.
El documento WO2007031265 (NOVARTIS AG) describe una composición que comprende un inhibidor del receptor de VEGF y un potenciador de la penetración, por ejemplo, para administración tópica. Tales composiciones muestran actividad terapéutica en enfermedades dermatológicas, por ejemplo, psoriasis, dermatitis atópica y acné. El documento WO2008009487 (NOVARTIS AG) describe compuestos y su uso en el tratamiento de enfermedades dependientes de proteína quinasa. Los compuestos descritos tienen un núcleo de pirimidina-O-naftaleno-amidafenilo y están indicados para usar en el tratamiento de enfermedades proliferativas, tales como en particular enfermedades tumorales.
Du, J. y otros, (2009) "Molecular modeling studies of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors using QSAR and docking", JOURNAL OF MOLECULAR GRAPHICS AND MODELLING, ELSEVIER SCIENCE, NUEVA YORK, NY, EE. UU., vol. 27, no. 5, páginas 642 - 654. Esta es una publicación científica sobre VEGF y su receptor tirosina quinasa VEGFR-2 o receptor de dominio de inserción de quinasa (KDR) y cómo estos son objetivos para el desarrollo de nuevos agentes anticancerosos. Se realizaron análisis comparativos de campo molecular (CoMFA) y análisis comparativos de índices de similitud molecular (CoMSIA) en una serie de inhibidores selectivos de KDR. Se propone usar la información obtenida de los estudios de modelación molecular para diseñar algunos inhibidores selectivos de KDR con la actividad deseada.
El documento WO2008048375 (BAYER HEALTHCARE AG) describe derivados de piridonacarboxamida, composiciones farmacéuticas que contienen los mismos y métodos para tratar trastornos hiperproliferativos y trastornos de angiogénesis mediante el uso de los mismos.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un compuesto representado por la Fórmula I, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la fórmula estructural es la siguiente:
Figure imgf000003_0001
en donde, R1 se selecciona de H, amino, hidroxi o sulfhidrilo; R2 se selecciona de H, amino, hidroxi, sulfhidrilo o -(CH2)nNHRs, en donde n=1-5, Re es H o alquilo C1-3, R3 se selecciona de H o alquilo C1-6; R4, R5 y R6 se seleccionan cada uno independientemente de H, halógeno, alquilo C1-6 o alquilo sustituido con halógeno; y R7 se selecciona de H, alquilo C1-6 o halógeno;
o, R2 y R3 junto con el átomo de carbono que los conecta forman un anillo de 5 o 6 miembros sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 2 heteroátomos, en donde los heteroátomos son N, O S, y el sustituyente es alquilo C1-6. En una modalidad, R2 se selecciona de H, amino o -(CH2)nNHRe, en donde n=1-3, Re es H o alquilo C1-2; R3 se selecciona de H o alquilo C1-2; R4, R5 y R6 se seleccionan cada uno independientemente de halógeno, alquilo C1-2 o alquilo sustituido con halógeno; y R7 se selecciona de H o halógeno; o, R2 y R3 junto con el átomo de carbono que los conecta forman un anillo de 5 o 6 miembros sustituido o no sustituido que tiene 1 átomo de nitrógeno, en donde el sustituyente es alquilo C1-3.
En otra modalidad, R2 se selecciona de amino o -(C^)nNHRe; o, R2 y R3 junto con el átomo de carbono que los conecta forman un anillo de 5 o 6 miembros sustituido o no sustituido que tiene 1 átomo de nitrógeno, en donde el sustituyente es alquilo C1-3.
En otra modalidad, el halógeno es F o Cl.
En una modalidad preferible, al menos uno de Ri, R2 y R3 es amino y el resto son H; R4, R5 y R6 son iguales y se seleccionan de F o Cl; y R7 es H.
Preferentemente, el compuesto es:
Figure imgf000004_0001
El método de preparación del compuesto de la presente invención puede ser cualquier método adecuado. En un método preferido, el compuesto de la presente invención se puede preparar a partir de un compuesto intermedio representado por la Fórmula II.
Por lo tanto, la presente invención proporciona además el compuesto intermedio representado por la Fórmula II para preparar el compuesto de Fórmula I:
Figure imgf000004_0002
en donde R4, R5 y R6 se seleccionan cada uno independientemente de H, halógeno, alquilo C1-6 o alquilo sustituido con halógeno; y R7 se selecciona de H, alquilo C1-6 o halógeno.
En otra modalidad, R4, R5 y R6 se seleccionan cada uno independientemente de halógeno, alquilo C1-2 o alquilo sustituido con halógeno; y R7 se selecciona de H o halógeno.
En otra modalidad, R4, R5 y R6 son iguales y se seleccionan de F o Cl; y R7 es H. El método de preparación del compuesto intermedio representado por la Fórmula II comprende las etapas de:
Figure imgf000004_0003
en donde R4, R5, R6 y R7 tienen la misma definición que la anterior.
Un método preferido de preparación del compuesto de Fórmula I comprende las etapas de:
Figure imgf000005_0001
en donde R1, R2 y R3 tienen la misma definición que la anterior.
Un método preferido de preparación del compuesto comprende las etapas de reacción de:
(1) síntesis del compuesto intermedio representado por la Fórmula 7:
Figure imgf000005_0002
en donde R4, R5 y R6 tienen la misma definición que la anterior;
(2) síntesis del compuesto objetivo:
Figure imgf000005_0003
en donde R1, R2 y R3 tienen la misma definición que la anterior.
La presente invención proporciona además compuestos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos como se definió anteriormente para usar en la inhibición de la proliferación anormal de la angiogénesis o el tratamiento de enfermedades asociadas con la proliferación anormal de la angiogénesis, en donde la proliferación anormal de la angiogénesis es degeneración macular húmeda, retinopatía diabética o glaucoma neovascular, y las enfermedades asociadas con la proliferación anormal de la angiogénesis son la degeneración macular húmeda, la retinopatía diabética o el glaucoma neovascular.
La inhibición de la proliferación anormal de la angiogénesis incluye la inhibición de la proliferación anormal de la angiogénesis ocular; y las enfermedades asociadas con la proliferación anormal de la angiogénesis son enfermedades asociadas con la angiogénesis ocular.
La inhibición de la proliferación anormal de la angiogénesis puede referirse a la inhibición de la proliferación anormal de la angiogénesis coroidea; y las enfermedades asociadas con la proliferación anormal de la angiogénesis son enfermedades asociadas con la angiogénesis coroidea.
La administración puede ser por administración tópica directa a la región ocular o inyección intravítrea o subconjuntival.
La presente invención proporciona además compuestos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, como se definió anteriormente, para usar en el tratamiento de enfermedades causadas por proteínas quinasas anormales, en donde las enfermedades se seleccionan del grupo que consiste en inflamación y tumores malignos.
Las proteína quinasas pueden ser VEGFR2, PDGFR-p, KIT, AURORA-B, FGFR2, SRC, JAK2 o P38-a, preferentemente VEGFR2, KIT o PDGFR-p.
La presente invención proporciona, además, una composición farmacéutica, que comprende una cantidad efectiva de los compuestos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos como se definió anteriormente. En una modalidad, la composición es una preparación oftálmica. La preparación oftálmica puede comprender además otros medicamentos conocidos que tienen un uso terapéutico similar, excepto por el compuesto anterior proporcionado en la presente invención.
En una modalidad, la preparación oftálmica es un colirio, una pomada para los ojos o una inyección oftálmica.
En otra modalidad, la inyección oftálmica es una inyección intravítrea o subconjuntival. La sal del compuesto de la presente invención se puede preparar mediante métodos conocidos en la técnica, que incluyen el tratamiento del compuesto con un ácido o con un anionito adecuado para formar una sal. La sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de la presente invención puede ser una sal de adición de ácido orgánico o inorgánico con el átomo de nitrógeno básico del compuesto anterior.
Preferentemente, los ácidos inorgánicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, haloidaácido (por ejemplo, ácido clorhídrico), ácido sulfúrico o ácido fosfórico.
Preferentemente, los ácidos orgánicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido carboxílico, ácido fosfórico, ácido sulfónico o ácido aminocarboxílico, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido hidroxiacético, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácido, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico, ácido maleico, hidroxiácido, ácido metil maleico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido adamantanocarboxílico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido 4-amino salicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, ácido mandélico, ácido cinámico, ácido metano o etanosulfónico, ácido 2-oxietilsulfónico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido fenilsulfónico, 2-ácido naftalenosulfónico, ácido 1,5-naftalenosulfónico, ácido 2-toluenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido etilsulfúrico, ácido dodecilsulfúrico, ácido N-ciclohexilaminoacético, ácido N-metil-N-etil-N-propil-sulfámico u otros ácidos orgánicos, por ejemplo, ácido ascórbico.
Adicionalmente, la sal también puede ser una sal farmacéuticamente inaceptable usada en la separación o purificación, por ejemplo, picrato o perclorato. Sin embargo, la sal usada para uso terapéutico solo puede ser una sal o un compuesto libre farmacéuticamente aceptable, en forma de preparación farmacéutica adecuada.
En la presente descripción se describe como referencia un profármaco farmacéuticamente aceptable de los compuestos de la presente invención que es un compuesto obtenido por modificación de la estructura química, que libera el ingrediente activo y ejerce la eficacia después de la conversión por enzima o no enzima in vivo.
En la presente descripción se describe además un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se definió anteriormente, marcado con un isótopo, en donde uno o más átomos del compuesto se reemplazan por otro átomo, que tiene diferente masa atómica o número de masa en comparación con los comunes en la naturaleza. Los isótopos que se pueden introducir en el compuesto comprenden H, C, N, O, S, es decir, 2H 3H 13C, 14C, 15N, 17O 18O, y 35S En la presente descripción se describen compuestos que comprenden los átomos isotópicos y/u otros isotópicos anteriores, y estereoisómeros de los mismos, así como también sales farmacéuticas de los compuestos y estereoisómeros.
La separación y purificación del compuesto e intermediario crítico puede realizarse mediante métodos de separación y purificación comunes en química orgánica, en donde los ejemplos de estos métodos comprenden filtración, extracción, secado, secado por centrifugación y varios tipos de cromatografía. Alternativamente, el intermediario se puede introducir en la siguiente reacción sin purificación.
Los compuestos de la presente invención tienen un buen efecto contra la proliferación anormal de la angiogénesis, y este tipo de compuestos producen actividad mediante la inhibición de VEGFR2 (también denominado KDR). Los compuestos pueden usarse para tratar enfermedades, tales como degeneración macular húmeda, inflamación, tumor maligno y similares, causadas por la proliferación anormal de la angiogénesis y anomalías de proteína quinasas tales como VEGFR2, FGFR2 y similares.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un espectro de masas del compuesto 2-1.
La Figura 2 es un espectro de masas del compuesto 2-2.
La Figura 3 es un espectro
Figure imgf000007_0001
de RMN del compuesto 2-2.
La Figura 4 es un espectro de masas del compuesto 2-3.
La Figura 5 es un espectro de masas del compuesto 2-4.
La Figura 6 es un espectro de masas del compuesto 2-5.
La Figura 7 es una micrografía fluorescente del desarrollo vascular de la columna vertebral de un pez cebra, en donde la Figura 7A muestra una micrografía fluorescente del desarrollo vascular normal de la columna vertebral de un pez cebra (control negativo); y la Figura 7B muestra una micrografía fluorescente del desarrollo vascular inhibido (100 %) de la columna vertebral del pez cebra después del tratamiento con 1 pM del compuesto 2-2.
La Figura 8 es una figura de resultado que muestra la inhibición in vitro de los compuestos 2-1, 2-2 y 2-4 (es decir, KDR2 en la figura) de la presente invención sobre VEGFR2.
La Figura 9 es una micrografía fluorescente Zeiss de inhibición de la angiogénesis coroidea, en donde la Figura 9A es una micrografía fluorescente Zeiss de inhibición evidente de la angiogénesis coroidea por el compuesto 2-2 en una concentración de 1 uM; y la Figura 9B es una micrografía fluorescente de Zeiss mediante el uso de PBS como control negativo.
La Figura 10 es una curva dosis-efecto de los compuestos de la presente invención, en donde la Figura 10A se refiere a un control positivo de Estaurosporina; la Figura 10B se refiere al compuesto 2-1; y la Figura 10C se refiere al compuesto 2-2.
La Figura 11 es una foto que muestra el efecto del compuesto 2-2 sobre la angiogénesis corneal oftálmica de un ratón, en donde la Figura 11A muestra el ojo derecho de los ratones tratados con el compuesto 2-2; y la Figura 11B muestra el ojo izquierdo de los ratones tratados con PBS como control.
La Figura 12 es una fotografía que muestra el efecto del compuesto 2-2 sobre la angiogénesis corneal oftálmica de un conejo, en donde la Figura 12A muestra el ojo tratado con el compuesto 2-2; la Figura 12B muestra el ojo tratado con PBS como control; y la Figura 12C muestra el ojo tratado con el compuesto 2-1.
Descripción detallada de las modalidades
Ejemplo 1 La preparación del compuesto intermedio 7
Figure imgf000007_0002
Etapa 1:
Se mezcló lentamente etil vinil éter (50 g, 0,69 mol) con cloruro de oxalilo (132,3 g, 1,04 mol) a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó a 0 °C durante 2 horas y luego se calentó a temperatura ambiente y se mantuvo durante 12 horas. El exceso de cloruro de oxalilo se eliminó por destilación. El residuo se calentó a 120 °C durante 30 min y se purificó mediante destilación al vacío para obtener un compuesto 1 purificado (49 g, rendimiento: 53 %) como una sustancia aceitosa de color amarillo claro.
Etapa 2:
A una solución del compuesto 2 (50 g, 0,365 mol) en metanol (1 L) se añadió cloruro de tionilo (66 mL, 0,91 mol) a 0 °C bajo agitación. Luego, la mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC (éter de petróleo/acetato de etilo (PE/EA)=1:1). Una vez completada la reacción, la mezcla se evaporó y el residuo se ajustó a pH 8 mediante la adición de Na2CO3 y se extrajo con acetato de etilo (EA). La fase orgánica se lavó con salmuera saturada, se secó con sulfato de sodio anhidro y se concentró para obtener el compuesto 3 (51,7 g, rendimiento: 93,8 %) como un sólido marrón, que se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 3:
A una solución del compuesto 3 (10 g, 66 mmol) disuelto en diclorometano (DCM, 100 mL), se añadieron piridina (9,06 g, 119 mmol) y el compuesto 1 (15 g, 112 mmol) disuelto en DCM (40 mL) a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 2,5 horas. La reacción se controló mediante TLC (PE/EA=1:1). Una vez completada la reacción, la mezcla se lavó con agua y luego con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro y se concentró para obtener un producto crudo. El producto se purificó mediante cromatografía (eluyó con DCM/metanol=20:1), para obtener un compuesto 4 purificado (9,67 g, rendimiento: 59 %) como un sólido blanco.
Etapa 4:
A 175 ml de H2SO4 concentrado se añadió el compuesto 4 (9,67 g, 0,039 mol) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. La reacción se controló mediante TLC (PE/EA=1:1). Una vez completada la reacción, la mezcla se vertió en agua helada. El precipitado se filtró y se lavó con éter dietílico (Et2O), se recristalizó con etanol, para obtener el compuesto 5 (2 g, rendimiento: 25 %) como un sólido beige.
Etapa 5:
A una solución del compuesto 5 (2,0 g, 9,85 mmol) en metanol (MeOH, 20 mL) se añadió gota a gota NaOH 2 N (24,6 ml, 49,25 mmol) a 0 °C bajo agitación. Luego, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=15:1). Una vez completada la reacción, la mezcla se evaporó y el residuo se acidificó mediante la adición de HCl 1 N a pH 2. El precipitado se formó y se recogió por filtración y se secó para obtener un compuesto 6 purificado (0,8 g, 43 %) como un sólido blanco.
Etapa 6:
Compuesto 6 (0,8 g, 4,22 mmol), 3-(trifluorometil)anilina (0,75 g, 4,64 mmol), HATU (C10H15F6N6OP, 1,92 g, 5,06 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (DIPEA, 1,64 g, 12,66 mmol) se mezclaron en DMF (10 mL) y la mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=10:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con EA. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para obtener un compuesto 7 purificado (0,85 g, rendimiento: 60,6 %) como un sólido amarillo.
Ejemplo 2 La preparación del compuesto 2-1 (en la presente descripción también denominado serie 2-1)
Figure imgf000008_0001
La preparación del compuesto 8:
Figure imgf000009_0001
Se añadieron el compuesto 8A (20 g, 0,15 mol) y dimetilaminopiridina (DMAP, 1,9 g, 15,4 mmol) a tetrahidrofurano (THF, 750 mL) y se agitó. A la solución se le añadió gota a gota dicarbonato de di-terc-butilo ((Boc)2O, 75 g, 0,34 mol). Luego, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC (PE/EA=3:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se concentró y se resuspendió en una mezcla de solvente PE/EA (10:1, 200 mL), se filtró para obtener un compuesto 8 purificado (50 g, 100 %) como un sólido blanco.
La preparación del compuesto 9:
En atmósfera de nitrógeno, el compuesto 7 (30 mg, 0,09 mmol) y el carbonato de cesio (58,6 mg, 0,18 mmol) se mezclaron en dimetilsulfóxido (DMSO, 1 mL), la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas y luego se añadió el compuesto 8 (32,8 mg, 0,009 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó durante 18 horas, se controló mediante TLC (DCM/metanol=15:1) y la reacción no se completó. La mezcla de reacción se agitó durante 80 °C durante otras 5 horas y luego se diluyó con agua y se extrajo con EA. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante TLC para obtener un compuesto 9 purificado (10 mg, rendimiento: 17,8 %) como un sólido amarillo.
La preparación del compuesto 2-1:
Se agitó una mezcla de compuesto 9 (10 mg, 0,019 mmol) y ácido trifluoroacético (TFA, 0,2 mL) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 1 hora. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=20:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se alcalinizó con carbonato de sodio y se extrajo con DCM. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante TLC para obtener un compuesto 2-1 purificado (4,3 mg, rendimiento: 53,75 %) como un sólido amarillo. La Figura 1 muestra su espectro de masas.
Ejemplo 3 La preparación del compuesto 2-2 (en la presente descripción también denominado serie 2-2)
Figure imgf000009_0002
La preparación del compuesto 10:
Figure imgf000009_0003
La preparación del compuesto 10B:
A una solución agitada del compuesto 10A (5,0 g, 45 mmol) en piridina (200 mL) se añadió gota a gota (Boc)2O (14,7 g, 67,5 mmol) a 65 °C. Luego, el reactivo se agitó a 85 °C durante 4 horas. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=10:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C, se añadió HCl concentrado (100 mL) y luego se añadió agua (50 mL). Después de extraer con EA, la fase orgánica se lavó con solución de NaHCO3 y salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró, para obtener una sustancia aceitosa de color amarillo, que se suspendió en Et2O, y el sólido se recogió por filtración para obtener el compuesto 10B (4,3 g, rendimiento del 45,2 %) como un sólido blanco.
La preparación del compuesto 10C:
A una solución del compuesto 10B (2,4 g, 11,4 mmol) y N,N-dimetilanilina (6,6 mL) en DCM (84 mL) se añadió gota a gota oxicloruro de fósforo (3,2 ml, 34,2 mmol) a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. Luego, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas duna vez completada la adición. La reacción se controló mediante TLC (PE/eA=2:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se vertió en agua helada y luego se separó la fase acuosa de la fase orgánica. La fase orgánica se lavó con solución acuosa de NaHCO3 y salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para obtener un compuesto 10C purificado 1,8 g, rendimiento: 70 %) como un sólido blanco.
La preparación del compuesto 10:
El compuesto 10C (100 mg, 0,47 mmol) y DMAP (12 mg, 0,09 mmol) se disolvieron en THF (1 mL). A la mezcla se añadió gota a gota (Boc)2O (124 mg, 0,57 mmol) a temperatura ambiente. Luego, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC (PE/EA=1:1). Una vez completada la reacción, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo con EA. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante TLC para obtener un compuesto 10 purificado (70 mg, rendimiento: 44,8 %) como un sólido blanco.
La preparación del compuesto 11:
El compuesto 7 (50 mg, 0,15 mmol) y K2CO3 (62,2 mg, 0,45 mmol) se disolvieron en DMSO (3 mL), se agitaron a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 0,5 horas y luego se añadió el compuesto 10 (148,4 mg, 0,45 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó durante 5 horas y se controló mediante TLC (DCM/metanol=20:1). Una vez completada la reacción, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo con EA. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó por TLC para obtener un compuesto 11 purificado (31 mg, rendimiento: 33 %) como un sólido blanco.
La preparación del compuesto 2-2:
Se añadió el compuesto 11 (25 mg, 0,04 mmol) a TFA (0,2 mL) y se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 0,5 horas. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=20:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se alcalinizó con carbonato de sodio y se extrajo con DCM. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante TLC para obtener un compuesto 2-2 purificado (17 mg, rendimiento: 85,3 %) como un sólido blanco. Las Figuras 2 y 3 muestran su espectro de RMN H1 y su espectro de masas.
Ejemplo 4 La preparación del compuesto 2-3 (en la presente descripción también denominado serie 2-3)
Figure imgf000011_0001
Serie 2-3
La preparación del compuesto 12B:
El compuesto 12A (50 g, 0,47 mol) se agitó en DCM (600 mL) a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. Después de la disolución, se añadió TEA (94 g, 0,93 mol) y luego se añadió gota a gota bromoacetato de etilo (94 g, 0,56 mol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC (PE/EA=1:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se filtró y el filtrado se concentró y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (eluido y purificado con PE/EA=20:1~10:1~5:1) para obtener un compuesto purificado 12B (46 g, rendimiento: 51 %) como una sustancia aceitosa amarilla.
La preparación del compuesto 12C:
El compuesto 12B (38 g, 196,65 mmol) y TEA (29,9 g, 295 mmol) se calentaron y agitaron en tolueno (800 mL) a 95 °C y luego se añadió gota a gota 4-bromobutirato de etilo (72,9 g, 373,65 mmol). Luego, la mezcla de reacción se calentó hasta reflujo durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC (PE/EA=5:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (eluyó con PE/EA=20:1~5:1) para obtener un compuesto purificado 12C (32 g, rendimiento: 53 %) como una sustancia aceitosa amarilla.
La preparación del compuesto 12D:
A una solución del compuesto 12C (32 g, 104,3 mmol) en tolueno (300 mL) se añadió terc-butóxido de potasio (51,2 g, 456,3 mmol) a 0 °C. Luego, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se controló mediante TLC (PE/EA=5:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se ajustó a pH=6 mediante la adición de HCl 2 N y luego se extrajo con EA. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró, para obtener un compuesto 12D crudo como una sustancia aceitosa de color amarillo oscuro (17 g, rendimiento: 62,5 %), que se usó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional. La preparación del compuesto 12E:
Se disolvió metóxido de sodio (MeONa, 11 g, 161,65 mmol) en metanol (280 mL), se enfrió a 5 ° C y luego se añadió acetato de formamidina (3,0 g, 29,15 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 0,5 horas y luego se añadió el compuesto 12D (17 g, 65,1 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=10:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, y se evaporó para eliminar la mayor parte del solvente. El residuo se extrajo con EA. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para obtener un compuesto 12E purificado (2,5 g, rendimiento: 16 %) como un sólido de color amarillo claro.
La preparación del compuesto 12F:
El compuesto 12E (2,5 g, 10,4 mmol), el 10 % Pd/C (0,5 g) y (Boc)2O (2,7 g, 12,4 mmol) se mezclaron en MeOH (40 mL), se agitaron bajo una atmósfera de hidrógeno (con una presión de 0,5 Mpa) durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=10:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se filtró y el filtrado se concentró para obtener un compuesto 12F purificado (2,6 g, 100 %) como un sólido amarillo.
La preparación del compuesto 12:
Se mezclaron el compuesto 12F (1,6 g, 6,3 mmol), trifenilfosfina (3,33 g, 12,6 mmol) y tetraclorometano (2,93 g, 18,9 mmol) en 1,2-dicloroetano (1,2-DCE, 64 mL), se calentó a 70 °C durante 1 hora. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=10:1). La mezcla de reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para obtener un compuesto 12 purificado (1,38 g, rendimiento: 81 %) como un sólido de color amarillo claro. La preparación del compuesto 13:
El compuesto 7 (50 mg, 0,15 mmol) y K2CO3 (62,2 mg, 0,45 mmol) se disolvieron en DMSO (2 mL), se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 1,5 horas y luego se añadió el compuesto 12 (121,4 mg, 0,45 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó durante 1,5 horas y se controló mediante TLC (DCM/metanol=20:1). Una vez completada la reacción, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo con EA. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante TLC para obtener un compuesto 13 purificado (10 mg, rendimiento: 12,2 %) como un sólido blanco.
La preparación del compuesto 2-3:
El compuesto 13 (10 mg, 0,018 mmol) y TFA (0,1 mL) se mezclaron y se agitaron a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 0,5 horas. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=10:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se alcalinizó con carbonato de sodio y se extrajo con DCM. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante TLC para obtener un compuesto 2-3 purificado (3 mg, rendimiento: 35,7 %) como un sólido blanco. La Figura 4 muestra su espectro de masas.
Ejemplo 5 La preparación del compuesto 2-4 (en la presente descripción también denominado KDR2)
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Etapa 1:
Se añadió lentamente etil vinil éter (50 g, 0,69 mol) a cloruro de oxalilo (132,3 g, 1,04 mol) a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó a 0 °C durante 2 horas, se calentó a temperatura ambiente y se mantuvo durante 12 horas. El exceso de cloruro de oxalilo se eliminó por destilación. El residuo se calentó a 120 °C durante 30 min y se purificó mediante destilación al vacío para obtener un compuesto 1 purificado (49 g, rendimiento: 53 %) como una sustancia aceitosa de color amarillo claro.
Etapa 2:
A una solución del compuesto 2 (50 g, 0,365 mol) en metanol (1 L) se añadió cloruro de tionilo (66 mL, 0,91 mol) a 0 °C bajo agitación. Luego, la mezcla de reacción se agitó a 40 °C durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC (PE/EA=1:1). La mezcla se evaporó. El residuo se alcalinizó a pH 8 mediante la adición de Na2CO3 y se extrajo con EA. La fase orgánica se lavó con salmuera saturada, se secó con sulfato de sodio anhidro y se concentró para obtener el compuesto 3 (51,7 g, rendimiento: 93,8 %) como un sólido marrón, que se usó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 3:
El compuesto 3 (10 g, 66 mmol) se disolvió en 100 mL de DCM. Se añadió una solución de piridina (9,06 g, 119 mmol) y compuesto 1 (15 g, 112 mmol) en DCM (40 mL) a 0 °C en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 2,5 horas. La reacción se controló mediante TLC (PE/EA=1:1). Una vez completada la reacción, la mezcla se lavó con agua y salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía (eluyó con DCM/metanol=20:1), para obtener un compuesto 4 purificado (9,67 g, rendimiento: 59 %) como un sólido blanco.
Etapa 4:
A 175 ml de H2SO4 concentrado se añadió el compuesto 4 (9,67 g, 0,039 mol) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. La reacción se controló mediante TLC (PE/EA=1:1). La mezcla se vertió en agua helada. El precipitado se filtró y se lavó con Et2O, y el sólido se recristalizó con etanol, para obtener el compuesto 5 (2 g, rendimiento: 25 %) como un sólido beige.
Etapa 5:
A una solución del compuesto 5 (0,504 g, 2,48 mmol) en 3 mL de DMSO se añadió carbonato potásico (0,686, 4,97 mmol). Después de 0,5 horas, se añadió el compuesto 6 (0,768 g, 2,98 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 100 °C durante toda la noche en atmósfera de nitrógeno. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=10:1). Una vez completada la reacción, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera saturada, se secó con Na2SO4 anhidro y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía (eluyó con PE/EA=5:1 a 2:1) para obtener un compuesto 7 purificado (0,683 g, rendimiento: 65 %) como un sólido amarillo claro.
Etapa 6:
A una solución del compuesto 7 (0,683 g, 1,6 mol) en THF (10 mL) se añadió gota a gota hidróxido de litio 2 N (1,6 mL, 3,2 mmol) a 0 °C. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=10:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se evaporó para eliminar el THF y el residuo se diluyó con agua y se extrajo con EA para eliminar las impurezas. La fase acuosa se acidificó y se ajustó a pH 3 mediante la adición de HCl 2 N. El precipitado blanco se recogió por filtración y se secó para obtener un compuesto 8 purificado (400 mg, rendimiento: 61 %) como un sólido blanco. Etapa 7:
A una solución del compuesto 8 (100 mg, 0,24 mmol) y el compuesto 9 (47 mg, 0,29 mmol) en DMF (3 mL) se añadieron HATU (139 mg, 0,37 mmol) y DIPEA (95 mg, 0,73 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a 40 °C en atmósfera de nitrógeno y se agitó durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=10:1). Una vez completada la reacción, la mezcla se diluyó con EA, se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante pre-TLC, para obtener 60 mg de compuesto 10 (60 mg, rendimiento: 45 %) como un sólido de color amarillo claro.
Etapa 8:
Se agitó una mezcla de compuesto 10 (10 mg, 0,018 mmol) y TFA (0,1 mL) a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=10:1). Una vez completada la reacción, se evaporó el TFA y el residuo se alcalinizó con solución acuosa de Na2CO3 y se extrajo con DCM. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante pre-TLC para obtener un compuesto purificado 2-4 (5 mg, rendimiento: 62 %) como un sólido amarillo. La Figura 5 muestra datos de su estructura de identificación.
Ejemplo 5 La preparación del compuesto 2-5 (en la presente descripción también denominado serie 2-5)
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La preparación del compuesto 14C:
Se cargaron el compuesto 14A (100 g, 0,716 mol) y etanol (1,0 L) en un matraz de 3 L equipado con un agitador mecánico y un tubo de cloruro de calcio. La mezcla se agitó durante 20 min y luego se añadió gota a gota trietilamina (TEA, 72,5 g, 0,716 mol). La mezcla resultante se agitó durante 10 min y luego se añadió acrilato de etilo (61,6 g, 0,716 mol) a la mezcla anterior. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas. Se añadió gota a gota (Boc)2O (234,5 g, 1,08 mol) a temperatura ambiente. Luego, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción se concentró para eliminar la mayor parte del etanol. El residuo se disolvió en agua (3 L) y se extrajo con Et2O (1 L * 3), luego se lavó con agua, solución de cloruro de amonio (500 mL * 3) y salmuera (500 mL * 3), se secó con Na2SO4 anhidro y se concentró, para obtener un compuesto 14C crudo (300 g, 92 %) como una sustancia aceitosa amarilla, que se usó directamente en la siguiente etapa sin una purificación adicional.
La preparación del compuesto 14D:
Se añadió gradualmente sodio (27,6 g, 0,765 mol) a etanol absoluto (1,5 L). Cuando el sólido desapareció por completo, se añadió a la solución el compuesto 14C (300 g, 1,04 mol). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante toda la noche, se controló con TCL (PE/EA=4:1), hasta que el material de partida se consumió por completo. La mezcla de reacción se evaporó para eliminar la mayor parte del solvente. El residuo se disolvió en agua (1 L) y se acidificó con ácido cítrico a pH 6. La mezcla se extrajo con EA (1 L x 3). Los licores del extracto se combinaron, se lavaron con salmuera (1 L x 3), se secaron con Na2SO4 anhidro y se evaporaron para obtener el compuesto 14D (169 g, 63,4 %) como una sustancia aceitosa marrón. El producto crudo se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
La preparación del compuesto 14E:
Se disolvió MeONa (2,6 g, 48,58 mmol) en MeOH (50 mL). La mezcla de reacción se enfrió a 5 °C y se añadió acetato de formamidina (3,0 g, 29,15 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 0,5 horas y luego se añadió el compuesto 14D (5,0 g, 19,43 mmol). La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante toda la noche. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=10:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, y se evaporó para eliminar la mayor parte del solvente. El residuo se extrajo con EA. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice para obtener un compuesto 14E purificado (680 mg, rendimiento: 14,7 %) como un sólido de color amarillo claro.
La preparación del compuesto 14:
A una solución del compuesto 14E (100 mg, 0,42 mmol) y N,N-dimetilanilina (0,28 mL) en DCM (4 mL) se añadió oxicloruro de fósforo (174 mg, 1,26 mmol) a 0 °C en atmósfera de nitrógeno y en condiciones de agitación. Una vez completada la adición, la mezcla de reacción se vertió en agua helada, a la que se le añadió carbonato de sodio sólido y se extrajo con DCM. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante TLC para obtener un compuesto 14 purificado (60 mg, 55,6 %) como un sólido blanco.
La preparación del compuesto 15:
El compuesto 7 (50 mg, 0,15 mmol) y K2CO3 (62,2 mg, 0,45 mmol) se disolvieron en DMSO (2 mL), se agitaron a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 1,5 horas y luego se añadió el compuesto 14 (115,4 mg, 0,45 mmol) y se agitó durante otras 1,5 horas. La TLC (DCM/metanol=20:1) indicó la terminación de la reacción. Una vez completada la reacción, la mezcla se diluyó con agua y se extrajo con EA. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante TLC para obtener un compuesto 15 purificado (14 mg, rendimiento: 16,7 %) como un sólido blanco.
La preparación del compuesto 2-5:
Se agitó una mezcla del compuesto 15 (14 mg, 0,025 mmol) y TFA (0,2 mL) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 0,5 horas. La reacción se controló mediante TLC (DCM/Metanol=10:1). Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se alcalinizó con carbonato de sodio y se extrajo con DCM. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro y se concentró, para obtener un producto crudo. El producto crudo se purificó mediante TLC para obtener un compuesto purificado 2-5 (2,7 mg, rendimiento: 24,5 %) como un sólido blanco. La Figura 6 muestra su espectro de masas.
Los efectos beneficiosos de la presente invención se ilustran específicamente mediante los siguientes ejemplos de prueba.
Ejemplo de prueba 1 Prueba de inhibición del desarrollo vascular de Danio rerio
Danio rerio, también conocido como pez Cebra, es un pez óseo de Danio en Ciprínidos, y sus genes tienen hasta un 85 % de similitud con los genes humanos. Las hembras pueden desovar 200-300 desoves, y los procesos de fertilización y desarrollo embrionario se realizan in vitro. Pueden crecer dentro de 24 horas y el embrión es transparente, lo que es adecuado para observar el cambio de órganos y tejidos intracorporales. Estas características hacen que el danio rerio se convierta en uno de los cinco animales de laboratorio de peces aceptados por la organización internacional para su estandarización. Actualmente, el danio rerio se usa ampliamente en estudios de enfermedades humanas, especialmente se usa en estudios del sistema cardiovascular. El danio rerio puede usarse para analizar la influencia de compuestos moleculares pequeños en la angiogénesis.
Método experimental: Este experimento usa danio rerio transgénico FLK1-GFP como modelo animal que se ha usado generalmente para analizar la influencia de compuestos en la angiogénesis. El vaso se puede observar in vivo con un microscopio de fluorescencia (Suk-Won Jin, 2005, Development). El embrión seleccionado del danio rerio transgénico FLK1-GFP postnatal se colocó en una placa de cultivo y se incubó durante 3-5 días en una incubadora a 28 °C. Los compuestos de la presente invención y Pazopanib (130B, control positivo) se añadieron directamente a la solución de cultivo del danio rerio, que se había incubado durante 3-5 días, a las concentraciones que se muestran en la Tabla 1; se usó DMSO 40 uM como control negativo. Se examina el estado de desarrollo del vaso vertebral después de 24 horas y se toma una foto mediante el uso del microscopio de fluorescencia. Véase la Tabla 1 para conocer la velocidad de inhibición de los compuestos sobre el desarrollo del vaso vertebral, en donde la condición de desarrollo de vasos del grupo de control negativo se estableció como 0 %, y la condición de ausencia total de desarrollo de los vasos se estableció en 100 %. Las Figuras 7A y 7B muestran la micrografía de fluorescencia del danio rerio donde el danio rerio en el grupo de control negativo se trata con DMSO 40 uM, y la micrografía de fluorescencia del danio rerio donde el danio rerio se trata con 1 uM del compuesto 2-2, respectivamente, en donde se puede ver que el desarrollo de los vasos vertebrales del danio rerio en el grupo de control negativo es normal, mientras que el desarrollo de los vasos vertebrales del danio rerio tratado con el compuesto 2-2 está inhibido en un 100 %.
Tabla 1 El efecto de inhibición del compuesto de la presente invención sobre el desarrollo de vasos del danio rerio transgénico FLK1-GFP
Figure imgf000017_0001
Puede verse en la Tabla 1 y la Figura 7 que, todos los compuestos 2-1, 2-2, 2-3, 2-4 y 2-5 de la presente invención tienen un efecto de inhibición sobre el desarrollo de vasos del danio rerio, en donde los compuestos 2-1 y 2-2 tienen obviamente una actividad más preferible.
Ejemplo de prueba 2 Prueba de inhibición in vitro de los compuestos de la presente invención en VEGFR2
El método experimental para detectar la inhibición de los compuestos de la presente invención en la quinasa VEGFR2 es el siguiente:
1) Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) de cultivo primario P3-P5 se transfirieron a una placa de 6 pocillos, 2*105 células por pocillo;
2) se añadieron los compuestos 2-1, 2-2 y 2-4 de la presente invención (las concentraciones son 10 nM, 100 nM y 1 |jM para cada compuesto) cuando las células crecieron al 70-80 %, VEGF fue un control, incubación durante 30 min; 3) se añadieron 50 ng/ml de VEGF (compañía cell Signaling, EE. UU.), para estimular durante 10 min;
4) se añadió tampón de lisis sin desnaturalización para terminar la reacción, y se recogió tampón de lisis celular para llevar a cabo la cuantificación de proteínas;
5) electroforesis SDS-PAGE, transferencia a membrana de nitrocelulosa, la membrana se cortó y se selló en tampón de tween fosfato, tampón TTBS (solución salina tamponada con Tris, Tween 20 al 0,01 %, compañía cell Signaling, EE. UU., PH 8,0) formulado a partir del 5 % leche desnatada durante 2 horas;
6) lavar la membrana, sellar a 4 °C durante toda la noche mediante el uso de un anticuerpo anti-VEGFR2 fosforilado (dilución 1:1000, compañía cell Signaling, EE. UU.);
7) el segundo día después del lavado de la membrana, se incubó el segundo anticuerpo anti-conejo de cabra marcado con peroxidasa de rábano picante (compañía cell Signaling, EE.UU.) con la membrana a temperatura ambiente durante 1 hora;
8) revelar con el kit de quimioluminiscencia (compañía Millipore) después de lavar la membrana y tomar fotos.
El resultado de la prueba se mostró en la Figura 8. Puede verse en la Figura 8 que todos los compuestos 2-1, 2-2 y 2-4 pueden inhibir el VEGFR2, en donde el compuesto 2-2 tiene un mejor efecto.
Ejemplo de prueba 3 El efecto de inhibición de los compuestos de la presente invención sobre la angiogénesis coroidea
Los ratones son c57/BL (Jax Lab, EE. UU.), Y el experimento se realiza en un modelo animal de angiogénesis coroidea inducida por láser (CNV). Este modelo es un modelo animal ampliamente usado para estudiar la influencia de un medicamento en el desarrollo de CNV de la degeneración macular húmeda. Todos los ratones tenían 2-3 meses de edad y estaban narcotizados con Avertin; que produce midriasis con tropicamida al 1 % (Alcon); se realizaron 4 puntos de quemado de fotocoagulación para cada ojo mediante el uso de la fotocoagulación láser IRIDEX OcuLight GL532nm (IRIDEX) y el sistema de suministro de la lámpara de hendidura, y los parámetros fueron los siguientes: potencia 120 mW, tamaño del punto 75 jm y duración 0,1 segundos. Se fotocoagularon con láser ratones c57/BL (4 puntos láser en cada retina) para inducir el desarrollo de CNV. Solo se consideraron estudiados los puntos láser, que se observaron como burbujas que indicaban la fractura de la membrana de Bruch. Inyectar inmediatamente después de la implementación del láser: se inyectó en el ojo derecho 1 jM del compuesto 2-2 y en el ojo izquierdo se inyectó PBS que tenía el mismo volumen que el medicamento como control. Sacrificar al animal 5 días después de la inyección y obtener el globo ocular. Después de retirar el segmento anterior, el cuerpo vítreo y la retina, preparar montajes planos de coroides y mientras tanto teñir con isolectina. Tomar fotografías con el sistema de microscopio de fluorescencia Zeiss y medir el área de la CNV. Los resultados se muestran en las Figuras 9A y 9B.
Puede verse en la Figura 9 que, el compuesto 2-2 (1 uM) obviamente podría inhibir la angiogénesis conoidea y, por lo tanto, podría tratar o aliviar efectivamente la degeneración macular húmeda.
Conclusión: Puede verse a partir de los ejemplos de prueba anteriores que los compuestos de la presente invención tienen un buen efecto contra la proliferación anormal de la angiogénesis, y este tipo de compuestos producen actividad mediante la inhibición de VEGFR2. Este tipo de compuestos puede usarse para tratar enfermedades, tales como la degeneración macular húmeda y similares, causadas por anomalías de la angiogénesis.
Ejemplo de prueba 4 La influencia de los compuestos de la presente invención sobre la quinasa 1) Estudio sobre el efecto de dosificación de inhibición
Los compuestos 2-1 y 2-2 se disolvieron en solvente DMSO al 100 %, respectivamente, se diluyeron a 3 grupos de concentración, y el DMSO está en una concentración del 1 % en todos los compuestos evaluados. La concentración más alta de los compuestos fue 50 |jM. Se usó como referencia un inhibidor de la actividad de la proteína quinasa no selectiva, Estaurosporina (compañía Sigma, EE. UU.), y su concentración más alta es de 1 j M. Véase la Tabla 2 para conocer la condición de prueba detallada, véase la Tabla 3A para ver el resultado de la prueba y véase la Tabla 3B y la Figura 10 para el resultado del cálculo del valor IC50. La Figura 10A muestra el resultado del grupo de control positivo, la Figura 10B muestra el resultado del grupo del compuesto 2-1 y la Figura 10C muestra el resultado del grupo del compuesto 2-2.
Tabla 2
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Tabla 3A Actividad de inhibición de los compuestos con diferentes concentraciones en KDR y PDGFR-p
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000019_0003
Tabla 3B La actividad inhibidora sobre KDR y PDGFR-p (IC50)
Figure imgf000019_0002
Puede verse por el resultado que los compuestos 2-1 y 2-2 de la presente invención tienen una buena actividad inhibidora sobre KDR y PDGFR-p, en donde el efecto del compuesto 2-2 es mejor que el del control positivo Estaurosporina.
2) Estudio sobre la especificidad de la inhibición
En este experimento, se realizaron pruebas de inhibición de la actividad en 22 quinasas para los compuestos 2-1 y 2-2, en donde la concentración de prueba es 5000 nM, con dos repeticiones. El compuesto a evaluar se disolvió en primer lugar en DMSO al 100 %, la concentración de disolución es 100 veces la concentración de prueba final y, por tanto, la concentración de DMSO en la solución a evaluar en todas las pruebas finales es del 1 %. SB-202191 se usó como control para P38-a, Wortmannina se usó como control para PI3K-a, inhibidor de la actividad de la proteína quinasa no selectiva, la Estaurosporina se usó como control para la otra proteína quinasa, y la concentración de prueba es de 10 uM.
La Tabla 4 muestra el método de prueba y los reactivos específicos.
Tabla 4
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Tabla 5 La velocidad de inhibición promedio de las dos pruebas del compuesto 2-1 en las quinasas
Figure imgf000020_0002
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Tabla 6 La velocidad de inhibición promedio de las dos pruebas del compuesto 2-2 en las quinasas
Figure imgf000021_0002
Se puede ver en el resultado de la prueba anterior que, tanto los compuestos 2-1 como 2-2 pueden inhibir selectiva y eficientemente la proteína quinasa KDE, la velocidad de inhibición del compuesto 2-1 es más del 97 % y la velocidad de inhibición del compuesto 2-2 alcanza el 100 %. Adicionalmente, estos compuestos también tienen un cierto efecto de inhibición sobre varias otras proteína quinasas asociadas con enfermedades tales como inflamaciones, tumores y similares, en donde el compuesto 2-1 tiene una velocidad de inhibición de aproximadamente 72 % en KIT y aproximadamente 71 % en PDGFR-p; adicionalmente, hasta cierto punto, el compuesto 2-1 también inhibe AURORA-B (con una velocidad de inhibición de aproximadamente el 31 %), FGFR2 (aproximadamente el 36 %), SRC (aproximadamente el 21 %) y JAK2 (aproximadamente el 21 %), y la mayoría de las velocidades de inhibición de las otras quinasas son inferiores al 5 %. El compuesto 2-2 tiene una velocidad de inhibición superior al 61 % en FGFR2, aproximadamente 97 % en PDGFR-p, aproximadamente 92 % de KIT, aproximadamente 80 % en P38-a, aproximadamente 65 % en SRC, pero la mayoría de las velocidades de inhibición del resto de quinasas son inferiores al 5 %.
Se puede ver que, en comparación con los inhibidores de quinasas de molécula pequeña investigados y desarrollados existentes, los compuestos de la presente invención tienen un efecto de inhibición específico y eficiente más alto sobre KDR, y también tienen un cierto efecto de inhibición sobre las proteínas quinasas tales como FGFR2, PDGFR-p y similares, que están estrechamente asociados con tumores e inflamaciones. Esto indica que ambos compuestos 2-1 y 2-2 tienen actividad terapéutica potencial sobre enfermedades tales como tumores, inflamaciones y degeneración macular, asociadas con varias proteínas quinasas activadas anormales tales como KDR, FGFR2 y similares.
Ejemplo de prueba 5 Estudio del efecto de inhibición sobre la angiogénesis corneal
La inflamación de la córnea, diversas quemaduras químicas, lesiones, heridas quirúrgicas y similares provocarán una angiogénesis patológica, y la angiogénesis corneal provocará una discapacidad visual grave. El modelo animal de lesión química de la córnea es un modelo ampliamente usado para el estudio farmacodinámico de enfermedades. A: Modelo de quemaduras químicas corneales de ratones
Esta prueba evaluó en total 5 ratones que tenían 2-3 meses de edad. Los ratones eran c57BL (Jax Lab, EE. UU.). En el centro de la córnea, se usa una barra con una solución de nitrato de plata al 75 % y nitrato de potasio al 25 % para inducir el modelo de quemadura química. Se inyectaron por vía subconjuntival 0,02 mL de compuesto 2-2 (una concentración de 100 j M) en el ojo derecho inmediatamente después de la quemadura química, y luego se vertieron 0,2 mL de compuesto 2-2 dos veces al día (una concentración de 100 j M); se usó PBS en el ojo izquierdo como control, y el ojo izquierdo se trató de la misma forma que el ojo derecho. Tomar fotografías de la córnea para compararlas 7 días después. Véase la Figura 11 para ver el resultado, en donde la Figura 11 muestra el resultado tratado con el compuesto 2-2, y la Figura 11B muestra el resultado tratado con PBS como un control negativo. Puede verse en la Figura 11 que el tratamiento con el compuesto 2-2 obviamente reduce la angiogénesis y el sangrado.
B: Modelo de quemaduras químicas corneales de conejo
Esta prueba evaluó en total 5 conejos blancos que tenían 5-6 meses de edad. Después de narcotizar, en el centro de la córnea, el ojo derecho se trató con un papel de filtro redondo de 6 mm de diámetro que se empapó con NaOH 0,1 M, se indujo durante 3 minutos para producir un modelo de quemaduras químicas. Se inyectaron por vía subconjuntival 0,1 mL 100 j M de compuesto 2-2 en el ojo derecho inmediatamente después de la quemadura química, y luego se vertieron 0,5 mL 100 j M de compuesto 2-2 dos veces al día; se usó PBS en el ojo izquierdo como control después de la modelación química, y el ojo izquierdo se trató de la misma forma que el ojo derecho. Tomar fotografías de la córnea para compararlas 7 días después. Véase la Figura 12 para el resultado, en donde la Figura 12A muestra el resultado tratado con el compuesto 2-2, y la Figura 12B muestra el resultado tratado con PBS como un control negativo, y la Figura 12C muestra el resultado tratado con el compuesto 2-1.
Puede verse en la Figura 12 que, tanto los tratamientos con compuestos 2-1 como con 2-2 obviamente reducen la angiogénesis corneal.
En resumen, los compuestos de la presente invención tienen un buen efecto contra la proliferación anormal de la angiogénesis, y este tipo de compuestos producen actividad mediante la inhibición de VEGFR2 (también denominado k Dr ). Este tipo de compuestos puede usarse para tratar enfermedades, tales como degeneración macular húmeda, inflamación, tumor maligno y similares, causadas por la proliferación anormal de la angiogénesis y anomalías de proteína quinasas tales como VEGFR2, FGFR2 y similares.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto representado por la Fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
Figure imgf000023_0001
en donde, Ri se selecciona de H, amino, hidroxi o sulfhidrilo, R2 se selecciona de H, amino, hidroxi, sulfhidrilo o -(CH2)nNHR8, en donde n=1-5, R8 es H o alquilo C1-3; R3 se selecciona de H o alquilo C1-6; R4, R5 y R6 se seleccionan cada uno independientemente de H, halógeno, alquilo C1-6 o alquilo sustituido con halógeno; y R7 se selecciona de H, alquilo C1-6 o halógeno;
o, R2 y R3 junto con el átomo de carbono que los conecta forman un anillo de 5 o 6 miembros sustituido o no sustituido que tiene de 1 a 2 heteroátomos, en donde los heteroátomos son N, O o S, y el sustituyente es alquilo C1-6.
2. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R2 se selecciona de H, amino o -(CH2)nNHR8, en donde n=1-3, R8 es H o alquilo C1-2; R3 se selecciona de H o alquilo C1-2; R4, R5 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de halógeno, alquilo C1-2 o alquilo sustituido con halógeno; y R7 se selecciona de H o halógeno;
o, R2 y R3 junto con el átomo de carbono que los conecta forman un anillo de 5 o 6 miembros sustituido o no sustituido que tiene 1 átomo de nitrógeno, en donde el sustituyente es alquilo C1-3, preferentemente, el halógeno es F o Cl.
3. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicación 2, en donde R2 se selecciona de amino o -(CH2)nNHR8; o, R2 y R3 junto con el átomo de carbono que los conecta forman un anillo de 5 o 6 miembros sustituido o no sustituido que tiene 1 átomo de nitrógeno, en donde el sustituyente es alquilo C1-3.
4. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicación 2, en donde al menos uno de R1, R2 y R3 es amino y el resto son H; R4, R5 y R6 son iguales y se seleccionan de F o Cl; y R7 es H.
5. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el compuesto es uno de los siguientes compuestos:
Figure imgf000023_0002
6. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-5 para usar en la inhibición de la proliferación anormal de la angiogénesis o en el tratamiento de enfermedades asociadas con la proliferación anormal de la angiogénesis, en donde las enfermedades se seleccionan del grupo que consiste en angiogénesis ocular, angiogénesis coroidea, degeneración macular húmeda, retinopatía diabética y glaucoma neovascular.
7. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable de acuerdo con las reivindicaciones 1-5 para usar en el tratamiento de enfermedades causadas por las proteína quinasas anormales seleccionadas del grupo que consiste en inflamación y tumores malignos.
8. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 7, en donde las proteína quinasas son VEGFR2, PDGFR-P, KIT, AURORA-B, FGFR2, SRC, JAK2 o P38-a, preferentemente es VEGFR2, KIT o PDGFR-p.
9. Una composición farmacéutica, que comprende una cantidad efectiva del compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la composición es una preparación oftálmica.
11. Un compuesto intermedio representado por la Fórmula II:
Figure imgf000024_0001
en donde R4, R5 y R6 se seleccionan cada uno independientemente de H, halógeno, alquilo C1-6 o alquilo sustituido con halógeno, R7 se selecciona de H, alquilo Cl-6 o halógeno.
12. Un compuesto intermedio como se reivindicó en la reivindicación 11, en donde R4, R5 y R6 se seleccionan cada uno independientemente de halógeno, alquilo C1-2 o alquilo sustituido con halógeno, R7 se selecciona de H o halógeno.
13. Un compuesto intermedio como se reivindicó en la reivindicación 12, en donde R4, R5 y R5 son iguales y se seleccionan de F o Cl; y R7 es H.
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