CN104278015B - 一株高效过表达内源虾青素合成酶基因的法夫酵母菌株 - Google Patents

一株高效过表达内源虾青素合成酶基因的法夫酵母菌株 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株过表达内源虾青素合成酶基因得到的法夫酵母高产虾青素基因工程菌株，通过游离质粒过表达虾青素合成酶基因crtS,获得了高产虾青素的法夫酵母基因工程菌株(MK19‑pGBKT7crtS)，将其定名为CSR19。该菌株表达的crtS基因前带有内源的核糖体结合位点序列(简称Rbs.序列)。经发酵培养并与受体菌株MK19相比，该工程菌株的虾青素产量提高了33.5％，且稳定性好，在饲料工业中具有良好的应用前景。

Description

一株高效过表达内源虾青素合成酶基因的法夫酵母菌株
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一株高效过表达内源虾青素合成酶基因的法夫酵母菌株及其应用。
背景技术
虾青素(化学名称：3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β-胡萝卜素)，分子式为C40H52O4，分子量为596.86。是一种在自然界中广泛存在的叶黄素类类胡萝卜素，一些藻类，细菌，真菌和浮游生物可以自身合成虾青素，而其他的高等生物如甲壳类，鱼类和鸟类则通过食物链摄取虾青素，继而储存在体内，使外观呈现红色，提高商业价值。
虾青素是类胡萝卜素合成的最高级别产物，因此在自然界，虾青素具有最强的抗氧化性，可以有效清除细胞内的氧自由基，在动物体内有抑制肿瘤发生、增强免疫机能的功能。
基于以上的特性，虾青素在水产养殖，医药，保健及化妆品领域具有广泛的应用。目前市场上的虾青素来源主要为化学合成，不仅价格昂贵，而且同天然虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面差别显著，由此对天然虾青素的需求正在增加。
法夫酵母属于担子菌门，杂担子菌纲，红法夫酵母属，可以利用多种碳源进行发酵，是一种具有工业化应用前景的虾青素产生菌株。为了提高其虾青素产量，申请人在前期通过高产菌株选育和发酵工艺优化等手段，获得了一株高产虾青素法夫酵母突变菌株MK19(菌种保藏号为CGMCC No.3445)，并确定了最适的培养方法，有效地提高了虾青素的合成效率。
虾青素合成酶(编码基因为crtS)是一种细胞色素P450单氧酶，在色素合成前体物质到终产物虾青素的转化过程中发挥作用。CrtS在细胞内的表达量多少对虾青素的产量具有重要影响。若能获得过表达虾青素合成酶基因crtS的的法夫酵母基因工程菌株，将极大地提高虾青素的产量，适应目前日益增长的工业生产需求。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种在法夫酵母中有效表达色素合成酶的游离质粒载体及其高效转化并稳定存在于法夫酵母的方法。
本发明的另一个目的是提供一种通过过表达虾青素合成酶基因而获得的高产虾青素的法夫酵母工程菌株及其培养方法。
为了实现以上目的，本发明从法夫酵母(Phaffia rhodozyma)菌株中克隆到虾青素合成酶(astaxanthin synthetase)基因crtS，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因全长为3302bp，GC含量为52.7％，其mRNA序列长度为1809bp，开放阅读框ORF长度为1674bp，包含18个外显子和17个内含子，编码由557个氨基酸组成的虾青素合成酶CrtS,其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。预测该蛋白分子量为62.6kD,等电点为5.67。CrtS属于细胞色素P450单氧酶家族中的3A亚家族，它与其他P450单氧酶家族的蛋白具有很高的相似度。包含有氧结合位点(339AGYETS344)，其中的G340and T343为保守残基。亚铁血红素结合域(488FISGPRACFG497)，以及参与稳定蛋白三维结构的保守结构域(394ESLR397)。
本发明选择的在法夫酵母中过表达crtS基因的质粒载体为pGBKT7，该质粒为游离型表达质粒，最初用于酿酒酵母菌。其组成型启动子PADH1可以启动下游融合蛋白的高效表达，并可通过2μ复制位点，在酵母中自主复制。该质粒对于酵母细胞具有较高的转化效率。
本发明从法夫酵母MK19中提取总RNA，通过反转录获得第一链cDNA,以cDNA为模板扩增获得包含起始密码子上游17bp核糖体结合位点序列的crtS基因，通过酶切连接反应将其***到pGBKT7质粒上，获得过表达虾青素合成酶CrtS的质粒载体pGBKT7-crtS(图1所示)。
通过以下步骤制备得到：
a)法夫酵母总RNA的提取
(1)取适量的法夫酵母(Phaffia rhodozyma)细胞，液氮研磨，加入1mlTrizol试剂(Invitrogen)，剧烈震荡5分钟,室温孵育5分钟；
(2)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15-30秒，室温孵育3分钟；
(3)4℃,12000rpm离心15分钟，样品会分为三层，将上层无色水相转移至新管中，再进行下一步操作；
(4)加入一倍体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟，4℃,12000rpm离心10分钟，弃掉上清；
(5)加1ml75％乙醇洗涤沉淀，4℃，7500rpm离心5分钟，弃掉上清；
(6)开盖，室温冰上干燥10分钟；
(7)加入适量的没有RNA酶的水溶解沉淀,得到总RNA溶液；b)法夫酵母cDNA第一链的制备
反转录采用由Promega公司生产的反转录酶(M-MLV)，具体操作步骤如下：
反应体系为25μl，将以下成分加到一个无核酸酶的离心管中：
总RNA 2μg
OligdT(0.5μg/μL) 2μL
70℃加热5分钟，解链，立即放冰上2分钟。
M-MLV buffer(5×) 5μL
M-MLV反转录酶(200U/μL) 1μL
dNTPs(10mM) 1.25μL
RNA酶抑制剂0.625 μL
RNase free water补至25 μL
42℃温浴60分钟，95℃加热5分钟终止反应，冷冻保存；c)引物设计
根据GenBank中crtS基因的序列(GenBank登录号为DQ002006)，设计合成克隆引物如下：
CRTSCPF：5’—AATGCCATGGCCACCTACTTTCTCCATATG—3’
CRTSCPR：5’—AACTGCAGGACGACGTAGAAGTCATAGC—3’
在克隆引物两端分别设计有NcoI和PstI酶切位点(见上述序列中斜体并有下划线的部分)
含核糖体结合位点的法夫酵母虾青素合成酶基因crtS的PCR扩增：用CRTSCPF、CRTSCPR为引物，以上述获得的法夫酵母cDNA为模板，扩增获得crtS的cDNA片段，PCR反应体系如下：
反应条件为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环；72℃5min；4℃2min。
d)从PCR反应产物中回收目的片段
从PCR产物中纯化回收目的基因片段采用切胶过柱的方法，PCR反应产物经过琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯的照射下切下目的基因DNA，目的基因长度为1809bp，按照DNA回收试剂盒(购自天根公司，产品编号为DP209-02)说明书的方法进行回收；
e)TA克隆
将PCR回收产物连接到载体pMD18-T-Simple上，连接反应按照TaKaRa公司所提供的试剂盒(Code No.D104A)说明书操作,构建得到质粒pMD18-T-crtS；
f)目的基因连接到酵母表达载体pGBKT7
用限制性内切酶NcoI和PstI分别对pMD18-T-crtS和pGBKT7进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4DNA连接酶将其连接，得到表达质粒pGBKT7-crtS，其图谱如图1所示。将其转化大肠杆菌DH5α(购自上海生工生物工程有限公司)中进行扩增，用菌落PCR的方法初步筛选正确转化子，再送invitrogn公司进行测序，结果表明目的基因crtS序列为SEQ IDNO.1所示的序列，其编码SEQ ID No.2所示的氨基酸。
本发明中上述重组质粒载体转化的宿主细胞是申请人前期构建的中温型高产虾青素法夫酵母突变菌株MK19，保藏号为CGMCC No.3445，参见中国专利CN101717731A。该菌株由野生型菌株JCM9042经过多轮NTG和Co60诱变筛选得到。其培养温度为25℃，摇瓶培养条件下，虾青素含量较原始出发菌株提高了17倍。
本发明中用到的构建法夫酵母基因工程菌株的电转化和筛选方法为：
1)将YPD培养基中过夜培养的法夫酵母种子按0.5％的接种量接种到100ml YPD培养基中，21℃,200rpm，培养至OD600值为1；
2)4℃,8000rpm，离心8分钟收集法夫酵母突变菌株MK19细胞，用13ml 50mM，pH值为7.0的磷酸钾缓冲液(包含25mM二硫苏糖醇)重悬细胞，21℃保温15分钟；
3)细胞用13ml STM缓冲液洗两次，最终重悬在0.8ml的STM缓冲液中；
(STM缓冲液：270mM蔗糖，10mM Tris HCl,pH7.5,1mM MgCl2)
4)将4μl(5μg/ul)的pGBKT7-crtS质粒DNA与80μl上述重悬细胞混合，放置冰上15分钟，之后转移至预冷的0.2cm电转杯中；
5)电转条件为：电压为2.0kV,脉冲长度为4ms，电极间距为0.2cm，立即加入预冷的1mlYPD培养基，复壮2.5小时。
6)复壮后的细胞分别以1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的稀释度涂布PDA平板，21℃培养4-5天后观察结果；
7)阳性转化子的验证：用液体YPD培养基培养转化子至对数中期，取1ml发酵液离心收集菌体，用玻璃珠法破碎细胞，用市售酵母菌质粒提取试剂盒提取质粒DNA,以此为模板，采用PCR的方法验证质粒的存在。正向引物CRTSIDF为T7启动子的测序引物，反向引物CRTSIDR位于crtS基因内部。
引物序列：CRTSIDF:GTAATACGACTCACTATAGGGCG
CRTSIDR:GAGGTAAAGACTGAAGAACGC
PCR反应体系如下：
质粒模板1μl
反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃20s，30个循环；72℃5min；4℃2min。
将构建好的pGBKT7-crtS质粒转入到法夫酵母菌株MK19中，获得了过表达虾青素合成酶基因的法夫酵母基因工程菌株(CSR19)。
由此，本发明还提供了利用上述法夫酵母基因工程菌株CSR19发酵生产虾青素的方法：
(1)种子活化：挑取CSR19菌苔接种至新鲜PDA斜面，21～25℃培养3～7天；
(2)液体种子活化：从步骤(1)的PDA斜面上挑取菌苔至液体种子培养基中，21～25℃，200-220rpm，培养2-4天；
上述液体种子以8％-12％的接种量第二次转接液体种子培养基，21～25℃，200-220rpm，培养液OD600＝9～12停止培养；
(3)发酵培养：步骤(2)的液体种子以4％-8％质量比接种至液体发酵合成培养基，21～25℃，200-220rpm，培养4-6天。
具体地，本发明利用法夫酵母基因工程菌株CSR19发酵生产虾青素的方法包括如下步骤：
(1)种子活化：从4℃保存PDA斜面挑取少量CSR19菌苔接种至新鲜PDA斜面，22℃培养5天；
(2)液体种子活化：从步骤(1)的新鲜PDA固体上挑取两环菌苔至30ml液体种子培养基，液体种子培养基装在300ml玻璃三角瓶中，22℃，210rpm，培养3天；
上述液体种子以10％的接种量第二次转接液体种子培养基，21℃，210rpm，培养36小时，培养液OD600＝9～12左右；
(3)发酵培养：上述液体种子以6％接种至液体发酵合成培养基，21℃，210rpm，培养5天。
所述的液体种子培养基，其配方为：36-44g葡萄糖，3.6-4.4g酵母粉，2.0-2.8g尿素，1.6-2.2g磷酸二氢钾，0.4-0.6g硫酸镁七水合物溶于蒸馏水，定容至1000ml，pH值为5.8-6.2。
优选地，所述液体种子培养基(g/L)：葡萄糖40.0g，酵母粉4.0g，尿素2.4g，磷酸二氢钾2.0g，七水合硫酸镁0.5g，定容至1000ml。
所述液体发酵合成培养基(g/L)：葡萄糖110.0g，尿素1.8g，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.1g，氯化钙0.1g，115℃高温蒸汽灭菌25分钟,向冷却的该培养基中补加过滤除菌的金属离子混合溶液和维生素混合溶液，添加浓度如下：
维生素混合溶液维生素添加浓度(μg/L)：
金属离子添加浓度(μg/L)：
本发明利用pGBKT7质粒为出发质粒，***含有自身核糖体结合位点序列的虾青素合成酶基因crtS，构建得到适于法夫酵母中游离表达的质粒载体pGBKT7-crtS。将该质粒电转到优势菌株MK19中，获得一株能够高效表达虾青素合成酶(CrtS)的基因工程菌株(MK19-pGBKT7crtS)，将其命名为CSR19。高表达的虾青素合成酶(CrtS)激活了色素合成途径中关键酶的高效表达，经发酵培养并与受体菌株MK19相比，该工程菌株的的虾青素产量提高了33.5％，且稳定性好，在饲料工业中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为过表达质粒pGBKT7-crtS的图谱。
图2为用PCR的方法验证从法夫酵母转化子中提取的质粒DNA电泳图。泳道1为DNA分子量标准(kb):4.5,3.0,2.0,1.2,0.8,0.50.2；泳道2为以电转前的质粒pGBKT7-crtS为模板扩增出的DNA片段；泳道3为以从阳性转化子中提取的质粒为模板扩增出的DNA片段。
图3为过表达虾青素合成酶的法夫酵母菌株CSR19与出发菌株MK19生物量比较图。
图4过表达菌株(CSR19)与出发菌株(MK19)虾青素产量的比较图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若无特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。所涉及的酶切、回收、连接、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。引物合成及测序由英骏(Invitrogen)生物公司完成。
实施例1 法夫酵母cDNA的制备
1.1 法夫酵母总RNA的提取
(1)取适量的培养至对数中期的法夫酵母(Phaffia rhodozyma)MK19细胞[公开于中国专利CN101717731A中]，液氮研磨，加入1mlTrizol试剂(Invitrogen)，剧烈震荡5分钟,室温孵育5分钟；
(2)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15-30秒，室温孵育3分钟；
(3)4℃,12000rpm离心15分钟，样品会分为三层，将上层无色水相转移至新管中，再进行下一步操作；
(4)加入一倍体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟，4℃,12000rpm离心10分钟，弃掉上清；
(5)加1ml75％乙醇洗涤沉淀，4℃，7500rpm离心5分钟，弃掉上清；
(6)开盖，室温冰上干燥10分钟；
(7)加入适量的没有RNA酶的水溶解沉淀,得到总RNA溶液。
1.2 法夫酵母cDNA第一链的制备
反转录采用由Promega公司生产的反转录酶(M-MLV)，具体操作步骤如下：
反应体系为25μl，将以下成分加到一个无核酸酶的离心管中：
总RNA 2μg
OligdT(0.5μg/μL) 2μL
70℃加热5分钟，解链，立即放冰上2分钟。
M-MLV buffer(5×) 5μL
M-MLV反转录酶(200U/μL) 1μL
dNTPs(10mM) 1.25μL
RNA酶抑制剂0.625 μL
RNase free water补至 25μL
42℃温浴60分钟，95℃加热5分钟终止反应，冷冻保存。
实施例2 含核糖体结合位点的法夫酵母虾青素合成酶基因crtS的获得及该基因表达质粒的构建
2.1 引物设计
根据GenBank中crtS基因的序列(GenBank登录号为DQ002006)，设计合成克隆引物如下：
CRTSCPF：5’—AATGCCATGGCCACCTACTTTCTCCATATG—3’
CRTSCPR：5’—AACTGCAGGACGACGTAGAAGTCATAGC—3’
在克隆引物两端分别设计有NcoI和PstI酶切位点(见上述序列中斜体并有下划线的部分)
2.2 含核糖体结合位点的法夫酵母虾青素合成酶基因crtS的PCR扩增
用CRTSCPF、CRTSCPR为引物，以上述获得的法夫酵母cDNA为模板，扩增获得crtS的cDNA片段，PCR反应体系如下：
反应条件为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环；72℃5min；4℃2min。
2.3 从PCR反应产物中回收目的片段
从PCR产物中纯化回收目的基因片段采用切胶过柱的方法，PCR反应产物经过琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯的照射下切下目的基因DNA，目的基因长度为1809bp，按照DNA回收试剂盒(购自天根公司，产品编号为DP209-02)说明书的方法进行回收。
2.4 TA克隆
将PCR回收产物连接到载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)，连接反应按照TaKaRa公司所提供的试剂盒(Code No.D104A)说明书操作,构建得到质粒pMD18-T-crtS。
2.5 目的基因连接到酵母表达载体pGBKT7
用限制性内切酶NcoI和PstI分别对pMD18-T-crtS和pGBKT7进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4DNA连接酶将其连接，得到表达质粒pGBKT7-crtS，其图谱如图1所示。将其转化大肠杆菌DH5α(购自上海生工生物工程有限公司)中进行扩增，用菌落PCR的方法初步筛选正确转化子，再送invitrogn公司进行测序，结果表明目的基因crtS序列为SEQ IDNO.1所示的序列(序列中第1-17个碱基为crtS基因的Rbs.序列)，其编码SEQ ID No.2所示的氨基酸。
实施例3 在法夫酵母MK19中过量表达虾青素合成酶促进虾青素产量的提高
3.1 法夫酵母MK19电转化感受态细胞的制备及其电击转化
1)将YPD培养基中过夜培养的法夫酵母种子按0.5％的接种量接种到100ml YPD培养基中，21℃,200rpm，培养至OD600值为1；
2)4℃,8000rpm，离心8分钟收集细胞，用13ml 50mM，pH值为7.0的磷酸钾缓冲液(包含25mM二硫苏糖醇)重新悬浮细胞，21℃保温15分钟；
3)细胞用13ml STM缓冲液洗两次，最终重悬在0.8ml的STM缓冲液中；
(STM缓冲液：270mM蔗糖，10mM Tris HCl,pH7.5,1mM MgCl2)
4)将4μl(5μg/ul)的质粒DNA与80μl上述重新悬浮细胞混合，放置冰上15分钟，之后转移至预冷的0.2cm电转杯中；
5)电转条件为：电压为2.0kV,脉冲长度为4ms，电极间距为0.2cm，立即加入预冷的1mlYPD培养基，复壮2.5小时。
6)复壮后的细胞分别以1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的稀释度涂布PDA平板，21℃培养4-5天后观察结果；
结果显示，几次电击转化的效率都在90％-100％
7)法夫酵母阳性转化子的验证：液体种子培养基培养转化子至对数中期，取1ml发酵液离心收集菌体，用玻璃珠法破碎细胞，用酵母质粒提取试剂盒提取其中的质粒DNA，因为细胞中的质粒DNA含量不高，后续需用PCR的方法验证质粒的存在。正向引物CRTSIDF为T7启动子的测序引物，反向引物CRTSIDR位于crtS基因内部。
所述的液体种子培养基，其配方为：所述液体种子培养基(g/L)：葡萄糖40.0g，酵母粉4.0g，尿素2.4g，磷酸二氢钾2.0g，七水合硫酸镁0.5g，定容至1000ml，pH值为6.0。
引物序列：CRTSIDF:GTAATACGACTCACTATAGGGCG
CRTSIDR:GAGGTAAAGACTGAAGAACGC
PCR反应体系如下：
反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃20s，30个循环；72℃5min；4℃2min。
3.2 阳性转化子的检测
(1)阳性转化子的培养
1)种子活化：从4℃保存PDA斜面挑取少量CSR19菌苔接种至新鲜PDA斜面，22℃培养5天；
2)液体种子活化：从步骤1)的新鲜PDA固体上挑取两环菌苔至30ml液体种子培养基，液体种子培养基装在300ml玻璃三角瓶中，22℃，210rpm，培养3天；
上述液体种子以10％的接种量第二次转接液体种子培养基，21℃，210rpm，培养36小时，培养液OD600＝9～12左右；
3)发酵培养：上述液体种子以6％接种至液体发酵合成培养基，21℃，210rpm，培养5天。
所述液体种子培养基(g/L)：葡萄糖40.0g，酵母粉4.0g，尿素2.4g，磷酸二氢钾2.0g，七水合硫酸镁0.5g，定容至1000ml。
所述液体发酵合成培养基(g/L)：葡萄糖110.0g，尿素1.8g，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.1g，氯化钙0.1g，115℃高温蒸汽灭菌25分钟,向冷却的该培养基中补加过滤除菌的金属离子混合溶液和维生素混合溶液，添加浓度如下：
维生素混合溶液维生素添加浓度(μg/L)：
金属离子添加浓度(μg/L)：
(2)生物量的测定方法
OD600吸光值：在无菌条件下，取发酵中的培养液1ml，选择合适的稀释度，用分光光度计(SHIMADZU,UVmini-1240)测定吸光值。
细胞干重：取30-50ml发酵液，4000rpm，离心10分钟，收集菌体沉淀，再用去离子水洗涤细胞两次，于105℃烘至恒重，计算出每升发酵液中的细胞干重，以g/L表示。结果为MK19细胞干重为18.888g/L，CSR19为25.798g/L。
(3)虾青素的提取及含量测定
虾青素的提取：
取1ml发酵液12000rpm离心1分钟收集菌体，用去离子水洗涤菌体2次，加入预热的二甲亚砜，剧烈震荡混匀，60℃水浴保温20分钟，加入提取液(甲醇：二氯甲烷＝3：1)1ml，静止数分钟，2000rpm离心1分钟，将上清转移至新管中，沉淀重复用二甲亚砜破壁提取至菌体为白色为止。
高压液相色谱法检测虾青素的含量：
上述提取物经高速离心后，用高效液相色谱检测，色谱柱为迪马钻石二代柱，填料C-18，dp5μm，柱长25cm，内径4mm；流动相为甲醇：水＝97：3，流速为1.0ml/min，检测波长为476nm，检测物的浓度根据标准品的标准曲线确定(以mg/L表示)。
4)过表达菌株稳定性的测定
每天转接阳性转化子于PDA斜面培养基,连续转接12代，经液体摇瓶培养,检测细胞生长、质粒及色素含量，发现细胞中过表达质粒稳定存在，且过表达蛋白及色素含量稳定。
将构建的得到的法夫酵母过表达虾青素合成酶的基因工程菌株(MK19-pGBKT7-crtS)在7.5升发酵罐培养，其生物量(细胞干重)积累和虾青素产量较出发菌株(MK19)分别提高了36.6％和33.9％，见图3、4。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一株高效过表达内源虾青素合成酶基因的法夫酵母菌株CSR19，含自身核糖体结合位点序列的法夫酵母虾青素合成酶CrtS，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，且该基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；
所述法夫酵母菌株CSR19的制备方法包括以下步骤：
1)将YPD培养基中过夜培养的法夫酵母种子按0.5％的接种量接种到YPD培养基中，21℃,200rpm，培养至OD600值为1；所述法夫酵母为高产虾青素法夫酵母突变菌株MK19，保藏号为CGMCC No.3445；
2)4℃,8000rpm，离心8分钟收集法夫酵母突变菌株MK19细胞，用13ml 50mM，pH值为7.0的磷酸钾缓冲液重悬细胞，21℃保温15分钟；所述磷酸钾缓冲液包含25mM二硫苏糖醇；
3)用13ml STM缓冲液洗细胞2次，最终重悬在0.8ml的STM缓冲液中；所述STM缓冲液配方为270mM蔗糖，10mM Tris HCl,pH7.5,1mM MgCl2；
4)将5μg/ul的pGBKT7-crtS质粒DNA4μl与80μl上述重悬细胞混合，放置冰上15min，之后转移至预冷的0.2cm电转杯中；电转条件为：电压为2.0kV，脉冲长度为4ms，电极间距为0.2cm，立即加入预冷的1mlYPD培养基，复壮2.5小时；
6)复壮后的细胞分别以1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的稀释度涂布PDA平板，21℃培养4-5天后观察结果；
7)阳性转化子的验证：液体种子培养基培养转化子至对数中期，取1ml发酵液离心收集菌体，用玻璃珠法破碎细胞，提取质粒DNA,以此为模板，采用PCR的方法验证质粒的存在：正向引物CRTSIDF为T7启动子的测序引物，反向引物CRTSIDR位于crtS基因内部，
引物序列：CRTSIDF:GTAATACGACTCACTATAGGGCG
CRTSIDR:GAGGTAAAGACTGAAGAACGC
20μlPCR反应体系如下：10×Buffer2μl，2×Taq mix 10μl，上下游引物各0.5μl，ddH2O6μl；
反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃20s，30个循环；72℃5min；4℃2min。
2.制备权利要求1所述法夫酵母菌株CSR19的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将YPD培养基中过夜培养的法夫酵母种子按0.5％的接种量接种到YPD培养基中，21℃,200rpm，培养至OD600值为1；所述法夫酵母为高产虾青素法夫酵母突变菌株MK19，保藏号为CGMCC No.3445；
2)4℃,8000rpm，离心8分钟收集法夫酵母突变菌株MK19细胞，用13ml 50mM，pH值为7.0的磷酸钾缓冲液重悬细胞，21℃保温15分钟；所述磷酸钾缓冲液包含25mM二硫苏糖醇；
3)用13ml STM缓冲液洗细胞2次，最终重悬在0.8ml的STM缓冲液中；所述STM缓冲液配方为270mM蔗糖，10mM Tris HCl,pH7.5,1mM MgCl2；
4)将5μg/ul的pGBKT7-crtS质粒DNA4μl与80μl上述重悬细胞混合，放置冰上15min，之后转移至预冷的0.2cm电转杯中；电转条件为：电压为2.0kV，脉冲长度为4ms，电极间距为0.2cm，立即加入预冷的1mlYPD培养基，复壮2.5小时；
6)复壮后的细胞分别以1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的稀释度涂布PDA平板，21℃培养4-5天后观察结果；
7)阳性转化子的验证：液体种子培养基培养转化子至对数中期，取1ml发酵液离心收集菌体，用玻璃珠法破碎细胞，提取质粒DNA,以此为模板，采用PCR的方法验证质粒的存在：正向引物CRTSIDF为T7启动子的测序引物，反向引物CRTSIDR位于crtS基因内部，
引物序列：CRTSIDF:GTAATACGACTCACTATAGGGCG
CRTSIDR:GAGGTAAAGACTGAAGAACGC
20μlPCR反应体系如下：10×Buffer2μl，2×Taq mix 10μl，上下游引物各0.5μl，ddH2O6μl；
反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃20s，30个循环；72℃5min；4℃2min。
3.权利要求1所述的法夫酵母菌株CSR19在制备虾青素中的应用。
4.利用权利要求1所述的法夫酵母菌株CSR19来发酵生产虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子活化：挑取CSR19菌苔接种至新鲜PDA斜面，21～25℃培养3～7天；
(2)液体种子活化：从步骤(1)的PDA斜面上挑取菌苔至液体种子培养基中，21～25℃，200-220rpm，培养2-4天；
上述液体种子以10％的接种量第二次转接液体种子培养基，21～25℃，200-220rpm，培养液OD600＝9～12停止培养；
(3)发酵培养：步骤(2)的液体种子以4％-8％质量比接种至液体发酵合成培养基，21～25℃，200-220rpm，培养4-6天。
5.含有权利要求1所述法夫酵母菌株CSR19的菌剂。
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