CN109097384B - 一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法 - Google Patents

一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法，属于基因工程技术领域。计算异戊二烯工程菌所有外源基因的翻译起始效率，根据外源基因的翻译起始效率选择一个或多个待优化的非限速酶基因，通过置换非限速酶的核糖体结合位点核苷酸序列调低非限速酶基因的翻译起始效率。本发明通过针对非限速酶的代谢工程手段，改变非限速酶的核糖体结合位点进而提高了异戊二烯工程菌的产量，具有很好的应用前景。

Description

一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程 菌产量的方法
技术领域
本发明涉及一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95%用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。目前，异戊二烯的来 源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法（包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法）和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。以可再生的生物质为原料，利用生物转化技术合成异戊二烯，因具有可持续性、环境友好、品质优异等优势，已成为国际上的研究热点。
生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸（MVA）途径和甲基赤藓糖-4-磷酸（MEP）途径。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。目前，将大肠杆菌中的MEP途径过表达，或者直接导入外源MVA途径，同时导入植物来源的异戊二烯合酶，通过发酵可以实现异戊二烯的生物合成。但是，要实现在工业上通过生物法生产异戊二烯，还需要进一步的深入研究。
在构建的异戊二烯工程菌中，从初始物质乙酰辅酶A到异戊二烯的合成涉及到8步反应，7个酶，包括来源于粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因MvaE和3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶MvaS、来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因 IDI1，以及来源于甘薯（Ipomoea batatas）的异戊二烯合酶IspSib。在代谢途径中，研究证明其中ERG12、IDII以及IspSib是限速酶，而MvaE、MvaS、ERG8、ERG19是非限速酶。这7个酶表达的平衡对于代谢流是非常重要的。为了能够实现代谢的平衡，防止中间产物的积累，提高异戊二烯产量，需要对限速酶进行优化，包括增加其表达量，提高其酶活性等。然而，非限速酶对于代谢平衡也有着重要的作用，非限速酶的过量表达能够导致中间产物过剩，代谢阻滞，严重影响工程菌产量。因此针对非限速酶的研究也是非常必要的。
发明内容
为了解决上述异戊二烯工程菌代谢阻滞的问题，提供了一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供了一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法，该方法是计算异戊二烯工程菌所有外源基因的翻译起始效率，外源基因包括限速酶基因和非限速酶基因，统计出所有翻译起始效率高于限速酶基因翻译起始效率的非限速酶，然后从中选择一个或多个非限速酶基因通过置换其核糖体结合位点核苷酸序列调低其翻译起始效率。
优选地，选择乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE通过用如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列置换其如SEQ ID NO.1所示的原始核糖体结合位点核苷酸序列来调低其翻译起始效率；或选择甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19通过用如SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列置换其如SEQ ID NO：4所示的原始核糖体结合位点核苷酸序列来调低其翻译起始效率。
更优选地，所述异戊二烯工程菌外源表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1和异戊二烯合酶基因IspS。
更优选地，所述异戊二烯合酶基因IspS为来源于甘薯（Ipomoea batatas）的异戊二烯合酶基因IspSib，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示或为来源于白杨（Populous alba）的异戊二烯合酶基因IspSpa，其Genebank登录号为BAD98243.1。
更优选地，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE和3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS来源于粪肠球菌（Enterococcus faecalis）；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；所述异戊二烯合酶基因IspS为来源于甘薯（Ipomoea batatas）的异戊二烯合酶基因IspSib或来源于白杨（Populous alba）的异戊二烯合酶基因IspSpa。
更优选地，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE的Genebank登录号为AAG02439；所述3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS的Genebank登录号为AAG02438；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12的Genebank登录号为855248；所述磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8的Genebank登录号为855260；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的Genebank登录号为100195467；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1的Genebank登录号为855986；所述异戊二烯合酶基因IspS为来源于甘薯（Ipomoea batatas）的异戊二烯合酶基因IspSib，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示或为来源于白杨（Populous alba）的异戊二烯合酶基因IspSpa，其Genebank登录号为BAD98243.1。
更优选地，所述异戊二烯工程菌以大肠杆菌（Escherichia coli）为宿主菌。
本发明还提供了上述任一所述方法构建的异戊二烯工程菌。
本发明还提供了一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点获得的高产异戊二烯工程菌，在宿主菌中外源表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1和异戊二烯合酶基因IspS；其中：所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19中任意一种基因的核糖体结合位点RBS序列发生以下了如下情况之一的改变：
（a）乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE的原始核糖体结合位点核苷酸序列被置换为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE的原始核糖体结合位点序如SEQ ID NO.1所示；
（b）甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的原始核糖体结合位点核苷酸序列被置换为如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的原始核糖体结合位点核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选地，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE的Genebank登录号为AAG02439；所述3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS的Genebank登录号为AAG02438；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12的Genebank登录号为855248；所述磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8的Genebank登录号为855260；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的Genebank登录号为100195467；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1的Genebank登录号为855986；所述异戊二烯合酶基因IspS为来源于甘薯（Ipomoea batatas）的异戊二烯合酶基因IspSib，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示或为来源于白杨（Populous alba）的异戊二烯合酶基因IspSpa，其Genebank登录号为BAD98243.1。
优选地，所述宿主菌为大肠杆菌（Escherichia coli）。
本发明还提供了上述任一高产异戊二烯工程菌在生物法合成异戊二烯中的应用。
本发明中异戊二烯合酶基因IspSib来源于甘薯（Ipomoea batatas），该基因通过优化后合成的异戊二烯合酶的酶活性较高且对底物DMAPP的亲和力高，可以提高异戊二烯的产量。
本发明有益效果：
本发明通过针对非限速酶的代谢工程手段，改变非限速酶的核糖体结合位点（RBS）提高了工程菌异戊二烯产量。
本发明通过优化非限速酶MvaE的RBS位点，将乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE的原始RBS序列MvaE-RBS0被置换为MvaE-RBS2，可降低MvaE的表达，解决了异戊二烯工程菌代谢阻滞的问题，提高了工程菌异戊二烯产量，异戊二烯产量可达643 mg/L，是采用MvaE的原始RBS序列构建的异戊二烯工程菌的异戊二烯产量的1.3倍，具有非常好的应用前景。
本发明通过优化非限速酶ERG19的RBS位点，将甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的原始RBS序列ERG19-RBS0被置换为ERG19-RBS2，可以降低ERG19的表达，解决了异戊二烯工程菌代谢阻滞的问题，提高了工程菌异戊二烯产量，异戊二烯产量可达698 mg/L，是采用ERG19的原始RBS序列构建的异戊二烯工程菌的异戊二烯产量的1.4倍，具有非常好的应用前景。
附图说明
图1为构建的异戊二烯工程菌的产量以及蛋白表达，其中：A是原始菌株中不同外源表达的基因的T.I.R.，灰色柱的高度代表T.I.R.值的大小；B是非限速酶MvaE的RBS序列改变之后相应菌株的异戊二烯产量以及相应菌株在诱导后0h、3h、6h的蛋白表达情况；C是非限速酶ERG19的RBS序列改变之后相应菌株的异戊二烯产量以及相应菌株在诱导后0h、3h、6h的蛋白表达情况，B和C中灰色的点代表T.I.R.值，其高低代表T.I.R.值的大小。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE和3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS来源于粪肠球菌（Enterococcus faecalis）；甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），异戊二烯合酶基因IspSib来源于甘薯（Ipomoea batatas）。所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE的Genebank登录号为AAG02439，3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS的Genebank登录号为AAG02438，甲羟戊酸激酶基因ERG12的Genebank登录号为855248，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8的Genebank登录号为855260，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的Genebank登录号为100195467，异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1的Genebank登录号为855986。异戊二烯合酶基因IspSib的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
实施例1：T.I.R.值的预测及不同RBS位点的选择
（1）T.I.R.值的预测
首先，利用在线软件RBS calculator（https://salislab.net/software/）对原始菌株LMJ11的外源表达的基因MvaE、MvaS、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1以及IspSib的T.I.R.值进行分析，结果如图1A所示，结果显示非限制酶MvaE和ERG19的T.I.R.值很高且高于限速酶ERG12、IDII和IspSib的T.I.R.值，因此为了代谢的平衡，计划改变其RBS序列，调低T.I.R.。
（2）不同RBS位点的选择
对于MvaE，其原始RBS序列（MvaE-RBS0，SEQ ID NO：1）预测的T.I.R.值为356.8kau，利用RBS calculator，设定低的T.I.R.值，在文库中筛选出T.I.R.值低的RBS序列，最终选择MvaE-RBS1（SEQ ID NO：2）和MvaE-RBS2（SEQ ID NO：3）进行进一步的验证，其T.I.R.值分别为5 kau 和 46 kau，具体结果见图1所示。
对于ERG19，其原始RBS序列（ERG19-RBS0，SEQ ID NO：4）预测的T.I.R.值为324.6kau，利用RBS calculator，设定低的T.I.R.值，在文库中筛选出T.I.R.值低的RBS序列，最终选择ERG19-RBS1（SEQ ID NO：5）和ERG19-RBS2（SEQ ID NO：6）进行进一步的验证，其T.I.R.值分别为1 kau 和 10 kau，具体结果见图1所示。
实施例2：表达载体的构建
（1）质粒pACY-MvaE-MvaS-IspSib的构建（对照质粒）
首先通过优化设计获得如SEQ ID NO.7所示的一种编码异戊二烯合酶的异戊二烯合酶基因IspSib，该基因来源于甘薯（Ipomoea batatas）。来自于甘薯（Ipomoea batatas）的异戊二烯合酶基因（IspSib）由金唯智公司化学合成至pUC-57载体上，获得pUC-IspSib载体。
以pUC-IspSib为模版，引物1IspSib-F和引物2IspS-R，聚合酶链式反应（PCR）扩增IspSib片段，其引物序列如下所示：
IspS-F（SEQ ID NO.8）：5’-GGAGATATACATATGAGTAGCGCCCAGAATC-3’
IspS-R（SEQ ID NO.9）：5’- GCCGGCAGATCTTTA -3’
PCR扩增体系如下所示：
Figure 273937DEST_PATH_IMAGE002
PCR程序为：94ºC 3 min；30 ×（94ºC 10 s，55ºC 30 s，72ºC 1 min）；72ºC 5min；4ºC ∞
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（碧云天，货号D0056）进行胶回收纯化。
利用限制性内切酶1Bgl II（Thermo，货号FD）和限制性内切酶2Nde I（Thermo，货号FD0583）同时双酶切pACY-MvaE-MvaS-IspSpa质粒（引用自Yang J, Xian M, Su S, ZhaoG, Nie Q, Jiang X, Zheng Y, Liu W. Enhancing production of bio-isoprene usinghybrid MVA pathway and isoprene synthase in E. coli. PLoS One.2012;7:e33509.）和PCR产物，其酶切体系为：
Figure 426963DEST_PATH_IMAGE004
酶切体系置于37 ºC孵育1h。进行胶回收纯化，利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：
Figure 3438DEST_PATH_IMAGE006
连接体系置于22 ºC孵育30 min。连接产物转化Escherichia coli DH5α感受态（唯地生物，货号DL1001），涂布到34 mg/mL氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pACY-MvaE-MvaS-IspSib再通过限制性酶切和测序进行鉴定。
（2）载体pA-M-ispSib-MvaE-RBS1和pA-M-ispSib-MvaE-RBS2的构建
以pACY-MvaE-MvaS-IspSib质粒为模版，分别以上游引物1MvaE-RBS1-F和引物1MvaE-RBS2-F，下游引物2MvaE-RBS-R，扩增MvaE-RBS1和MvaE-RBS2片段，其扩增体系同上所述，其引物序列如下所示：
MvaE-RBS1-F（SEQ ID NO.10）：
5’-GGAGATATACCATGGCGCCAACGAACATTTACTACAATAGAGGAGACCTAATGA
AAACAGTAGTTATTATTG -3’
MvaE-RBS2-F（SEQ ID NO.11）：
5’-GGAGATATACCATGGAACAACACGCATACAATAAAAGGAGGCAACACAAGGAT
GAAAACAGTAGTTATTATTG-3’
MvaE-RBS-R（SEQ ID NO.12）：5’- CTCGAATTCGGATCCTTATTG -3’
对PCR产物进行胶回收纯化。利用限制性内切酶1Nco I（Thermo，货号FD0573）和限制性内切酶2BamH I（Thermo，FD0054）同时双酶切pACY-MvaE-MvaS-IspSib质粒和PCR产物，双酶切体系同上，分别进行胶回收纯化，利用DNA连接酶进行连接，连接体系同上，连接产物转化Escherichia coli DH5α感受态，涂布到34 mg/mL 氯霉素的 LB 固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pA-M-ispSib-MvaE-RBS1和pA-M-ispSib-MvaE-RBS2，再通过限制性内切酶酶切和测序进行鉴定。
（3）载体pT-EEI-ERG19-RBS1和pT-EEI-ERG19-RBS2的构建
以pTrc-low质粒（引用自Yang J, Xian M, Su S, Zhao G, Nie Q, Jiang X,Zheng Y, Liu W. Enhancing production of bio-isoprene using hybrid MVA pathwayand isoprene synthase in E. coli. PLoS One.2012;7:e33509.）为模版，分别以上游引物1ERG19-RBS1-F和引物1ERG19-RBS2-F，下游引物2ERG19-RBS-R，扩增ERG19-RBS1和ERG19-RBS2片段，，其扩增体系同上所述，其引物序列如下所示：
ERG19-RBS1-F（SEQ ID NO.13）：
5’-GATAAATAACTCGAGATCGATTATACCGGACAACAGCAAGGATATTAGGATGACC
GTTTACACAGCATC-3’
ERG19-RBS2-F（SEQ ID NO.14）：
5’- GATAAATAACTCGAGTAACGTACGGTACCAGATTAATAGGAGGCTCGAATGACC
GTTTACACAGCATC-3’
ERG19-RBS-R（SEQ ID NO.15）：5’- ATTTTTTTTGAGCTCCTAAGGGCG-3’
对PCR产物进行胶回收纯化。利用限制性内切酶1Sac I（Thermo，货号FD1133）和限制性内切酶2Xho I（Thermo，货号FD0694）同时双酶切pTrc-low质粒和PCR产物，双酶切体系同上，分别进行胶回收纯化，利用DNA连接酶进行连接，连接体系同上，连接产物转化Escherichia coli DH5α感受态，涂布到100 mg/mL氨苄青霉素的 LB 固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pT-EEI-ERG19-RBS1和pT-EEI-ERG19-RBS2，再通过限制性内切酶酶切和测序进行鉴定。
实施例3：重组菌株的构建
（1）LMJ11重组菌株的构建（对照菌株）
将pACY-MvaE-MvaS-IspSib重组质粒和pTrc-low共转化Escherichia BL21(DE3)感受态细胞，涂布到34 mg/mL氯霉素和100 mg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有载体pACY-MvaE-MvaS-IspSib和载体pTrc-low的工程大肠杆菌LMJ11做为对照菌株。
（2）LMJ19和LMJ20重组菌株的构建
将pA-M-ispSib-MvaE-RBS1和pA-M-ispSib-MvaE-RBS2分别与pTrc-low共转化Escherichia BL21(DE3) 感受态细胞，涂布到34 mg/mL氯霉素和100 mg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此分别获得工程大肠杆菌LMJ19和LMJ20。
（3）LMJ21和LMJ22重组菌株的构建
将pT-EEI-ERG19-RBS1和pT-EEI-ERG19-RBS2分别与pACY-MvaE-MvaS-IspSib质粒共转化Escherichia BL21(DE3) 感受态细胞，涂布到34 mg/mL氯霉素和100 mg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此分别获得工程大肠杆菌LMJ21和LMJ22。
实施例4：工程菌的发酵培养
挑取实施例3获得的工程大肠杆菌LMJ11、LMJ19、LMJ20、LMJ21和LMJ22的单菌落分别接种在3 ml含有34 mg/mL氯霉素和100 mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37ºC摇床过夜培养活化。转接至100 ml发酵培养基中进行扩大培养，培养至OD600为0.6-0.8，IPTG诱导，于30ºC摇床培养48 h，取顶空气体1 ml，利用气相色谱进行产物异戊二烯的检测。
结果表明，本发明构建的异戊二烯工程菌LMJ20（mvaE的原始RBS序列MvaE-RBS0被置换为MvaE-RBS2）的异戊二烯产量可达643 mg/L，是对照菌株LMJ11（mvaE采用原始RBS序列，未发生置换）的异戊二烯产量的1.3倍，异戊二烯工程菌LMJ22（ERG19的原始RBS序列ERG19-RBS0被置换为ERG19-RBS2）的异戊二烯产量可达698 mg/L，是对照菌株LMJ11（ERG19采用原始RBS序列，未发生置换）异戊二烯产量的1.4倍，具体结果见图1B和1C。
实施例5：SDS-PAGE检测蛋白表达情况
在实施例4所述的发酵培养过程中，分别在诱导后3h、6h取样，用于SDS-PAGE分析。菌液在5000 × g，4ºC，离心15 min，弃上清液，用磷酸缓冲液（PBS）洗涤两次，最后用10 mLwestern/IP细菌裂解液（碧云天，货号P0013）重悬，置于冰上。将置于冰上的细菌裂解液8000 × g，4ºC，离心20-30 min，收集上清并置于冰水浴或冰上。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，货号P0012S）测定样品的蛋白总浓度，调整使蛋白浓度相同。分别取10 μL样品，加入10 μL 蛋白上样缓冲液（2×）（碧云天，货号P0015B），沸水煮5 min。使用SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒（碧云天，货号P0012AC）配置分离胶12%的凝胶。加入20 μL的样品进行电泳，电泳结束后，使用染色液和脱色液进行染色和脱色，最后进行成像。具体结果如图1B和图1C所示。
结果表明，置换RBS序列后，MvaE和ERG19蛋白的表达情况与异戊二烯产量变化是相对应的。对于ERG19，选取ERG19-RBS1时，其T.I.R.值降低至1 kau，此时ERG19的表达降低至检测不到，说明此菌株中ERG19的表达量可能不够，影响代谢平衡，可能最终导致异戊二烯产量少量升高至557mg/L，当选取ERG19-RBS2时，其T.I.R.值降低至10 kau，此时ERG19的表达相比于对照菌株降低，可能促进代谢的平衡，此时异戊二烯产量提高至698 mg/L。对于MvaE，选取MvaE-RBS1时，其T.I.R.值降低至5kau，但此时MvaE的表达由SDS-PAGE检测结果可知实际上提高很多，可能严重导致菌株内的代谢不平衡，导致此时异戊二烯产量降低至351mg/L，当选取MvaE-RBS2时，其T.I.R.值降低至46 kau，此时MvaE的表达相比于对照菌株降低，可能促进代谢的平衡，此时异戊二烯产量提高至643mg/L。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法
<130> 1
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成MvaE-RBS0
<400> 1
aggaggtaaa aaaac 15
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成 MvaE-RBS1
<400> 2
cgccaacgaa catttactac aatagaggag accta 35
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成 MvaE-RBS2
<400> 3
aacaacacgc atacaataaa aggaggcaac acaagg 36
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成 ERG19-RBS0
<400> 4
aaggaggaaa aaaaa 15
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成 ERG19-RBS1
<400> 5
atcgattata ccggacaaca gcaaggatat tagg 34
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成 ERG19-RBS2
<400> 6
taacgtacgg taccagatta ataggaggct cga 33
<210> 7
<211> 1647
<212> DNA
<213> 异戊二烯合酶基因IspSib
<400> 7
atgagtagcg cccagaatca ggaaaccgcc cgtcgcagtg ccaactacca gccgagtagc 60
tggagttatg atgaatatct ggttgatacc accacaaatg atagcaaact gcgtatccag 120
gaagatgccc gcaagaagct ggaagaagaa gtgcgcaatg tgctggaaga cggtaaactg 180
gagaccctgg ccctgctgga actgattgat gacatccagc gtctgggtct gggctataag 240
ttccgtgaga gcaccagcac cagcctggca atgttaaaga tgagcgtggg tcaggaagcc 300
agcaatagta gcttacatag ctgtagtctg tactttcgtc tgctgcgcga acatggcttt 360
gacattaccc cggatgtgtt tgaaaaattt aaagatgaaa atggcaaatt caaagacagc 420
attgccaagg atgtgcgcgg tctgctgagc ctgtatgagg ccagctttct gggttttgaa 480
ggcgagaaca tcctggacga agcccgtgag ttcaccacca tgcatctgaa taatattaaa 540
gacaaggtta acccgcgcat tgccgaagag gttaatcacg ccctggagct gccgctgcat 600
cgtcgtgttg aacgcctgga agcccgccgt cgcattcaga gctacagcaa gagtggcgag 660
accaaccagg cactgctgac cctggccaag atcgacttta acaccgttca ggccgtgtat 720
cagcgcgatt tacaagacgt tagcaaatgg tggaaggata ccgccctggc agataagctg 780
agttttgccc gcgatcgtct gatggagagt ttcttctggg caatcggcat gagctacgac 840
cctcagcaca gcaaaagccg tgaggccgtt accaagacct tcaaactggt gaccgtgctg 900
gacgacgttt atgacgtgta tggcagcctg gatgagctgg aaaaattcac agcagccgcc 960
gagcgttggg acgttgacgc aattaaagac ttaccggact atatgaagtt atgttatctg 1020
agcctgttta acacagtgaa cgatctggca tacgacaccc tgaaggacaa aggtgagacc 1080
gtgatcccga tcatgaaaaa agcttgggct gatttactga aagccttctt acaagaagct 1140
cagtggatct acaacaagta caccccgacc tttgatgaat atttaaataa tgcccgcttt 1200
agcgtgagcg gctgcgttat gctggtgcat agctacttta ccacccagaa tatcaccaaa 1260
gaagctatcc acagtctgga aaactatcac gacctgctga tctggccgag cattgttttt 1320
cgcctggcca atgatctgag cagcagtaag gccgaaatcg aacgcggcga aaccgccaac 1380
agcattacct gctatatgaa cgagaccggc cagagcgaag aacaggcccg tgagcatatt 1440
agcaagctga ttgacgagtg tttcaagaaa atgaacaaag aaatgctggc aacaagcacc 1500
agtcctttcg aaaaaagctt tattgaaacc gccatcaatt tagcacgcat cgccctgtgt 1560
cagtatcagt acggcgatgc ccatagcgat cctgatgtgc gtgcccgtaa tcgtattgtt 1620
agcgttatta ttaatccggt tgaataa 1647
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> IspS-F
<400> 8
ggagatatac atatgagtag cgcccagaat c 31
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> IspS-R
<400> 9
gccggcagat cttta 15
<210> 10
<211> 72
<212> DNA
<213> MvaE-RBS1-F
<400> 10
ggagatatac catggcgcca acgaacattt actacaatag aggagaccta atgaaaacag 60
tagttattat tg 72
<210> 11
<211> 73
<212> DNA
<213> MvaE-RBS2-F
<400> 11
ggagatatac catggaacaa cacgcataca ataaaaggag gcaacacaag gatgaaaaca 60
gtagttatta ttg 73
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> MvaE-RBS-R
<400> 12
ctcgaattcg gatccttatt g 21
<210> 13
<211> 69
<212> DNA
<213> ERG19-RBS1-F
<400> 13
gataaataac tcgagatcga ttataccgga caacagcaag gatattagga tgaccgttta 60
cacagcatc 69
<210> 14
<211> 68
<212> DNA
<213> ERG19-RBS2-F
<400> 14
gataaataac tcgagtaacg tacggtacca gattaatagg aggctcgaat gaccgtttac 60
acagcatc 68
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> ERG19-RBS-R
<400> 15
attttttttg agctcctaag ggcg 24

Claims (5)

1.一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法，其特征在于，计算异戊二烯工程菌所有外源基因的翻译起始效率，外源基因包括限速酶基因和非限速酶基因，统计出所有翻译起始效率高于限速酶基因翻译起始效率的非限速酶，然后从中选择一个或多个非限速酶基因通过置换其核糖体结合位点核苷酸序列调低其翻译起始效率；
所述异戊二烯工程菌外源表达的基因及各基因的Genebank登录号或核苷酸序列如下所示：
乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE的Genebank登录号为AAG02439；
3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS的Genebank登录号为AAG02438；
甲羟戊酸激酶基因ERG12的Genebank登录号为855248；
磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8的Genebank登录号为855260；
甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的Genebank登录号为100195467；
异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1的Genebank登录号为855986；
异戊二烯合酶基因IspS为来源于甘薯（Ipomoea batatas）的异戊二烯合酶基因IspSib，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示或为来源于白杨（Populous alba）的异戊二烯合酶基因IspSpa，其Genebank登录号为BAD98243.1；
筛选得到的非限速酶基因为乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE或甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19；
改变非限速酶的核糖体结合位点的具体方法如下：
选择乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE通过用如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列置换其如SEQ ID NO.1所示的原始核糖体结合位点核苷酸序列来调低其翻译起始效率；或选择甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19通过用如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列置换其如SEQ ID NO：4所示的原始核糖体结合位点核苷酸序列来调低其翻译起始效率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异戊二烯工程菌以大肠杆菌（Escherichia coli）为宿主菌。
3.权利要求1或2任一所述方法构建的异戊二烯工程菌。
4.一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点获得的异戊二烯工程菌，其特征在于，在宿主菌中外源表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，所述基因的Genebank登录号为AAG02439，3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，所述基因的Genebank登录号为AAG02438，甲羟戊酸激酶基因ERG12，所述基因的Genebank登录号为855248，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，所述基因的Genebank登录号为855260，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，所述基因的Genebank登录号为100195467，异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，所述基因的Genebank登录号为855986，来源于甘薯（Ipomoea batatas）的异戊二烯合酶基因IspSib，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示或来源于白杨（Populous alba）的异戊二烯合酶基因IspSpa，其Genebank登录号为BAD98243.1；其中：所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19中任意一种基因的核糖体结合位点RBS序列发生以下了如下情况之一的改变：
（a）乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE的原始核糖体结合位点核苷酸序列被置换为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE的原始核糖体结合位点序如SEQ ID NO.1所示；
（b）甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的原始核糖体结合位点核苷酸序列被置换为如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的原始核糖体结合位点核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.权利要求4所述的异戊二烯工程菌在生物法合成异戊二烯中的应用。
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