CN108060114A - 一种发酵生产l-丙氨酸的大肠杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵生产L‑丙氨酸的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明在能够发酵生产富马酸的大肠杆菌中引入天冬氨酸酶AspA和L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶AsD，进一步过量表达YgaW基因强化了重组菌中L‑丙氨酸的转运能力，构建了可以利用葡萄糖发酵生产L‑丙氨酸的新型菌种，利用该重组菌株在发酵罐中发酵45h，L‑丙氨酸产量达到147g/L，糖酸转化率79.0％。

Description

一种发酵生产L-丙氨酸的大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种发酵生产L-丙氨酸的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-丙氨酸是一种非必需氨基酸，也是人体血液中含量最高的氨基酸，在L-丙氨酸在工业、日化、食品等领域用途广泛。在日化领域，L-丙氨酸是合成氨基酸表面活性剂的重要原料，在食品领域，L-丙氨酸可以作为天然甜味剂对改善调味剂的味感和有机酸的酸。在医药领域，L-丙氨酸也是合成维生素B6和氨基丙醇的主要原料。

L-丙氨酸的生产工艺包括提取法、化学合成法、酶催化法和发酵法。目前工业生产上主要采用酶催化法，即通过培养富有L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD(EC4.1.1.12)活力的微生物细胞，催化L-天冬氨酸得到L-丙氨酸。酶法转化工艺的特点是酶活力高，设备要求简易，提取工艺简单，但野生型微生物培养生产AsD需要以富马酸或谷氨酸钠为碳源，生长周期长、且培养成本高，同时主要原材料L-天冬氨酸价格高，造成其生产成本高。徐友强等通过克隆来源于***丛毛单胞菌(Comonas testosteroni)的asD基因，在一株具有L-天冬氨酸酶(AspA)生产能力的大肠埃希氏菌CICC11022S中异源表达，构建转化富马酸生产L-丙氨酸的重组工程菌，重组菌9h转化富马酸产生112.7g/L的L-丙氨酸，转化率93.8％。该方法以大Escherichia coli为酶源菌株和富马酸为底物，生产的原料成本显著降低，但是富马酸是经石油炼制生产的，其价格受困于原油价格，同时石油资源日渐短缺且不可再生。张学礼等利用基因工程手段删除L-丙氨酸合成的关键5条竞争途径，过量表达限速步骤酶L-丙氨酸脱氢酶，强化丙酮酸向L-丙氨酸的生产路径，构建大肠杆菌重组菌，以葡萄糖为原料，自来水配制培养基，发酵48h可以生产114g/L L-丙氨酸。发酵原料葡萄糖廉价易得，培养基成分简单，厌氧发酵动力消耗低，产品收率高。目前构建L-丙氨酸生产菌株的构建方法单一，涉及多条竞争路径，基因工程操作复杂。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过大肠杆菌发酵生产富马酸，利用天冬氨酸酶AspA转化为天冬氨酸，进一步利用L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD转化天冬氨酸生产L-丙氨酸，构建了高效生产L-丙氨酸的新型菌种。

本发明的第一个目的是提供一种大肠杆菌重组菌，所述大肠杆菌重组菌是通过在能够产富马酸的大肠杆菌中，过表达天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD。

在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD通过核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的RBS1相连接。

在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸酶AspA编码基因aspA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD编码基因asD的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述产富马酸的大肠杆菌为大肠杆菌CICC.23846。

在本发明的一种实施方式中，通过pEtac质粒串联表达所述天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌重组菌在L-丙氨酸转运蛋白AlaE编码基因YgaW上游整合了组成型启动子J23119。

在本发明的一种实施方式中，所述L-丙氨酸转运蛋白AlaE编码基因YgaW的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供所述大肠杆菌重组菌的构建方法，所述方法具体是：

(1)使用pEtac质粒，以核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的RBS1作为连接肽，串联表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的天冬氨酸酶AspA和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD，构建重组质粒pETac-aspA-asD；

(2)将重组质粒pETac-aspA-asD导入大肠杆菌CICC.23846中；

(3)在核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的L-丙氨酸转运蛋白AlaE基因上游离整合组成型启动子J23119，再导入步骤(2)所述的重组菌中，获得重组大肠杆菌E.coli P-119。

本发明第三个目的是提供一种利用所述重组大肠杆菌E.coli P-119发酵生产L-丙氨酸的方法，所述方法具体是：将摇瓶种子3～5％接种量接种于发酵培养基，稀硫酸和氨水控制pH在6.8～7.2，通气量0.1～1vvm，温度34～36℃，搅拌80～120rpm，当OD600达到10～15时，加入2～3g/L乳糖诱导天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶的表达，发酵过程当葡萄糖浓度低于10～15g/L时，补加500～700g/L葡萄糖溶液，每升发酵液补加20～40g葡萄糖，共补加2～6次，当葡萄糖消耗尽后结束发酵。

本发明的一种实施方式中，发酵培养基成分为：初始葡萄糖60～80g/L，酵母粉4～6g/L，胰蛋白胨1～3g/L，(NH₄)₂SO₄1～3g/L，K₂HPO₄·12H₂O 3～5g/L，KH₂PO₄3～5g/L，MgSO₄·7H₂O0.4～0.6g/L，一水合柠檬酸0.2～0.4g/L，MnCl₂·4H₂O 0.06～0.1g/L。

本发明的第四个目的是提供所述大肠杆菌重组菌在生产L-丙氨酸中的应用。

本发明的有益之处：

大肠杆菌做为最常用的细胞工厂，遗传背景清晰，在能够发酵生产富马酸的大肠杆菌中引入天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD，将发酵生产的富马酸直接转化为L-丙氨酸，进一步过量表达AlaE强化了重组菌中L-丙氨酸的转运能力，构建了可以利用廉价葡萄糖发酵生产L-丙氨酸的高产菌株，目前该生产路径目前尚无相关报道。

附图说明

图1：pEtac-aspA-asD共表达质粒的构建。

具体实施方式

下述实施例中，都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得。

下述实施例中，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)为出发菌株，购自于CICC，编号23846，也适用于其他可以生产富马酸的大肠杆菌。

氨基酸检测采用常规的高效液相色谱检测。

天冬氨酸酶AspA酶活检测：将27mL浓度约为180g/L的富马酸氨水(pH＝8.5)溶液37℃预热，分别称取0.5g左右的湿菌体于250mL锥形瓶中，加入0.09gCTAB粉末和2.5mL离子水，加入预热的转化液中，保鲜膜封口后置于37℃、200rpm的摇床中反应15min。反应完成后，取适量反应液快速离心稀释进行液相检测。

L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD酶活检测：将15mL浓度为30g/L的天冬氨酸溶液(用氢氧化钠溶液调节pH 7.0)37℃预热，分别称取1g左右诱导12h的湿菌体于250mL锥形瓶中，加入0.09g CTAB粉末和14mL去离子水，加入预热的转化液中，保鲜膜封口后置于37℃、200rpm的摇床中反应15min。反应完成后，取适量反应液快速离心稀释进行液相检测。

酶活力单位(U)：每分钟生产1μmoL产物所需要的酶量定义为1个酶活单位。

葡萄糖测定方法：使用SBA-40生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)进行分析。

生产强度的计算：生产强度(g/L/h)＝L-丙氨酸产量(g/L)/发酵时间(h)。

实施例1：双酶共表达菌株的构建

(1)使用细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌K12和***丛毛单胞菌的基因组DNA；

(2)使用表1中引物AspA-up和AspA-down从大肠杆菌基因组DNA中克隆得到aspA基因，使用SacI和NotI双酶切连接于表达载体pETac,得到pETac-aspA；

(3)根据RBS强度与所调控蛋白表达量在统计学上的线性关系，设计RBS1、RBS2、RBS3、RBS4调节两酶的表达强度，使用引物AsD-up1和AsD-down、AsD-up2和AsD-down、AsD-up3和AsD-down、AsD-up4和AsD-down从***丛毛单胞菌的基因组DNA中克隆得到asD基因；

(4)将上述克隆得到的4段asD基因测序正确后，使用HindIII和NotI双酶切，分别连接于pETac-aspA质粒得到pETac-aspA-asD(如图1)，将质粒热击转化于大肠埃希氏菌CICC23846，得到重组菌株E.coli PAD；

(6)上述4株工程菌株使用LB培养基(100mg/L硫酸卡那霉素)，35℃培养10h，按照4％接种量接种于摇瓶发酵培养基中，OD600＝2.0时加入2g/L乳糖，继续培养，当葡萄糖消耗尽结束发酵，离心检测上清液中L-丙氨酸产量，收集菌泥检测酶活；

发酵培养基成分：初始葡萄糖60g/L，酵母粉3g/L，胰蛋白胨1g/L，(NH₄)₂SO₄2g/L，K₂HPO₄·12H₂O 4g/L，KH₂PO₄4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，一水合柠檬酸0.3g/L，MnCl₂·4H₂O0.08g/L。

(7)L-丙氨酸产量和酶活检测如结果如表2，在相同培养条件下，两基因间为RBS1序列时L-丙氨酸产量最高为37.6g/L，发酵结束时AspA和AsD酶活分别为301U/g和478U/g。

表1共表达质粒构建使用引物

表2重组菌发酵生产L-丙氨酸

实施例2：高产L-丙氨酸大肠杆菌的构建

利用Red同源重组的原理在YgaW基因组上游加入组成型启动子J23119(BBa23119)，强化AlaE蛋白表达，促进L-丙氨酸由胞内转化至胞外。

(1)利用软件Primer Premier 5设计同源重组引物(如表3)，以Kan-S、Kan-A为引物，pKD4为模板，扩增kan基因，以YgaW-S、YgaW-A为引物，大肠杆菌K12基因组为模板，扩增YgaW基因，采用融合PCR得到Kan+YgaW片段，连接至PMD19进行基因测序；

(2)以119-S和YgaW-A为引物，连接测序正确Kan+YgaW片段的PMD19质粒为模板，PCR得到带有同源臂、J23119启动子、Kan基因的敲除框；

(3)将pKD46质粒导入大肠杆菌CICC 23846中，制备电击感受态细胞，将敲除框片段电击转化于感受态细胞进行同源重组，筛选得到带有kan抗性的阳性克隆菌株；

(4)带有kan抗性的阳性克隆菌株43℃培养后使其丢失pKD46质粒，制备电击感受态细胞，电击转化质粒pCP20。转化液涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，30℃培养12h，筛选阳性转化子。

(5)转化子再转入43℃培养12h筛选氨苄青霉素和卡那霉素抗性同时缺失的重组菌，此时J23119启动子整合成功，将实施例1中构建共表达质粒pETac-aspA-asD(RBS1)导入重组菌，得到L-丙氨酸生产菌株E.coli P-119

(6)将上述工程菌株E.coli PAD RBS1和E.coli P-119按照实施例1中的方式培养，发酵结束检测发酵液中L-丙氨酸含量，发酵48h，E.coli P-119生产L-丙氨酸49.8g/L，相比于E.coli PAD RBS1的37.6g/L提高了32.4％。

表3YgaW基因构建J23119启动子使用引物

实施例3：E.coli P-119发酵生产L-丙氨酸

种子培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5.0g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L。

发酵培养基成分：初始葡萄糖70g/L，酵母粉5g/L，胰蛋白胨2g/L，(NH₄)₂SO₄2g/L，K₂HPO₄·12H₂O 4g/L，KH₂PO₄4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，一水合柠檬酸0.3g/L，MnCl₂·4H₂O0.08g/L。

从斜面挑取适量E.coli P-119接种于种子培养基中，35℃，200rpm振荡培养10～12h，摇瓶种子按照10％接种量接种于发酵罐中，5L发酵罐中培养基装液量为3L，稀硫酸和氨水控制发酵pH为6.8～7.2，通气量0.5vvm，温度35℃，搅拌100rpm，当OD600达到25～30时，加入2g/L乳糖诱导天冬氨酸酶和天冬氨酸-β-脱羧酶表达，当葡萄糖浓度低于10～15g/L时，补加600g/L葡萄糖溶液，每升发酵液补加60g葡萄糖，共补加2次，当葡萄糖消耗尽后结束发酵。

结果：发酵45h，L-丙氨酸产量达到122.0g/L，糖酸转化率64.2％。

实施例4：重组菌株E.coliΔ5D2发酵生产L-丙氨酸

种子培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5.0g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L。

发酵培养基成分：初始葡萄糖70g/L，酵母粉5g/L，胰蛋白胨2g/L，(NH₄)₂SO₄2g/L，K₂HPO₄·12H₂O 4g/L，KH₂PO₄4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，一水合柠檬酸0.3g/L，MnCl₂·4H₂O0.08g/L。

从斜面挑取适量E.coli P-119接种于种子培养基中，35℃，200rpm振荡培养10～12h，摇瓶种子按照4％接种量接种于发酵罐中，5L发酵罐中培养基装液量为3L，稀硫酸和氨水控制发酵pH为6.8～7.2，通气量0.5vvm，温度35℃，搅拌100rpm，当OD600达到10～15时，加入2g/L乳糖诱导天冬氨酸酶和天冬氨酸-β-脱羧酶表达，当葡萄糖浓度低于10～15g/L时，补加600g/L葡萄糖溶液，每升发酵液补加30g葡萄糖，共补加4次，当葡萄糖消耗尽后结束发酵。

结果：发酵45h，L-丙氨酸产量达到147g/L，糖酸转化率79.0％，实现L-丙氨酸的高效生产。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种发酵生产L-丙氨酸的大肠杆菌及其应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtcaaaca acattcgtat cgaagaagat ctgttgggta ccagggaagt tccagctgat 60

gcctactatg gtgttcacac tctgagagcg attgaaaact tctatatcag caacaacaaa 120

atcagtgata ttcctgaatt tgttcgcggt atggtaatgg ttaaaaaagc cgcagctatg 180

gcaaacaaag agctgcaaac cattcctaaa agtgtagcga atgccatcat tgccgcatgt 240

gatgaagtcc tgaacaacgg aaaatgcatg gatcagttcc cggtagacgt ctaccagggc 300

ggcgcaggta cttccgtaaa catgaacacc aacgaagtgc tggccaatat cggtctggaa 360

ctgatgggtc accaaaaagg tgaatatcag tacctgaacc cgaacgacca tgttaacaaa 420

tgtcagtcca ctaacgacgc ctacccgacc ggtttccgta tcgcagttta ctcttccctg 480

attaagctgg tagatgcgat taaccaactg cgtgaaggct ttgaacgtaa agctgtcgaa 540

ttccaggaca tcctgaaaat gggtcgtacc cagctgcagg acgcagtacc gatgaccctc 600

ggtcaggaat tccgcgcttt cagcatcctg ctgaaagaag aagtgaaaaa catccaacgt 660

accgctgaac tgctgctgga agttaacctt ggtgcaacag caatcggtac tggtctgaac 720

acgccgaaag agtactctcc gctggcagtg aaaaaactgg ctgaagttac tggcttccca 780

tgcgtaccgg ctgaagacct gatcgaagcg acctctgact gcggcgctta tgttatggtt 840

cacggcgcgc tgaaacgcct ggctgtgaag atgtccaaaa tctgtaacga cctgcgcttg 900

ctctcttcag gcccacgtgc cggcctgaac gagatcaacc tgccggaact gcaggcgggc 960

tcttccatca tgccagctaa agtaaacccg gttgttccgg aagtggttaa ccaggtatgc 1020

ttcaaagtca tcggtaacga caccactgtt accatggcag cagaagcagg tcagctgcag 1080

ttgaacgtta tggagccggt cattggccag gccatgttcg aatccgttca cattctgacc 1140

aacgcttgct acaacctgct ggaaaaatgc attaacggca tcactgctaa caaagaagtg 1200

tgcgaaggtt acgtttacaa ctctatcggt atcgttactt acctgaaccc gttcatcggt 1260

caccacaacg gtgacatcgt gggtaaaatc tgtgccgaaa ccggtaagag tgtacgtgaa 1320

gtcgttctgg aacgcggtct gttgactgaa gcggaacttg acgatatttt ctccgtacag 1380

aatctgatgc acccggctta caaagcaaaa cgctatactg atgaaagcga acagtaa 1437

<210> 2

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列

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atgagcaagg attatcagag tctggcgaaa ttgagcccgt tcgagctcaa ggatgagttg 60

atcaagatcg cctcgagcga cggaaaccgc ctcatgctca atgcggggcg gggcaatccc 120

aactttctgg ccacaacgcc gagaagagca ttttttcgcc tgggcttgtt cgctgcagcc 180

gaatcggagc tttcctactc ttatatgaca acggtaggtg ttggcggact ggcgaagatc 240

gacgggattg agggtcgctt tgaacgttat atcgccgaga accgggatca ggagggcgtg 300

cgctttctcg gtaaatcact gagctatgtc cgtgaccagc tgggcttgga cccggccgcc 360

ttcctgcacg aaatggttga cggtattctg ggctgcaatt accccgttcc cccgcggatg 420

ctgaacatca gtgaaaaaat cgtacgccag tacatcatcc gggaaatggg ggccgatgca 480

atacccagtg agtccgtgaa cctgtttgca gtcgaagggg gaacggctgc catggcttac 540

attttcgaga gcctgaagct caacggtttg ctcaaggccg gcgacaaggt tgccattggg 600

atgccggttt tcacgccgta tatagaaatt ccggagctgg cccagtacgc actggaggaa 660

gtcgccatca acgcggatcc gagcctcaat tggcagtatc cggactctga gctggacaag 720

ctcaaggacc cggccatcaa gatctttttc tgcgtcaacc ccagcaatcc gccttcggtg 780

aagatggatc agcgaagtct ggaacgcgtg cgcaacatcg ttgcagaaca tcgtccggat 840

ctgatgatcc tgaccgacga tgtctatgga acttttgcag atgacttcca gtctctcttc 900

gcgatttgcc cggaaaatac gcttctggtc tactcattct ccaaatactt tggcgccact 960

ggctggcgtt tgggggtcgt ggccgctcat caacaaaatt aa 1002

<210> 3

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

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atgttctcac cgcagtcacg cttgcgtcat gcagttgcag atacgttcgc gatggttgtt 60

tactgttctg tcgtgaacat gtgtattgaa gttttcctct ccggaatgag cttcgaacag 120

tctttttatt ccagattggt agcgattccg gtgaacatct taattgcatg gccatacggt 180

atgtaccgtg atctgtttat gcgcgcggca cgcaaagtta gcccgtcggg ctggataaaa 240

aatctggcgg atatcctggc ttatgtgacg ttccagtcac cggtgtatgt ggcgatcttg 300

ttagtggtgg gcgcagactg gcatcagatt atggcggcgg tcagttcaaa catcgttgtt 360

tcgatgttga tgggggcggt ttatggctac ttcctcgatt attgccgccg actgtttaaa 420

gtcagccgtt accagcaggt aaaagcctga 450

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttaaggagga attcttatga gcaaggatta tcagagt 37

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgcgtcgac atgtcaaaca acattcgtat cgaag 35

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aaatatgcgg ccgcgaattc aagcttttac tgttcgcttt catcagt 47

<210> 7

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<212> DNA

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cccaagcttt taaggaggaa ttcttatgag caaggattat cagagt 46

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cccaagcttg attaaagagg agaaatacca tatgagcaag gattatcaga gt 52

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cccaagcttg tcacacagga aacctaccat atgagcaagg attatcagag t 51

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cccaagcttc gcttaaggag gatctacatt cttatgagca cgtcagacga atgagcaagg 60

attatcagag t 71

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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catctccatt aacatcccat tacgctttta ttaaggagca ttagcgtgta ggctggagct 60

gcttc 65

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gctagcatta tacctaggac tgagctagct gtcaacatat gaatatcctc cttag 55

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcgaatt cattaaagag gagaaaggta 60

ccatgttctc accgcagtca 80

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcaggctttt acctgctgg 19

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

catctccatt aacatcccat tacg 24

Claims (10)

1.一种大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌重组菌是通过在能够产富马酸的大肠杆菌中，过表达天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD通过核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的RBS1相连接。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述天冬氨酸酶AspA编码基因aspA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD编码基因asD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述产富马酸的大肠杆菌为大肠杆菌CICC.23846。

5.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，通过pEtac质粒串联表达所述天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD。

6.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌重组菌在L-丙氨酸转运蛋白AlaE编码基因YgaW上游整合了组成型启动子J23119。

7.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述L-丙氨酸转运蛋白AlaE编码基因YgaW的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.一种利用权利要求1所述的大肠杆菌重组菌发酵生产L-丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法具体是：将摇瓶种子3～5％接种量接种于发酵培养基，稀硫酸和氨水控制pH在6.8～7.2，通气量0.1～1vvm，温度34～36℃，搅拌80～120rpm，当OD600达到10～15时，加入2～3g/L乳糖诱导天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶的表达，发酵过程当葡萄糖浓度低于10～15g/L时，补加500～700g/L葡萄糖溶液，每升发酵液补加20～40g葡萄糖，共补加2～6次，当葡萄糖消耗尽后结束发酵。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，发酵培养基成分为：初始葡萄糖60～80g/L，酵母粉4～6g/L，胰蛋白胨1～3g/L，(NH₄)₂SO₄ 1～3g/L，K₂HPO₄·12H₂O 3～5g/L，KH₂PO₄ 3～5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4～0.6g/L，一水合柠檬酸0.2～0.4g/L，MnCl₂·4H₂O 0.06～0.1g/L。

10.权利要求1所述的大肠杆菌重组菌在生产L-丙氨酸中的应用。