CN104277136A - 黄河滩枣多糖、其提取精制方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄河滩枣多糖、其提取精制方法及应用。其提取精制方法为将大枣去核处理后得到枣粉，脱脂和水提醇沉得到大枣粗多糖，粗多糖经过脱蛋白、脱色后得到精制枣多糖。本发明提取精制大枣多糖的工艺先进，方法简单，能耗较低，为枣的深加工提供了便利条件。本发明还提供了该黄河滩枣多糖的应用，药理活性实验表明，根据本发明所述的方法制备的大枣多糖具有抗氧化性、清除自由基、抗癌、提高免疫力及保肝的功效，可用于制备用于预防肝损伤的药物、食品和/或保健品。

Description

黄河滩枣多糖、其提取精制方法及应用

技术领域

本发明涉及一种黄河滩枣多糖、其提取精制方法及应用，属于医药技术领域。

背景技术

大枣为鼠李科枣属植物枣树的果实，主产于中国，至今已有4000多年的栽培历史。如今在东亚、南亚、欧洲、非洲以及澳大利亚均有分布。大枣的果实具有极高的营养价值，在亚洲地区常被用作食物，食品添加剂和调味剂。据文献报道，大枣除了含有水分、纤维素和多种维生素外，还含有三萜酸、黄酮类物质、氨基酸、酚酸、微量矿物元素和多糖。大枣还具有医疗保健作用，是一味传统中药，用于治疗食欲不振，疲劳乏力和便溏。

时至今日，在中国已经发现了7000多种枣类，种植面积超过1500000公顷。仅2013年一年，鲜枣的产量超过400,000吨。黄河滩枣学名木枣，在黄河沿岸广泛种植，其特点是颗粒硕大，呈圆柱形，色如墨玉，果肉甜软润香。由于黄河滩枣的药学价值潜力巨大，随着科技的发展和对天然产物的关注，对黄河滩枣的研究也逐渐深入。

肝损伤是肝脏受到外界因素的入侵，从而引起的肝脏受损。肝损伤主要包括暴力性肝损伤、病理性肝损伤和化学性肝损伤等。其中，暴力性肝损伤多表现明显快速、且严重；而病理性肝损伤和化学性肝损伤比较常见，因病原体、化学药物或过量饮酒等因素导致的肝损伤患者越来越多，目前我国的肝损伤患者已逾千万，严重威胁了人民的生命安全和生活质量的提高。现代医学在干预肝损伤的治疗方面还没有特异性的药物，其中，化学药物对肝损伤的治疗多采用干扰素疗法，但存在用药剂量大、毒副作用大、停药后易复发等缺点；中药对肝损伤的治疗多采用复方汤药或复方的中成药，但其药味众多，导致质量难以控制。因此，急需开发一种源于单一植物，疗效确切的有效部位或有效成分，用于肝损伤的预防和治疗。

植物多糖是从植物中提取得到的一类有效部位或有效成分，包括淀粉、纤维素、葡聚糖、果聚糖等，植物多糖具有多种生理活性，对糖尿病、胃溃疡等多种疾病具有治疗作用。

近年来，随着生活水平的不断提高，人们的健康保健意识也逐渐增强，以多糖为主要成分的保健食品大量出现，随着对多糖生物活性的研究深入，多糖的应用领域也会更加的拓宽。

枣多糖具有免疫调节、抗肿瘤等多种生理活性，但由于黄河滩枣的粗多糖成分复杂，质量难以控制，目前对于黄河滩枣这一具有较大药用价值的品种的研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄河滩枣多糖提取精制方法。

本发明的另一目的是提供黄河滩枣多糖在制备预防保肝药物、保健品和/或食品中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种黄河滩枣多糖提取精制方法，包括以下步骤：

(1)将黄河滩枣去核，干燥，粉碎，得枣粉，用有机溶剂回流脱脂得脱脂枣粉；

(2)将脱脂枣粉与水按质量体积比为1g:(15-30)mL混匀，超声提取15-30min，过滤，滤液浓缩至原滤液体积的1/3-1/2，向浓缩液中加入体积浓度为80％-100％乙醇，至混合液中乙醇的体积浓度为75-85％，醇沉过夜，洗涤沉淀，干燥，即得粗多糖，粗多糖的质量收率为6.93％-9.82％；

(3)将步骤(2)制得的粗多糖溶于水，制成1-3g/L的粗多糖溶液，将Sevag试剂与粗多糖溶液按体积比为1:(2.5-3.5)混合，振摇，静置分层，弃去下层有机相层及中间白色变性蛋白质层，将上层多糖溶液减压浓缩至原粗多糖溶液体积的1/8-1/6，醇沉过夜，过滤，洗涤沉淀，干燥，得脱蛋白的枣多糖；

(4)将步骤(3)制得的脱蛋白的枣多糖溶于水，制成4-6g/L的多糖溶液，调节溶液的pH为8.5-9，向多糖溶液中加入H₂O₂，至多糖溶液中H₂O₂的体积分数为40％，水浴加热脱色，醇沉过夜，过滤，洗涤沉淀，干燥，即得纯化后的枣多糖，纯化后的多糖相对于粗多糖的质量收率为32％-40％(以葡萄糖计)。

步骤(1)中，回流脱脂的方法为：将枣粉加入至体积浓度为95％乙醇中，枣粉与乙醇的质量体积比为1g:5mL，在45℃回流脱脂3小时；

步骤(2)中，超声提取的温度为50℃；

步骤(3)中，所述Sevag试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比5:1混合的溶液；

步骤(3)中，将Sevag试剂与粗多糖溶液混合后，剧烈振摇20min，静置30min后分层，弃去下层有机相层及中间白色变性蛋白质层，重复操作10次；

步骤(4)中，调节溶液pH所用的试剂为0.1M的NaOH溶液；

步骤(4)中，水浴脱色的温度为40℃，时间为4h；

步骤(2)、(3)、(4)中，洗涤沉淀所用的溶剂为丙酮，洗涤后的沉淀在40℃真空干燥12小时。

本发明制备的黄河滩枣多糖在制备预防肝损伤的药物、保健品和/或食品方面具有良好的应用。

本发明的有益效果：

本发明的黄河滩枣多糖能制成预防保肝药物，并且还具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力的作用，急毒实验结果表明其无毒，能够满足预防保肝和治疗保健的需求，应用前景广阔。肝脏是人体不可或缺的脏器之一，以代谢功能为主。肝脏的主要功能包括分泌胆汁、储藏动物淀粉，调节蛋白质、脂肪和碳水化合物的新陈代谢等。还有解毒、造血和凝血作用。在现代快节奏的生活中，人们工作忙碌，过度操劳容易导致肝气偏弱。据报道，长时间的工作状态使身体各器官血液需求量大大增加，血气消耗增大，而肝是体内的藏血器官，疲于工作就会受损，所以对过劳一族而言，最先需要养护的就是肝脏。本发明建立了化学性肝损伤和药物性损伤两种肝损伤模型，并对其进行了预防以及治疗两方面的研究。其中化学性的肝损伤是由化学性肝毒性物质所造成的肝损伤。造成化学性肝损伤的外在因素有很多，特别是城市，空气流通速度缓慢，各种工业废弃、汽车尾气等令空气中充满了各种各样的化学毒物，损伤肝脏和身体健康。另外服用药物对肝脏的伤害不可估量，严重时会造成药物性肝损伤，甚至会危机生命。如果用药时间过长或者药物的用量过大，会对肝脏造成伤害。不规范地合用两种或两种以上药物，也会造成部分肝细胞坏死。主要症状表现：食欲减退、恶心、乏力、失眠等。本发明提取的大枣多糖对于预防和治疗两种肝损伤模型均具有良好的效果，尤其对于肝损伤的预防，效果更为显著。

附图说明

图1为混合单糖标准品及黄河滩枣多糖水解样品的HPLC图，其中，(A)为混合单糖标准品，(B)为黄河滩枣多糖水解样品；图中，1-甘露糖,2-鼠李糖,3-半乳糖醛酸,4-葡萄糖,5-半乳糖,6-***糖；

图2黄河滩枣多糖自由基清除能力测定结果；

图3黄河滩枣多糖还原能力测定结果；

图4黄河滩枣多糖成分对HepG2细胞的抑制作用测定结果；

图5a黄河滩枣多糖对正常小鼠脾淋巴细胞代谢活力的影响；

图5b黄河滩枣多糖对脾细胞分泌细胞因子的影响；

图6a黄河滩枣多糖对正常小鼠腹腔细胞代谢活力的影响；

图6b黄河滩枣多糖对正常小鼠腹腔细胞分泌细胞因子TNF-α的影响；

图7CCl₄诱导肝损伤后黄河滩枣多糖治疗作用剂量依赖性研究；

图8CCl₄诱导肝损伤后黄河滩枣多糖治疗作用时间依赖性研究；

图9黄河滩枣多糖对CCl₄诱导肝损伤预防作用研究；

图10APAP诱导肝损伤后黄河滩枣多糖治疗作用剂量依赖性研究；

图11APAP诱导肝损伤后黄河滩枣多糖治疗作用时间依赖性研究；

图12黄河滩枣多糖对APAP诱导肝损伤预防作用研究。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：黄河滩枣的提取、纯化和制备

(1)将黄河滩枣洗净、去核，在45℃烘干，粉碎，得枣粉，将20g枣粉加入至100mL95％乙醇中，在45℃回流脱脂3小时得脱脂枣粉；

(2)将10g脱脂枣粉与250mL水混匀，于50℃超声提取15min，冷却至室温，抽滤，取滤液，在60℃减压浓缩至50mL，向浓缩液中边搅拌边缓缓加入体积浓度为90％的乙醇，至混合液中乙醇的体积浓度为80％，4℃醇沉过夜，抽滤，取沉淀，用丙酮洗涤沉淀，在40℃真空干燥12h，即得粗多糖，粗多糖的质量收率为9.82％；

(3)将步骤(2)制得的粗多糖溶于水，制成1g/L的粗多糖溶液，将Sevag试剂与粗多糖溶液体积比为1:3混合，剧烈振摇20min，静置30min分层，弃去下层有机相层及中间白色变性蛋白质层，重复操作10次，将多糖溶液减压浓缩至原体积的1/6，4℃醇沉过夜，抽滤，取沉淀，用丙酮洗涤沉淀，在40℃真空干燥12h，得脱蛋白的枣多糖；

(4)将步骤(3)制得的脱蛋白的枣多糖溶于水，制成5g/L的多糖溶液，用0.1M的NaOH溶液调节溶液的pH为8.8，向多糖溶液中加入H₂O₂，至多糖溶液中H₂O₂的体积分数为40％，40℃恒温水浴脱色4h，醇沉过夜，过滤，用丙酮洗涤沉淀，在40℃真空干燥12h，即得纯化后的枣多糖。

对纯化后的枣多糖进行水解，对水解后的成分进行分析，结果见表1：

表1 纯化后的枣多糖的成分

纯化后的多糖相对于粗多糖的质量收率为40％(以葡萄糖计)。

实施例2：黄河滩枣的提取、纯化和制备

(1)将黄河滩枣洗净、去核，在45℃烘干，粉碎，得枣粉，将40g枣粉加入至200mL95％乙醇中，在45℃回流脱脂3小时得脱脂枣粉；

(2)将脱脂枣粉30g与750mL水混匀，于50℃超声提取30min，冷却至室温，抽滤，取滤液，在60℃减压浓缩至100mL，向浓缩液中边搅拌边缓缓加入无水乙醇，至乙醇的体积浓度为80％，4℃醇沉过夜，抽滤，取沉淀，用丙酮洗涤沉淀，在40℃真空干燥12h，即得粗多糖，粗多糖的质量收率为6.93％；

(3)将步骤(2)制得的粗多糖溶于水，制成2g/L的粗多糖溶液，将Sevag试剂与粗多糖溶液体积比为1:3混合，剧烈振摇20min，静置30min分层，弃去下层有机相层及中间白色变性蛋白质层，重复操作10次，将多糖溶液减压浓缩至200mL，4℃醇沉过夜，抽滤，取沉淀，用丙酮洗涤沉淀，在40℃真空干燥12h，得脱蛋白的枣多糖；

(4)将步骤(3)制得的脱蛋白的枣多糖溶于水，制成6g/L的多糖溶液，用0.1M的NaOH溶液调节溶液的pH为9.0，向多糖溶液中加入H₂O₂，至多糖溶液中H₂O₂的体积分数为40％，40℃恒温水浴脱色4h，醇沉过夜，过滤，用丙酮洗涤沉淀，在40℃真空干燥12h，即得纯化后的枣多糖。纯化后的多糖相对于粗多糖的质量收率为32％(以葡萄糖计)。

实施例3：黄河滩枣的提取、纯化和制备

(1)将黄河滩枣洗净、去核，在45℃烘干，粉碎，得枣粉，将1kg枣粉加入至5L体积浓度为95％乙醇中，在45℃回流脱脂3小时得脱脂枣粉；

(2)将1kg脱脂枣粉与15L水混匀，于50℃超声提取30min，冷却至室温，抽滤，取滤液，在60℃减压浓缩至2.5L，向浓缩液中边搅拌边缓缓加入无水乙醇，至乙醇的体积浓度为80％，4℃醇沉过夜，抽滤，取沉淀，用丙酮洗涤沉淀，在40℃真空干燥12h，即得粗多糖，粗多糖的质量收率为8.59％；

(3)将步骤(2)制得的粗多糖溶于水，制成3g/L的粗多糖溶液，将Sevag试剂与粗多糖溶液体积比为1:3混合，剧烈振摇20min，静置30min分层，弃去下层有机相层及中间白色变性蛋白质层，重复操作10次，将多糖溶液减压浓缩至原体积的1/6，4℃醇沉过夜，抽滤，取沉淀，用丙酮洗涤沉淀，在40℃真空干燥12h，得脱蛋白的枣多糖；

(4)将步骤(3)制得的脱蛋白的枣多糖溶于水，制成4g/L的多糖溶液，用0.1M的NaOH溶液调节溶液的pH为8.5，向多糖溶液中加入H₂O₂，至多糖溶液中H₂O₂的体积分数为40％，40℃恒温水浴脱色4h，醇沉过夜，过滤，用丙酮洗涤沉淀，在40℃真空干燥12h，即得纯化后的枣多糖。纯化后的多糖相对于粗多糖的质量收率为36％(以葡萄糖计)。

实施例4：大枣多糖体外抗氧化活性评价

一.材料

1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH，阿拉上海晶纯生化科技股份有限公司)

无水乙醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)

铁***(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)

三氯乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)

三氯化铁(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)

磷酸二氢钾(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)

NaOH(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)

涡旋(IKA MS basic)

低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)

TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)

二、方法

1.DPPH自由基清除能力测定

DPPH法于1958年被提出，广泛用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。DPPH是以氮为中心的稳定的自由基，其稳定性主要来自三个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基，DPPH可以捕获其他的自由基。由于DPPH自由基在以517nm为中心处具有强烈的吸收，因此在溶液中呈现深紫色，并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。

将本发明实施例1制得的大枣多糖配置成0.31,0.62,1.25,2.50,5.00mg/mL的溶液。取2mL各浓度的多糖样品溶液与2mL DPPH的乙醇溶液(0.1mM)涡旋混合。室温避光反应30min，在517nm处测定吸光度值。吸光度越低表明样品的自由基清除能力越高。DPPH自由基清除能力计算公式如下：

${\mathrm{DPPH}}_{\mathrm{scavengingeffect}}(\%)=(1-\frac{{\mathrm{Abs}}_{\mathrm{sample}}-{\mathrm{Abs}}_{\mathrm{ground}}}{{\mathrm{Abs}}_0})\×100\%$

式中：Abs ₀为不含多糖样品的DPPH溶液，Abs _sample是样品反应液的吸光度，Abs _ground为多糖溶液的吸光度。

如图2所示，大枣多糖的自由基清除能力和多糖浓度呈正相关，浓度越大，清除能力越强。当浓度为5mg/mL时,DPPH清除率为88.08％。因此，大枣多糖具有一定的自由基清除能力，可作为抗氧化剂。

2.多糖还原能力测定

抗氧化剂可使铁***的三价铁还原成二价铁(亚铁***)，二价铁(亚铁***)进一步和三氯化铁生成普鲁士蓝(Fe₄[Fe(CN)₆]₃)，在700nm处有最大吸光度。因此，通过测定700nm处的吸收可以反映抗氧化剂还原能力的大小，吸光度越大，还原能力越强，即抗氧化能力越强。

分别将本发明实施例2制得的大枣多糖配成0.31,0.62,1.25,2.50,5.00mg/mL的溶液。2.5mL磷酸盐缓冲液(pH 6.6)，2.5mL 1％K₃Fe(CN)₆溶液与1.0mL各浓度的多糖样品溶液涡旋混合。50℃水浴反应20min后，加入10％TCA溶液2.5mL终止反应。3000r/min离心10min后，取2.5mL上清与2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1％FeCl₃溶液混合。5min内测定各样品在700nm处的吸收。吸收越强说明还原能力越强。如图3所示，大枣多糖的还原能力和多糖浓度呈剂量依赖关系，浓度越大，还原能力越强。DPPH自由基清除能力和还原能力实验，证明大枣多糖具有明显的抗氧化性。

实施例5：大枣多糖体外抗肿瘤活性评价

一.材料

1.受试药物：本发明实施例1制备的黄河滩枣多糖，制备成一系列浓度的多糖溶液(3.5-5.0mg/mL)。

空白：

2.肝癌细胞系HepG2(由山东大学药物制剂与释药***研究中心提供)

3.试剂：

DMEM高糖培养基(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)

噻唑蓝(MTT，北京索莱宝科技有限公司)

双抗(青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL，Life Technologies Corporation)

0.25％胰酶-EDTA消化液(迈晨科技有限公司)

胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)

DMSO(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)

低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)

二氧化碳培养箱(HERAcell 150i,Thermo Scientific)

酶标仪(Infinite 200 Pro，Tecan Austria GmbH)

二、方法

1.细胞系和细胞培养

选取人的肝癌细胞系HepG2为细胞模型。细胞培养在含有10％胎牛血清和100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中(37℃，5％CO2，饱和湿度)。每天换液一次，每2-3天传代1次。取对数生长期的HepG2细胞接种于96孔培养板，培养12h后进行细胞毒性实验。

2.细胞毒性试验

取对数生长期的HepG2细胞，以2000cells/well的密度接种至96孔培养板中，每孔体积为100μL，将细胞在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜后，吸取培养基，PBS洗涤两次，加入200μL含多糖培养液(3.5,4.0,4.5,5.0mg/mL)后细胞在常规培养条件下继续培养，空白对照：细胞培养液(不含多糖)。培养时间结束后每孔加5mg/mL的MTT液20μL，37℃继续培养4h后，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加150μLDMSO，避光振荡使蓝色甲臜结晶充分溶解。用酶标仪检测溶液在570nm处的吸光度值(Abs)，按公式计算细胞生存率(Cell viability rate)。细胞生存率(％)＝Abs treated/Abs control。

3.MTT法测定大枣多糖HepG2细胞的抑制作用

HepG2细胞与一系列浓度的多糖溶液(3.5-5.0mg/mL)分别孵育48，72和96小时，结果如图4所示。由图4可知，与空白组相比，大枣多糖显著抑制了HepG2肝癌细胞的生长(P<0.05)，且对HepG2的抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性，显示了较强的抑制肿瘤细胞生长的活性。

实施例6：大枣多糖对正常小鼠脾细胞代谢活力和分泌细胞因子TNF-α的影响

一.材料

1.受试药物：本发明实施例1制备的黄河滩枣多糖，制备成一系列浓度的多糖溶液(1mg/mL、0.8mg/mL、0.5mg/mL)。

阳性对照：脂多糖(LPS,Sigma公司)

刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司)

2.实验动物：

昆明种小鼠(山东大学新药评价中心提供)

3.试剂：

DMEM高糖培养基(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)

CCK-8(日本Dojindo公司)

双抗(青霉素100U/mL和链霉素100μg/mL，Life Technologies Corporation)

0.25％胰酶-EDTA消化液(迈晨科技有限公司)

胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)

红细胞裂解液(北京索来宝科技有限公司)

小鼠TNF-α试剂盒(美国eBioscience公司)

低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)

二氧化碳培养箱(HERAcell 150i,Thermo Scientific)

酶标仪(Infinite 200 Pro，Tecan Austria GmbH)

二、方法

取健康昆明种小鼠6只，颈椎脱臼处死小鼠，泡75％酒精5min，无菌取出脾脏放入盛有5mL含双抗的PBS缓冲盐溶液的培养皿中，用眼科剪刀剪掉脂肪组织，放入另外盛有5mL含双抗的PBS缓冲盐溶液泡下数分钟，置于含1mL高糖DMEM培养基的25cm²培养皿中，用20mL注射器的注射芯来研磨至脾脏成白色，再加1mL培养液，200目尼龙网过滤，移入离心管中，加红细胞裂解液500μL，放置2min，以破坏其中的红细胞，滤液1000rpm离心5min，弃上清，加PBS缓冲溶液重悬，收集细胞，5％C0₂，37℃条件下培养箱中静止培养2h，以除去贴壁细胞，收集未贴壁的细胞悬液，离心5min，用细胞培养液洗三遍，计数，配成2×106个细胞/mL，在已加好药物或者对照试剂的96孔板中每孔加入上述细胞悬液100μL。

用全培将大枣多糖配制成高、中、低三个浓度，无菌过滤后在96孔板中每孔加入100μL，使终浓度为1、0.8、0.5mg/mL；正常对照组每孔加入全培100μL；ConA阳性对照组每孔加全培配制的ConA 100μL，终浓度为5μg/mL。每孔加入小鼠脾细胞100μL。测定小鼠脾细胞代谢活力时，用ConA做阳性对照。每组设6个复孔。将96孔板置于培养箱中，在饱和湿度、5％CO₂、37℃条件下，根据需要培养相应的时间。测定细胞代谢活力时培养24h。测定脾细胞分泌TNF-α时，培养24h后收集培养上清液用于相应的测定。

在细胞培养结束前4h，于96孔板中每孔中加入20μL CCK-8溶液，再继续培养4h，充分振荡混匀60s后，用全自动酶标仪检测其450nm处的吸光度值。脾细胞培养24h后，分别每孔取50μL细胞培养液上清，用ELISA方法分别检测脾细胞培养上清TNF-α含量。

测定服用大枣多糖后对小鼠脾淋巴细胞代谢活力和分泌TNF-α的影响,脂多糖(LPS)作为阳性对照。如图5a,小鼠脾淋巴细胞代谢CCK-8的活力增强，且在一定范围内呈剂量依赖趋势，提示大枣多糖具有免疫增强作用。如图5b,测定大枣多糖对脾细胞分泌细胞因子的影响，发现大枣多糖可明显促进TNF-α的分泌。大枣多糖处理后，小鼠脾淋巴细胞代谢CCK-8的活力增强，且在一定范围内呈剂量依赖趋势，提示大枣多糖具有免疫增强作用。接着观察了大枣多糖对脾细胞分泌细胞因子的影响，我们发现大枣多糖可明显促进TNF-α的分泌。由于TNF-α主要由巨噬细胞分泌，是一种重要的免疫调节因子，不仅能够直接的抑制或杀伤肿瘤细胞，而且具有激活巨噬细胞和中性粒细胞功能及促进抗原活化T、B淋巴细胞增殖、分化等作用，促进单核巨噬细胞及其它细胞产生细胞因子IL-l、IL-6、IL-8、IFN-γ以及TNF-α本身，发挥重要的免疫调节作用。

实施例7：大枣多糖对正常小鼠腹腔细胞代谢活力和分泌细胞因子TNF-α的影响

一.材料

1.受试药物：本发明实施例1制备的黄河滩枣多糖，制备成一系列浓度的多糖溶液(1mg/mL、0.8mg/mL、0.5mg/mL)。

阳性对照：脂多糖(LPS,Sigma公司)

2.实验动物：昆明种小鼠(山东大学新药评价中心)

3.试剂：

DMEM高糖培养基(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)

CCK-8(日本Dojindo公司)

双抗(青霉素100 U/mL和链霉素100μg/mL，Life Technologies Corporation)

0.25％胰酶-EDTA消化液(迈晨科技有限公司)

胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)

红细胞裂解液(北京索来宝科技有限公司)

小鼠TNF-α试剂盒(美国eBioscience公司)

低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)

二氧化碳培养箱(HERAcell 150i,Thermo Scientific)

酶标仪(Infinite 200 Pro，Tecan Austria GmbH)

二、方法

取健康昆明种小鼠6只，颈椎脱曰处死小鼠，75％酒精消毒腹部皮肤，用剪刀剪一小口，撕开皮肤充分暴露腹壁，用注射器向腹腔内注入5mL无菌PBS溶液，用手指轻揉腹壁，然后回抽灌洗液，离心收集细胞，集中每2只小鼠的腹腔渗出细胞，PBS液洗3遍。加DMEM培养液1mL计数，然后用DMEM完全培调整细胞浓度为2×10⁶个细胞/mL，在己加好药物或者对照试剂的96孔板中每孔加入上述细胞悬液100μL。

用全培将大枣多糖配制成高、中、低三个浓度，无菌过滤后在96孔板中每孔加入100μL，使终浓度为1、0.8、0.5mg/mL；正常对照组每孔加入全培100μL；LPS(脂多糖)阳性对照组每孔加全培配制的LPS 100μL，终浓度为10μg/mL；在每孔加入小鼠腹腔渗出细胞悬液100μL。测定小鼠腹腔渗出细胞代谢活力和分泌TNF-α，用LPS做阳性对照。每组设6个复孔。将96孔板置于培养箱中，在饱和湿度、5％CO₂、37℃条件下，根据需要培养相应的时间。测定细胞代谢活力时培养24h。测定腹腔渗出细胞分泌TNF-α时，培养10h后收集培养上清液用于测定，收集上清液前倒置显微镜下观察比较不同组细胞形态。

在细胞培养结束前4h，于96孔板中每孔中加入20μL CCK-8溶液，再继续培养4h，充分振荡混匀60s后，用全自动酶标仪检测其450nm处的吸光度值。

腹腔渗出细胞培养10h后，分别每孔取50μL细胞培养液上清，用ELISA方法分别检测腹腔渗出细胞培养上清TNF-α含量。测定服用大枣多糖后对小鼠腹腔渗出细胞(主要为巨噬细胞)代谢活力和分泌TNF-α的影响，脂多糖(LPS)作为阳性对照。如图6a和如图6b，大枣多糖可显著增强腹腔渗出细胞代谢CCK-8活力,促进腹腔渗出细胞分泌TNF-α，证明大枣多糖可以活化并增强单核巨噬细胞功能和促进分泌TNF-α。大枣多糖对小鼠腹腔渗出细胞(主要为巨噬细胞)代谢活力和分泌TNF-α的影响。结果表明，大枣多糖可显著增强腹腔渗出细胞代谢CCK-8活力,促进腹腔渗出细胞分泌TNF-α，提示大枣多糖可能是通过活化并增强单核巨噬细胞功能和促进分泌TNF-α这两条途径而发挥免疫调节作用。

实施例8：大枣多糖的保肝实验研究

一.材料

1.受试药物：本发明实施例2制备的黄河滩枣多糖，制备成一系列浓度的多糖溶液(100mg/Kg、200mg/Kg、400mg/Kg)。

阳性对照：水飞蓟宾(天士力制药集团股份有限公司)

2.实验动物：昆明种小鼠(山东大学新药评价中心)

3.试剂：

四氯化碳(国药集团药业股份有限公司)

植物油(鲁花集团)

谷丙转氨酶试剂盒(南京建成科技有限公司)

谷草转氨酶试剂盒(南京建成科技有限公司)

HPMC,PVP K30和F68(美国sigma公司)

对乙酰氨基酚(美国sigma公司)

二、方法

昆明种小鼠适应环境1周后，随机分为8只每组。首先，四氯化碳按照0.4％(体积分数，v/v，四氯化碳/植物油)(溶剂为植物油)的剂量进行小鼠腹腔注射，每只注射0.3mL。空白组小鼠仅注射植物油作为对照。肝损伤1h后，大枣和水飞蓟宾分别腹腔注射给药。对于大枣多糖组，分别注射低、中、高(100,200，400mg/kg)三种剂量的大枣多糖溶液。对于水飞蓟宾组，注射150mg/kg的水飞蓟宾溶液。此时，空白组和模型组仅腹腔注射同体积的生理盐水。给药之后所有小鼠均禁食不禁水。在肝损伤24h后，进行小鼠眼眶取血。血液置于室温下1h后，4000r/min离心15min，取出上清液(血清)于4℃下保存。如图7，CCl₄诱导肝损伤后大枣多糖治疗作用剂量依赖性研究。CCl₄肝损伤后1h，小鼠腹腔注射低、中、高三种浓度的大枣多糖(100,200,或400mg/kg)以及阳性对照药水飞蓟宾(150mg/kg)，并对转氨酶的活性进行测定。每组8个数据，均采用平均值±标准差表示。相比空白组,##p<0.01；比较CCl₄造模组,**p<0.01。通过大枣多糖的治疗，能够明显降低AST和ALT的酶活，尤其是大枣多糖剂量为中、高剂量(200mg/kg、400mg/kg)时(p<0.01)。说明大枣多糖能够显著改善CCl₄造成的肝损伤。

为了进一步验证大枣多糖的治疗作用，本实验对于时间因素也做了研究。即在CCl₄损伤后，分别在1h、3h和6h对不同组小鼠腹腔注射同一浓度(400mg/kg)的大枣多糖溶液。同时，空白组和模型组仅注射生理盐水。肝损伤24h后，血清取出并于4℃下保存。如图8，CCl₄诱导肝损伤后大枣多糖治疗作用时间依赖性研究。在肝损伤后1h,3h或6h后，腹腔注射大枣多糖(400mg/kg)；阳性对照组为1h后腹腔注射水飞蓟宾(150mg/kg)，并对转氨酶的活性进行测定。每组8个数据，均采用“平均值±标准差”表示。相比空白组,##p<0.01；比较CCl₄造模组,**p<0.01。在肝损伤后1h,3h或6h后，腹腔注射大枣多糖，均有显著效果，能够使AST和ALT活性恢复到正常值。

在CCl₄进行肝损伤前，大枣多糖组小鼠连续5天腹腔注射大枣多糖溶液(100或400mg/kg)，每天一次。水飞蓟宾组小鼠采用同样方法注射水飞蓟宾(150mg/kg)。空白组小鼠和模型组小鼠仅注射生理盐水。在第六日，除空白组小鼠外均腹腔注射0.4％的CCl₄溶液(植物油做溶剂)0.3mL来诱导肝损伤。肝损伤后所有小鼠均禁食不禁水，24h后取出血清并于4℃下保存。如图9，大枣多糖对CCl₄诱导肝损伤预防作用研究。CCl₄肝损伤之前连续5天，每天一次对小鼠腹腔注射低、高两种浓度的大枣多糖(100或400mg/kg)以及阳性对照药水飞蓟宾(150mg/kg)，并对转氨酶的活性进行测定。每组8个数据，均采用“平均值±标准差”表示。相比空白组,#p<0.05，##p<0.01；比较CCl₄造模组,*p<0.05，**p<0.01。大枣多糖的预防作用降低了AST和ALT活性值。尤其在大枣多糖剂量为400mg/kg时,与空白对照组相近。通过上述结果证明，大枣多糖能够对CCl₄诱导的肝损伤起到预防作用。

如图10，对乙酰氨基酚(APAP)诱导肝损伤后大枣多糖治疗作用剂量依赖性研究。

由于对乙酰氨基酚难溶于水，采用HPMC,PVP K30和F68进行增溶，质量之比为APAP:HPMC:PVP K30:F68＝8:5:5:5。小鼠适应环境后将其随机分组，除空白组外每只腹腔注射400mg/kg的APAP溶液0.5mL。肝损伤1h后，大枣和水飞蓟宾分别腹腔注射给药。对于大枣多糖组小鼠，分别注射低、中、高(100,200，400mg/kg)三种剂量的大枣多糖溶液。对于水飞蓟宾组小鼠，注射150mg/kg的水飞蓟宾溶液。此时，空白组和模型组仅腹腔注射同体积的生理盐水。所有小鼠均禁食不禁水。在肝损伤24h后，进行小鼠眼眶取血。血液置于室温下1h后，4000r/min离心15min。取出上清液(血清)于4℃下保存。APAP肝损伤后1h，小鼠腹腔注射低、中、高三种浓度的大枣多糖(100,200,或400mg/kg)以及阳性对照药水飞蓟宾(150mg/kg)，并对转氨酶的活性进行测定。每组8个数据，均采用“平均值±标准差”表示。相比空白组,##p<0.01；比较APAP造模组,**p<0.01。在APAP造模后，模型组AST和ALT的活性显著提高(p<0.01)。从AST和ALT水平评价，大枣多糖腹腔注射后能够显著降低肝损伤。

为了进一步验证大枣多糖的治疗作用，本实验对于时间因素也做了研究。即在APAP损伤后，分别在1h、3h和6h对不同组小鼠腹腔注射同一浓度(400mg/kg)的大枣多糖溶液。同时，空白组和模型组仅注射生理盐水。肝损伤24h后，血清取出并于4℃下保存。如图11，APAP诱导肝损伤后大枣多糖治疗作用时间依赖性研究。在肝损伤后1h,3h或6h后，腹腔注射大枣多糖(400mg/kg)；阳性对照组为1h后腹腔注射水飞蓟宾(150mg/kg)，并对转氨酶的活性进行测定。每组8个数据，均采用“平均值±标准差”表示。相比空白组,##p<0.01；比较APAP造模组,*p<0.05,**p<0.01。在APAP造模后，大枣多糖腹腔注射后能够显著降低肝损伤。

在APAP进行肝损伤前，大枣多糖组小鼠连续5天腹腔注射大枣多糖溶液(100或400mg/kg)，每天一次。水飞蓟宾组小鼠采用同样方法注射水飞蓟宾(150mg/kg)作为阳性对照。空白组小鼠和模型组小鼠仅注射生理盐水。在第六天时，除空白组小鼠外均腹腔注射400mg/kg APAP诱导肝损伤。肝损伤后所有小鼠均禁食不禁水，24h后取出血清并于4℃下保存。如图12，大枣多糖对APAP诱导肝损伤预防作用研究。APAP肝损伤之前连续5天，每天一次对小鼠腹腔注射低、高两种浓度的大枣多糖(100或400mg/kg)以及阳性对照药水飞蓟宾(150mg/kg)，并对转氨酶的活性进行测定。每组8个数据，均采用“平均值±标准差”表示。相比空白组,##p<0.01；比较APAP造模组,*p<0.05，**p<0.01。大枣多糖在高剂量(400mg/kg)预防给药时，会显著的降低AST和ALT的活力，而大枣多糖会起到很明显的预防效果。

本发明实施例1-3制备的枣多糖，可以将其作为有效成分，以常规方法制成用于预防肝损伤的药物、食品或保健品。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种黄河滩枣多糖提取精制方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将黄河滩枣去核，干燥，粉碎，得枣粉，用有机溶剂回流脱脂得脱脂枣粉；

(2)将脱脂枣粉与水按质量体积比为1g:(15-30)mL混匀，超声提取15-30min，过滤，滤液浓缩至原滤液体积的1/3-1/2，向浓缩液中加入体积浓度为80％-100％乙醇，至混合液中乙醇的体积浓度为75-85％，醇沉过夜，洗涤沉淀，干燥，即得粗多糖；

(3)将步骤(2)制得的粗多糖溶于水，制成1-3g/L的粗多糖溶液，将Sevag试剂与粗多糖溶液按体积比为1:(2.5-3.5)混合，振摇，静置分层，弃去下层有机相层及中间白色变性蛋白质层，将上层多糖溶液减压浓缩至原粗多糖溶液体积的1/8-1/6，醇沉过夜，过滤，洗涤沉淀，干燥，得脱蛋白的枣多糖；

(4)将步骤(3)制得的脱蛋白的枣多糖溶于水，制成4-6g/L的多糖溶液，调节溶液的pH为8.5-9，向多糖溶液中加入H₂O₂，至多糖溶液中H₂O₂的体积分数为40％，水浴加热脱色，醇沉过夜，过滤，洗涤沉淀，干燥，即得纯化后的枣多糖。

2.如权利要求1所述的一种黄河滩枣多糖提取精制方法，其特征在于，步骤(1)中，回流脱脂的方法为：将枣粉加入至体积浓度为95％乙醇中，枣粉与乙醇的质量体积比为1g:5mL，在45℃回流脱脂3小时。

3.如权利要求1所述的一种黄河滩枣多糖提取精制方法，其特征在于，步骤(2)中，超声提取的温度为50℃，超声提取的时间为15min。

4.如权利要求1所述的一种黄河滩枣多糖提取精制方法，其特征在于，步骤(3)中，将Sevag试剂与粗多糖溶液混合后，剧烈振摇20min，静置30min后分层，弃去下层有机相层及中间白色变性蛋白质层，重复操作10次；所述Sevag试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比5:1混合的溶液。

5.如权利要求1所述的一种黄河滩枣多糖提取精制方法，其特征在于，步骤(4)中，调节溶液pH所用的试剂为0.1M的NaOH溶液。

6.权利要求1所述的一种黄河滩枣多糖提取精制方法，其特征在于，步骤(4)中，水浴脱色的温度为40℃，时间为4h。

7.如权利要求1至6任一项所述的提取精制方法制备的黄河滩枣多糖。

8.权利要求7所述的黄河滩枣多糖在制备用于预防肝损伤的药物、食品和/或保健品中的应用。

9.一种用于预防肝损伤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有权利要求7所述的黄河滩枣多糖。

10.一种具有预防保肝功效的食品，其特征在于，所述食品中含有权利要求7所述的黄河滩枣多糖。