CN104232553A - 一株在低pH值下产丁二酸工程菌株及其发酵生产丁二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株能在低pH值下产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌BA601（EscherichiacoliBA601），其保藏号编号为CCTCCNO：M2014210。本发明还公开了该菌在产丁二酸的方法。本发明以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性和磷酸转移酶***的ptsG自发突变的大肠杆菌AFP111为出发菌株，过量表达其耐酸基因gadBC。这种通过分子生物学及微生物驯化手段，使原先不能在低pH(pH5.6)条件下生长并发酵产酸的大肠杆菌AFP111能够高效利用葡萄糖产丁二酸的方法未见公开，而这种应用将大大推进丁二酸产业的进步和发展。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法，具体是一株在低pH值下产丁二酸重组菌株及利用该菌株发酵生产丁二酸的方法。
背景技术
丁二酸（succinic acid）又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯 (PBS) 类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。此外，丁二酸还用于生产药物、抗生素、氨基酸及维生素等利于人类健康中间体。
丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，今年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌。其中利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。而重组大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。
现有产丁二酸重组大肠杆菌的构建思路主要包括失活副产物生成途径的关键酶（如丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶）、增强丁二酸合成途径中酶（如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）的活性以及外源导入可以引导合成丁二酸的酶（如丙酮酸羧化酶）提高其对葡萄糖的利用率以及生产速率。其中，E. coli NZN111由于同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶，NADH不能及时再生为NAD+，引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡（NADH/NAD+比例超过2），最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖。其自发突变株E. coli AFP111由于突变了葡萄糖专性转运***中的ptsG基因，降低了在EMP途径中NADH的产生速率，恢复了NAD(H)平衡，使得菌株在厌氧条件下能够利用葡萄糖，且产物主要为丁二酸，在有氧厌氧两阶段发酵培养AFP111过程中，丁二酸质量收率达到96%，生产强度为1.21 g L-1h-1。
利用生物技术生产丁二酸过程中60-70%的成本是用在将最终发酵产生的丁二酸盐分离得到游离丁二酸的纯化阶段，这也是整个过程中耗费成本最多的阶段。为了降低生产成本，最可行的方法是发酵过程中不用或用少量的碱滴定中和而使游离丁二酸成为主要产物。但是至今为止用于丁二酸生产的细菌都不能在低pH值有效的生长并产丁二酸。然而能有效维持胞内pH的原核微生物则可用于在低pH值下发酵生产丁二酸。
大肠杆菌广泛应用于工业，但目前大多数大肠杆菌由于不能在耐受低pH值，从而不能在低pH值下发酵生产丁二酸。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株在pH值下产丁二酸大肠杆菌菌株，并利用该菌株厌氧发酵生产丁二酸，达到菌株的方法简单方便，得到的菌株发酵方法简单可行，易于工业化，产酸能力强的目的，从而大大降低生产成本，提高经济效益。
为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：
一、本发明提供一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌 BA601（Escherichia coli BA601），其保藏号编号为CCTCC NO：M2014210。
二、本发明所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA601的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性且磷酸转移酶***的ptsG染色体发生自发突变的大肠杆菌为出发菌株，利用过表达谷氨酸脱羧酶、γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因后，经连续驯化培养，得到能够在低pH值下高产丁二酸大肠埃希氏菌 BA601；
进一步地，所述的具体步骤如下：
(1) 利用CaCl2法制备缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性和磷酸转移酶***的ptsG染色体发生自发突变的E.coli感受态菌株；
(2) 纯化扩增出包含其耐酸原件gad***的谷氨酸(Glumate)脱羧酶(GadB)、谷氨酸-γ-氨基丁酸（GABA）反向转运蛋白(GadC)基因gadBC的质粒；
(3) 将步骤（2）所述的质粒利用热击法导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；
(4) 利用步骤（3）的阳性转化子表达耐酸基因gadBC，得到一株能在低pH值下发酵产丁二酸的大肠埃希氏菌BA600（Escherichia coliBA600）。
（5）大肠埃希氏菌BA600经连续驯化培养后，利用低pH值的固体培养基平板，筛选得到可以快速生长的突变株，再经过厌氧摇瓶发酵筛选获得可以在低pH值条件下高效产丁二酸的菌株为目标菌株大肠埃希氏菌BA601（Escherichia coli BA601）。
三、利用本发明所述的大肠埃希氏菌 BA601发酵生产丁二酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。
进一步地，具体步骤如下：
将大肠埃希氏菌 BA601按1%(v/v)接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，有氧培养菌体至OD600= 3时，按接种量10% 转接至含有厌氧阶段发酵培养基的血清瓶中，充CO22 min，并在37 ℃，200 r/min厌氧发酵48 h。
或者将大肠埃希氏菌 BA601按10％的接种量将种子液接入装有1.5 L发酵培养基的3 L发酵罐中，37 ℃有氧培养至菌体生长达到稳定期，37 ℃、200 r/min以0.5 L/min的速率持续通入CO2，进行厌氧发酵，优选的，其中有氧阶段发酵培养基维持在pH 5.6。
进一步地，所述的厌氧阶段发酵培养基是维持在pH 5.6。
本发明的有益效果在于：本发明以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性和磷酸转移酶***的ptsG自发突变的大肠杆菌AFP111为出发菌株，过量表达其耐酸基因gadBC。这种通过分子生物学及微生物驯化手段，使原先不能在低pH(pH5.6)条件下生长并发酵产酸的大肠杆菌AFP111能够高效利用葡萄糖产丁二酸的方法未见公开，而这种应用将大大推进丁二酸产业的进步和发展。
附图说明
图1大肠杆菌中耐酸基因gadBC的耐酸途径。
图2 PCR产物gadBC凝胶电泳鉴定图。
图3 质粒pMD19-T-gadBC 单酶切、双酶切电泳鉴定图。
图4 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） BA601在pH 5.6时产丁二酸结果。
本发明的微生物分类命名为大肠埃希氏菌 BA601（Escherichia coli BA601），其保藏日期为2014年5月18日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，其保藏号编号为CCTCC NO：M2014210。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
本发明所述的质粒用pMD19-T的来源是：购自Takara公司
本发明所述的出发菌株：E.coli AFP111的感受态菌株的来源有两处：
（1）Applied and environmental microbiology, 2001, 67(1): 148-154.申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处，并联系了发表人系美国芝加哥大学的David P. Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材料，并免费获得了该生物材料；且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料。
（2）该生物材料还在中国专利（申请号CN 96198547，申请日1996.10.31，授权日为2003年1月1日，授权公告号为CN1097632 C）的专利文献中公开并获得授权。
本发明所述的引物来源是：自行设计并外包金斯瑞生物技术公司合成。
实施例1
本实施例说明构建大肠埃希氏菌 BA600的方法。
(1)利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌AFP111至OD600= 0.5～0.6，利用CaCl2法制备缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)活性且磷酸转移酶***的ptsG基因染色体自发突变的大肠杆菌AFP111感受态菌株；
LB培养基的配方为：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L。 （2）合成不带酶切位点的引物，
上游引物：5’-ACACGAGTCCTTTGCACTTGCTTACTTT-3’；
下游引物：5’- CGCTCCCTTGTCTTATAACCATTCAGAC -3’。
提取E. coli JM109（本实验室保存）基因组，以E. coli JM109基因组为模板，PCR扩增目的基因片段，具体反应条件为：94 ℃，5 min；(94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 4 min，36个循环)；72 ℃，10 min。纯化扩增出包含耐酸基因gadBC以及自身启动子的一个片段。PCR产物gadBC鉴定如图2所示。
以PCR回收产物为模板，加上一定量的酶、缓冲液、dNTP， 72 ℃ 20 min反应，最终片段平滑末端分别加“A”碱基。经过加A反应后的片段，与pMD19-T载体进行TA连接获得重组质粒pMD19-T-gadBC。构建得到利用片段自身启动子表达耐酸基因gadBC的表达质粒。质粒pMD19-T-gadBC的单酶切鉴定如图3所示。
（3）将步骤（2）所述的质粒利用热击法导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；
（4）利用步骤（3）的阳性转化子表达耐酸基因gadBC，得到一株能够在pH 5.6时高效利用葡萄糖发酵产丁二酸大肠埃希氏菌 BA600。
实施例2
本实施例说明将大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA600进行连续培养驯化的方法。
将实施例1中构建得到的大肠埃希氏菌BA600作为出发菌株。1% (v/v)接种量从冻存管接入试管中，37 ℃，200 rpm培养过夜，再以1% (v/v)接种量接入三角瓶中，37 ℃、200 rpm培养6-8 h得到对数生长期的菌液；将对数生长期的菌液以10%（v/v）的接种量接种到装有300mL发酵培养基的500 mL连续培养装置中，37 ℃水浴加热，通入过滤除菌的CO2维持厌氧环境，并以1.5 mL/h的速率向培养装置中流加新鲜的发酵培养基。定时取样检测培养装置中菌体的密度，当反应器中菌体密度达到OD600= 2～3，并保持48 h无较大变化，说明表示菌体在该流加速度下生长稳定，获得突变株，此时驯化过程完成一个循环。将新鲜发酵培养基的流加速度加倍，进行下一个循环的连续培养。直至发酵培养基的流加速度达到12 mL/h，突变菌株生长性能在该条件下维持稳定。
其中，所述的种子培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L。
所述发酵培养基的配方为：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4 )3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，20.0 mg L-1VB1, 2.0 mg L-1生物素，葡萄糖30-40 g/L。
实施例3
本实施例说明筛选能将发酵培养基维持较低pH值的碳酸盐。
在发酵培养基中加入不同摩尔浓度的不同的碳酸盐，考察其灭菌前及灭菌后通2 min CO2后的pH值，筛选出能使pH值调至5.6附近的碳酸盐。
所述发酵培养基的配方为：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4 )3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，20.0 mg L-1VB1, 2.0 mg L-1生物素，葡萄糖30-40 g/L。
表1 筛选得到的不同碳酸盐调节pH比较
各碳酸盐对发酵培养基的pH调控如表1所示。从该表可以看出5×10-4 mol/L CaCO3可使培养基的pH达到5.79，最接近pH 5.6。
实施例4
本实施例说明筛选得到优良大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA601的方法。
筛选步骤：
1、 固体平板初筛
在无菌操作条件下，从连续培养装置中取出2-4 mL菌液，用无菌水稀释1×104倍，取100 μL涂布在pH 5.6的固体平板上，37 ℃培养12 h，挑选出挑选生长速度快，较为饱满的突变株单菌落。
2、 固体平板复筛
将筛选到的突变菌株在平板上反复转点培养，最终得到了菌株BA601、BA613，BA621显示了较强的生长速率和生长稳定性。
3、 摇瓶发酵筛选
将突变株BA600、BA601、BA616和BA628接入种子培养基中培养，37 ℃，200 r/min，培养12 h，再以1% (v/v)接种量接入含有50 mL培养基的三角瓶中，37 ℃、200 rpm生长6-8 h。然后接种到发酵培养基中，100 mL厌氧血清瓶装液量30 mL，接种量10%（v/v），充二氧化碳2 min，37 ℃，200 r/min，培养48 h。
其中，所使用的培养基配方如下：
固体平板培养基：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4 )3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，20.0 mg L-1VB1, 2.0 mg L-1生物素，琼脂15-20 g/L，葡萄糖20 g/L。
种子培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 5 g/L。
发酵培养基：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4 )3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，20.0 mg L-1VB1, 2.0 mg L-1生物素，碳酸钙0.5 g/L，葡萄糖30-40g/L。
表2 筛选得到的优良菌株和出发菌株的生长及产酸比较
发酵结果如表2所示。从该表可以看出出发菌株AFP111不可以在pH 5.6的发酵培养基中生长，分子改造后的BA600可以在pH 5.6的发酵培养基中生长，但其生长缓慢且丁二酸的产量较低，但经连续培养装置驯化后得到的菌株大肠埃希氏菌（Escherichia coli） BA601，在发酵培养基中的生长速度较快，丁二酸的产量比较高，达到了28 g/L。
实施例 5
本实施例说明大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA601在pH5.6发酵产丁二酸的能力。
大肠埃希氏菌 BA601按1% (v/v)接种量从冻存管接入试管中，37℃，200rpm培养过夜，再以1% (v/v)接种量接入含有LB培养基的三角瓶中，37℃、200rpm生长。当有氧培养菌体OD600至3左右时，按接种量10%转接至含有厌氧发酵培养基的血清瓶中厌氧发酵，通CO2两分钟，并在37℃，200 r/min厌氧发酵48小时。
有氧阶段培养基为：LB（蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 5 g/L）+ Amp (氨苄青霉素100 μg/mL)+Chl(氯霉素25 μg/mL)+Kar(卡那霉素30 μg/mL)
厌氧阶段培养基为：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4 )3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，20.0 mg L-1VB1, 2.0 mg L-1生物素+葡萄糖(30 g/L)+碳酸钙0.5 g/L+Amp (氨苄青霉素100 μg/mL)+Chl(氯霉素25 μg/mL)+Kar(卡那霉素30 μg/mL)
发酵结果表2所示，发酵培养48 h后检测到丁二酸的产量为28 g/L，丁二酸转化率为88 %，发酵过程证明BA601在pH5.6发酵培养基中具有较高的产丁二酸能力。
表3 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） BA601利用蔗糖发酵产丁二酸的能力
实施例 5
本实施例说明大肠埃希氏菌（Escherichia coli） BA601在pH 5.6发酵培养基中发酵产丁二酸的能力。
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA501按10％的接种量将种子液接入装有1.5 L发酵培养基的3 L发酵罐中，培养基中含有30 g/L的葡萄糖。37 ℃有氧培养至培养基中的残糖小于0.5 g/L, 37℃、200 r/min以0.5 L/min的速率持续通入CO2，进行厌氧发酵。
种子培养基：LB（蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 5 g/L）+ Amp (氨苄青霉素100 μg/mL)+Chl(氯霉素25 μg/mL)+Kar(卡那霉素30 μg/mL)
发酵培养基：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4)3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁16.1 mg·L-1，20.0 mg ·L-1VB, 2.0 mg·L-1生物素+葡萄糖（65 g/L）+ Amp (氨苄青霉素100 μg/mL)+Chl(氯霉素25 μg/mL)+Kar(卡那霉素30 μg/mL)
发酵结果如图4所示，发酵培养48 h后检测到丁二酸的产量为41 g/L，丁二酸转化率为96%，发酵过程证明BA601在pH 5.6的发酵培养基中可以生长并发酵高效产丁二酸。
Claims (8)
1.一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌 BA601（Escherichia coli BA601），其保藏号编号为CCTCC NO：M2014210。
2. 权利要求1所述的大肠埃希氏菌BA601（Escherichia coli BA601）的构建方法，其特征在于：以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性且磷酸转移酶***的ptsG染色体发生自发突变的大肠杆菌为出发菌株，利用过表达谷氨酸脱羧酶、γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因后，经连续驯化培养，得到能够在低pH值下高产丁二酸大肠埃希氏菌 BA601。
3.根据权利要求2所述的大肠埃希氏菌BA601构建方法，其特征在于具体步骤如下：
利用CaCl2法制备缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性和磷酸转移酶***的ptsG染色体发生自发突变的E.coli感受态菌株；
纯化扩增出包含其耐酸原件gad***的谷氨酸脱羧酶、谷氨酸-γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因gadBC的质粒；
将步骤（2）所述的质粒利用热击法导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；
(4) 利用步骤（3）的阳性转化子表达耐酸基因gadBC，得到一株能在低pH值下发酵产丁二酸的大肠埃希氏菌BA600（Escherichia coli BA600）；
（5）大肠埃希氏菌BA600经连续驯化培养后，利用低pH值的固体培养基平板，筛选得到可以快速生长的突变株，再经过厌氧摇瓶发酵筛选获得可以在低pH值条件下高效产丁二酸的菌株为目标菌株大肠埃希氏菌BA601（Escherichia coli BA601）。
4.利用权利要求2所述的大肠埃希氏菌 BA601发酵生产丁二酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于将大肠埃希氏菌 BA601按1%(v/v)接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，有氧培养菌体至OD600 = 3时，按接种量10% 转接至含有厌氧阶段发酵培养基的血清瓶中，充CO2两分钟，并在37 ℃，200 r/min厌氧发酵48 h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于将大肠埃希氏菌 BA601按10％的接种量将种子液接入装有1.5 L发酵培养基的3 L发酵罐中，37 ℃有氧培养至菌体生长达到稳定期，37 ℃、200 r/min以0.5 L/min的速率持续通入CO2，进行厌氧发酵。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述的厌氧阶段发酵培养基是维持在pH 5.6。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于有氧阶段发酵培养基维持在pH5.6。
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| CN103937733A (zh) * | 2014-03-18 | 2014-07-23 | 南京工业大学 | 一株利用蔗糖产丁二酸基因工程菌株及其发酵生产丁二酸的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 丁秋露: "大肠杆菌抗酸机制研究进展", 《淮南师范学院学报》, vol. 10, no. 5, 30 September 2008 (2008-09-30), pages 23 - 25 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN111411119A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-07-14 | 南京凯诺生物科技有限公司 | 一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用 |
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Application publication date: 20141224 |
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