CN111411119A - 一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用 - Google Patents

一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用。本发明将经过突变改造后pH耐受性有所改善的赖氨酸脱羧酶EcCadA‑M3连接到表达载体pCDFDuet‑1上，并导入一株高产丁二酸生产菌株E.coli AFP111，得到了能够耦合生产戊二胺和丁二酸的重组菌株E.coli SC01。该细胞耦合生产戊二胺和丁二酸有效的解决这二者独自合成存在的pH中和剂的问题，是一种能够固定二氧化碳、减少温室气体排放及碳损失的绿色合成戊二胺和丁二酸途径。

Description

一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用
技术领域
本发明属于戊二胺和丁二酸制备领域，具体涉及一种耦合生产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用。
背景技术
1,5-戊二胺（1,5-pentanediamine ），俗名1,5-二氨基戊烷，有类似氨气的恶臭的气味，简称尸胺。该物质易燃，高毒，具强刺激性。吸入后可因喉、支气管的痉挛、炎症和水肿，化学性肺炎或肺水肿而致死。中毒表现有咳嗽、喘息、喉炎、气短、头痛、恶心和呕吐，严重时将死亡。
在细胞内,戊二胺是赖氨酸合成途径的延伸反应，是赖氨酸在赖氨酸脱羧酶的作用下脱羧产生的，作为一种肉毒胺存在于腐败物中，与鸟氨酸的脱羧产物腐胺一样都是生物尸体腐败产生的气味中的一种成分。这种二胺不仅与腐败作用有关，生物活体在生命代谢中也会产生少量的戊二胺，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱。戊二胺在农业、医学和工业上均有广泛的应用。在农业上，外源施加戊二胺可以改善坐果和促进果实发育，提高果实的产量；在医学上，它可以作为一种有效治疗痢疾的药物；在工业上，戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质的高分子材料。目前化学法合成1,5-戊二胺主要是以戊二腈为原料，在催化剂作用下首先转为5-氨基戊腈，进而转化为戊二胺，反应通常在高压下进行。通过对催化剂的选择和改性，戊二腈的转化率可达到100 %，1,5-戊二胺选择率达到66.8 %。化学法产量较高，但其反应条件剧烈，对设备要求较高，环境污染较大，且最终反应产物中有一定量的副产物六氢吡啶，并不适合大规模推广。
丁二酸又称玻用酸（Succinicacid, succinate），是种常见的天然有机酸。自1546
年首次从玻目中分离出来以后，丁二酸己经在农业、食品、医药等领域广泛应用。
丁二酸是一种重要的化学品，可以用于表面活性剂、清洁剂、溶剂等领域，在食品行业中可以用作pH改良剂、风味物质或抗菌剂，也可以用作动物饲料添加剂及植物助长剂等。丁二酸在工业上也是种重要的四碳化合物，可以转化为很多重要的化学品，如脂肪酸、1,4－丁二醇、四氢映喃、y-丁内醋等；还可以作为单体用来合成生物可降解材料PBS（聚丁酸玻旧酸）和聚氨醋目前己有超过250种以苯为原料的化工产品可以通过丁二酸转化获得，因此丁二酸的市场需求不断增加。目前市场上销售的丁二酸都是以液化石油气或石油为原料化学法生产的。由于化学法生产丁二酸的成本过高，丁二酸销量和产量并不高，应用领域收到很大限制。
尽管戊二胺及丁二酸可以通过生物法高效合成，但是在各自的生产和纯化过程中大量的酸碱溶液被用于进行pH的中和，从而产生大量的废弃盐，使得后续的工艺过程变得复杂化。通过耦合戊二胺及丁二酸的合成过程则可以有效的解决由pH中和剂引起的问题，因为共生产体系的pH可以由碱性产物戊二胺和酸性产物丁二酸自身调节。此外，前期研究中Li等人以乙醇为溶剂通过醇析法结晶获得己二胺十二烷二酸盐的并用于合成PA6.12。因此，利用耦合生产pH调节策略，发酵液中的产物戊二胺和丁二酸可能可以直接成盐并通过醇析法直接从发酵液中分离结晶获得戊二胺丁二酸盐，PA5.4的聚合工艺可能会大大简化。在厌氧发酵生产丁二酸时，需要CO2作为底物参与到丁二酸代谢合成途径中。相反，CO2会作为副产物在赖氨酸脱羧酶催化L-lys脱羧生成戊二胺的过程中释放。因此，耦合戊二胺及丁二酸生产过程的另一个优点就是开发了一种可以固定二氧化碳、减少温室气体排放及碳损失的绿色合成途径。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用，该菌株构建方法方法成本低，能够固定二氧化碳、减少温室气体排放，降低碳损失，适合大规模生产。
一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建，将赖氨酸脱羧酶EcCadA-M3构建到高产丁二酸生产菌株E. coli AFP111中，所述赖氨酸脱羧酶EcCadA-M3为经过突变改造后pH耐受性有所改善的酶，即得重组大肠杆菌SC01。
作为改进的是，将经过突变改造后pH耐受性有所改善的赖氨酸脱羧酶基因EcCadA-M3，与载体pCDFDuet-1连接，并转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序。
作为改进的是，制备高产丁二酸生产菌株E. coli AFP111的化转感受态。
作为改进的是，将构建好的pCDFDuet- CadA-M3转化至E.coliAFP111的化转感受态中，得到E.coliSC01。
上述构建所得重组大肠杆菌SC01在合成戊二胺和丁二酸上的应用。
作为改进的是，所述应用包括以下步骤：
步骤1，L-赖氨酸脱羧酶在E.coliAFP111中的表达验证；
步骤2，L-赖氨酸脱羧酶在宿主菌株E.coliAFP111 中表达后的酶活验证；
步骤3，验证EcCadA-M3的表达对宿主菌株E.coliAFP111的代谢过程中生物量及丁二酸产量的影响；
步骤4，将100 μL过夜培养的E.coliSC01种子液接种于100 mL含有34 mg/L Cm抗性、50mg/L Kana抗性、80 mg/L Sm抗性及15g/L葡萄糖的LB培养基中，于37ºC，200 rpm条件下培养，当OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5 mM的IPTG对菌株进行诱导，并继续于37ºC，200rpm条件下培养合成戊二胺，诱导20 h后，将补加了20 g/L葡萄糖的发酵液转移到灭过菌且密封的蓝盖烧瓶中，向其中通入CO2并维持2 min，确保体系的厌氧环境，厌氧培养生产丁二酸。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用的优势在于：
1、由于共生产体系的pH可以由碱性产物戊二胺和酸性产物丁二酸自身调节，因此通过耦合戊二胺及丁二酸的合成过程则可以有效的解决由pH中和剂引起的问题；
2、利用耦合生产pH调节策略，发酵液中的产物戊二胺和丁二酸可以直接成盐并通过醇析法直接从发酵液中分离结晶获得戊二胺丁二酸盐，大大简化了PA5.4的聚合工艺；
3、耦合戊二胺及丁二酸生产过程可以固定二氧化碳、减少温室气体排放及碳损失，极大地简化了工艺，节约成本。
附图说明
图1为重组菌株E.coliAFP111中L-赖氨酸脱羧酶表达的SDS-PAGE图；M：marker；1：E.coliSC01 未诱导组细胞破碎上清液；2：E.coliSC01 未诱导组细胞碎片沉淀；3：E.coliSC01诱导组细胞破碎上清液；、4：E.coliSC01诱导组细胞碎片沉淀；
图2为重组菌株E.coliAFP111中L-赖氨酸脱羧酶酶活情况；
图3为EcCadA-M3的表达对宿主菌株E.coliAFP111的代谢过程中生物量及丁二酸产量的影响，其中，（A）：过表达EcCadA-M3对宿主菌株生物量；（B）：过表达EcCadA-M3对丁二酸产量的影响。
具体实施方式
以下实施例中未提及的技术手段，均为本领域常规技术手段。所用材料和仪器，也均为商品化的物质。
本实验中大肠杆菌AFP111由南伊利诺大学赠予，大肠杆菌Trans1-T1，质粒pETDuet-1均为商业化物品，可以常规购买。
实施例1 E.coliSC01表达菌株的构建
1、pCDFDuet-CadA-M3质粒的构建
选取实验室现有经过突变改造后pH耐受性有所改善的赖氨酸脱羧酶EcCadA-M3（ 见申请号为201810787121.3的专利），与载体pCDFDuet-1连接，并转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序；
将阳性菌株接种至5ml LB/Sm 液体培养基，LB/Sm 液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm 条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pCDFDuet-CadA-M3。
2、E.coliAFP111化转感受态的制备
选取一株高产丁二酸的生产菌株E.coliAFP111，接种至5ml LB/Cm/KanR 液体培养基，LB/Cm/KanR 液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm 条件下振荡培养过夜得到种子液。
将种子液全部转接到50ml LB/Cm/KanR 液体培养基，LB/Cm/KanR 液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm 条件下振荡培养至OD600约为0.6时，冰浴15min，于4℃下6000r离心10min收集菌体；用20ml灭菌后的0.1mM的氯化钙重悬菌体，冰浴10min，4℃下6000r离心10min收集菌体（重复两次），最后用1ml灭菌后的0.1mM的氯化钙+15%甘油重悬细胞，冰浴5min，即得E.coliAFP111化转感受态。每个100μL分装于1.5mL的无菌离心管，于-80℃保存。
3、构建E.coliSC01
将构建好的pCDFDuet- CadA-M3转化至E.coliAFP111的化转感受态中，得到E. coli SC01。
实施例2 耦合生产戊二胺和丁二酸过程验证
1、L-赖氨酸脱羧酶表达验证
丁二酸生产菌株E.coliAFP111是一株敲除了基因pfl、ldhA及ptsG的基因工程改造菌株。为了强化E. coli AFP111中L-赖氨酸到戊二胺的催化合成途径，将经过突变改造后pH耐受性有所改善的EcCadA-M3连接到表达载体pCDFDuet-1上，并导入E. coli AFP111中，构建得到一株可用于戊二胺及丁二酸共生产的重组菌株E. coli SC01。将菌株SC01诱导后进行细胞破碎及SDS-PAGE蛋白电泳。
结果如图1所示，在78 kDa分子量附近观察到明显的可溶性蛋白过表达条带，与目的蛋白大小一致。然而，因为EcCadA-M3是来源于E.coli的诱导型脱羧酶，所以即使在E.coli代谢过程中没有被诱导，也可以观察到CadA 少量的本体表达。
2、L-赖氨酸脱羧酶在宿主菌株E. coli AFP111 中表达后的酶活验证
将E. coli SC01 用于催化150 g/L 的L-赖氨酸脱羧生成戊二胺。结果如图2所示，在外源添加了0.1 mM PLP 的情况下，反应半个小时后，生成的戊二胺浓度为101.2 g/L，产率为1.775 mol/g(DCW)/h。对比之前的文献报道，Tonomri 等人对过表达LDC 的重组E. coli 的细胞经过热处理、低温冻融等处理后用于全细胞转化生成戊二胺，最终戊二胺的产率仅为0.187 mol/g(DCW)/h；李乃强等人利用一株含有LDC突变体的菌株E. coli LN3014进行全细胞转化生成戊二胺，最终戊二胺产率为0.887 mol/g(DCW)/h。这些结果表明，EcCadA- M3在E. coli AFP111的表达及酶活没有受到任何影响，仍可以用作生物催化剂高效催化生成可观数量的戊二胺。
3、L-赖氨酸脱羧酶表达对宿主菌株E. coli AFP111的代谢过程中生物量及丁二酸产量的影响验证
图3A中的结果显示两株菌株之间的细胞生长趋势及生物量没有明显差异。同样的，如图3B所示，在厌氧发酵62 h后，E. coli SC01代谢合成的丁二酸产量为11.6 g/L，对葡萄糖的收率为0.85 g/g。其中，丁二酸的产量与对照组菌株AFP111合成的丁二酸产量（10.81g/L）相当。
这些结果表明，EcCadA-M3的表达并不会影响宿主菌株的生长，以及丁二酸的代谢合成。因此，利用重组菌株E. coli SC01耦合丁二酸生物发酵及戊二胺生物转化过程是可行的。
实施例3 耦合生产戊二胺和丁二酸
将100 μL过夜培养的E.coliSC01种子液接种于100 mL含有34 mg/L Cm抗性、50 mg/LKana抗性、80 mg/L Sm抗性及15g/L葡萄糖的LB培养基中，于37ºC，200rpm条件下培养。当OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5 mM的IPTG对菌株进行诱导，并继续于37ºC，200rpm条件下，诱导20 h后，将补加了20g/L葡萄糖的发酵液转移到灭过菌且密封的蓝盖烧瓶中，向其中通入CO2并维持2min，确保体系的厌氧环境，厌氧培养生产戊二胺和丁二酸，其摩尔收率分别达到了25%和37%。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建，其特征在于，将赖氨酸脱羧酶EcCadA-M3构建到高产丁二酸生产菌株E.coliAFP111中，所述赖氨酸脱羧酶EcCadA-M3为经过突变改造后pH耐受性有所改善的酶，即得重组大肠杆菌SC01。
2.根据权利要求1所述的一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建，其特征在于，将经过突变改造后pH耐受性有所改善的赖氨酸脱羧酶基因EcCadA-M3，与载体pCDFDuet-1连接，并转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序。
3.根据权利要求1所述的一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建，其特征在于：制备高产丁二酸生产菌株E.coliAFP111的化转感受态。
4.根据权利要求1所述的一种耦合产戊二胺和丁二酸的重组大肠杆菌的构建，其特征在于：将构建好的pCDFDuet- CadA-M3转化至E.coliAFP111的化转感受态中，得到E.coliSC01。
5.基于权利要求1构建所得重组大肠杆菌SC01在合成戊二胺和丁二酸上的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，L-赖氨酸脱羧酶在E.coliAFP111中的表达验证；
步骤2，L-赖氨酸脱羧酶在宿主菌株E.coliAFP111 中表达后的酶活验证；
步骤3，验证EcCadA-M3的表达对宿主菌株E.coliAFP111的代谢过程中生物量及丁二酸产量的影响；
步骤4，将100 μL过夜培养的E.coliSC01种子液接种于100 mL含有34 mg/L Cm抗性、50mg/L Kana抗性、80 mg/L Sm抗性及15g/L葡萄糖的LB培养基中，于37ºC，200 rpm条件下培养，当OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5 mM的IPTG对菌株进行诱导，并继续于37ºC，200rpm条件下培养合成戊二胺，诱导20 h后，将补加了20 g/L葡萄糖的发酵液转移到灭过菌且密封的蓝盖烧瓶中，向其中通入CO2并维持2 min，确保体系的厌氧环境，厌氧培养生产丁二酸。
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CN113005155A (zh) * 2021-03-17 2021-06-22 南京工业大学 一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法

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