CN110564789A - 一种利用大肠杆菌发酵生产l-茶氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用大肠杆菌发酵生产L‑茶氨酸的方法,属于生物工程技术领域,所述方法是在发酵培养过程中,将发酵罐中的大肠杆菌培养至OD为20‑30时,向发酵罐中添加D~木糖使D~木糖的浓度为5~20g/L并调温至28~35℃诱导4~5h;然后以发酵液与乙胺溶液体积比为100~300:1的恒定流速补加体积浓度为40‑80%的乙胺溶液,继续在pH6.5~7.5、温度35~40℃、溶氧10~40%的条件下发酵培养20‑30h,合成L‑茶氨酸。发酵周期短、产酸效率高、菌体密度高;底物转化率高;而且工艺简单,环境污染低,降低了L~茶氨酸的生产成本,有利于工业化生产的推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体地,涉及一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法。。
背景技术
L~茶氨酸(L~theanine),是存在于茶叶中的一种氨基酸。其可促进大脑表皮 α 波的形成而让人感觉放松,可降低人体内 5~羟色胺的浓度起到降血压的作用,并在肿瘤治疗和神经保护等方面也有广泛的应用。美国食品与药物管理局(FDA)已确认 L~茶氨酸是一种公认安全(GRAS)的产品。
γ~谷氨酰基转肽酶 ( γ~glutamyltranspeptidase,GGT,EC 2.3.2.2)是谷胱甘肽代谢途径中的关键酶,是由大、小亚基组成的异源二聚体,其催化的反应有2种类型:一种是催化γ~谷氨酰基化合物的水解反应,另外一种是催化γ~谷氨酰基化合物中的γ~谷氨酰基转移到氨基酸或多肽等物质上的转肽反应。Suzuki 等首先报道了E.coli K~12 SH642来源的GGT能够催化L~谷氨酰胺与乙胺生成L~茶氨酸。该反应无需对反应物进行保护和脱保护,反应过程不需要ATP的参与,因此利用GGT来催化合成L~茶氨酸已成为目前研究的热点。王丽鸳等利用大肠杆菌 E.coli BL21 (DE3) /pET32a~GGT催化L~谷氨酰胺与乙胺合成L~茶氨酸,该工程菌在pH9.5,32~37 ℃下能催化合成的产量为20.9 g/L。帅玉英等利用Bacillus subtilis SK11.004来源的GGT在 pH10.0,37 ℃下,以20 mmol/L L~谷氨酰胺为底物,摩尔转化率可达95%。ShrutiBindal 等利用Bacillus licheniformis ER~15来源的rBLGGT,80 mmol/L L~谷氨酰胺为初始底物,经3次补加后可催化合成L~茶氨酸35.2 g/L。
发明内容
为了解决现有技术中的不足,本发明的目的在于提供一种利用大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的方法,所述方法是在发酵阶段加入D-木糖低温诱导,然后加入乙胺,在一定的发酵条件下进行产酸发酵,周期较短,L-产氨酸的产量和得率较高。
为了实现上述目的,本发明采用的具体方案为:
一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法,所述方法是在发酵培养过程中,将发酵罐中的大肠杆菌培养至OD为20-30时,向发酵罐中添加D~木糖使D~木糖的浓度为5~20g/L并调温至28~35℃诱导4~5h;然后以发酵液与乙胺溶液体积比为100~300:1的恒定流速补加体积浓度为40-80%的乙胺溶液,继续在pH6.5~7.5、温度35~40℃、溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h,合成 L-茶氨酸。
作为对上述方案的进一步优化,所述方法包括菌种活化、种子培养和发酵培养;
所述种子培养是将活化菌种接种到种子培养基中进行培养,培养条件为:温度35~40℃、摇床转速200rmp、培养至OD为10-20;
所述发酵培养是将菌种以5-15%的接种量接种至发酵培养基后进行产酸发酵,培养条件为:初始发酵温度35~40℃,空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~40%,发酵pH值控制在6.5-7.5之间,摇床转速200rmp。
作为对上述方案的更进一步优化,所述种子培养基的配方为:葡萄糖20~30g/L,K2HPO4 10-20g/L, MgSO4·7H2O 0.5~3.0g/L,KH2PO4 10-20g/L,酵母粉0.5-5.0g/L,(NH4)2SO4 5.0~10.0g/L,微量元素5~10.0mL/L,pH6.7。
作为对上述方案的更进一步优化,所述发酵培养基的配方为:葡萄糖20~30g/L,K2HPO4 10-20g/L,MgSO4·7H2O 0.5~3.0g/L,酵母粉0.5-3.0g/L,(NH4)2SO4 5.0~10.0g/L,微量元素5~10.0mL/L,初始pH7.0。
有益效果:
1、本发明所述方法采用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸,该菌株发酵为好氧发酵,菌体生长快;在产酸发酵阶段,首先采用D-木糖低温诱导,然后加入乙胺提供L-茶氨酸的合成原料,茶氨酸合成酶具有高度专一性,只能催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸;然后在整个发酵***的调控下,使得L-茶氨酸的产量显著增高。
2、采用本发明所述发酵方法,发酵周期短,菌体密度大。 L~茶氨酸的产量和得率高、糖酸转化率高的优点,代谢副产物较少,生产成本降低,方便提取。
具体实施方式
一种利用大肠杆菌菌株发酵法生产 L~茶氨酸的方法。具体步骤如下:
1、大肠杆菌菌株发酵法生产 L~茶氨酸
斜面培养:大肠杆菌原始菌株经斜面活化,生化培养箱37℃培养20h,再经梯度稀释,涂布于完全培养基(LB)上,挑取单个菌落分别接种到斜面上,生化培养箱35~40℃培养12-20h。
种子培养:挑取单菌落接种到种子培养基中,培养条件:温度35~40℃、摇床转速200rmp,培养OD值长到10.0~20.0。
发酵培养:接种到发酵培养基中,接种量:5~~15%,培养条件:初始发酵温度35-40℃,空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~40%,发酵pH值控制在6.5-7.5之间,摇床转速200rmp,当培养OD值达到20~30,添加D~木糖使得D~木糖的浓度为5~20g/L,并降温至28~35℃诱导4~5h后,开始以发酵液与乙胺溶液体积比为100~300:1的恒定流速补加体积浓度为40-80%的乙胺溶液,继续在pH6.5~7.5、温度35~40℃,溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h,发酵结束后得含有L-茶氨酸的发酵液。
所述种子培养基,其各组分的含量为:葡萄糖20~30g/L,K2HPO410~20g/L, MgSO4·7H2O 0.5~3.0g/L,KH2PO4 10~20g/L, 酵母粉0.5~5.0g/L,(NH4)2SO4 5~10.0g/L,微量元素5~10.0mL/L,pH 6.7。
所述发酵培养基,其各组分的含量为:葡萄糖20~30g/L,K2HPO4 10~20g/L,MgSO4·7H2O 0.5~3.0g/L, 酵母粉0.5~3.0g/L,(NH4)2SO4 5~10.0g/L,微量元素5~10.0mL/L,初始pH 7.0。
2、从大肠杆菌发酵液中提取 L~茶氨酸的方法
将上述所得发酵液加热到40~60℃,用2mo1/L盐酸调节pH至2~5范围内,加入无水亚硫酸氢钠,过30nm陶瓷膜微滤,纯化水清洗2~3次,得到上清液;取上清液过1000~5000分子量的中空纤维束膜,此时 L~茶氨酸回收率为92.3~95.4%。将上清液过强酸性阳离子交换柱,条件为静态吸附:按20%体积比加入阳离子树脂,搅拌吸附1h;动态吸附:按15%体积装柱树脂,流速按2BV/h进料,末期用0.5~1BV水冲柱;收集上清液。将上清液按体积比0.5~1%加入活性炭60℃脱色0.5~2h,过滤除炭。收集得到 L~茶氨酸上清液进行真空浓缩,按照下列条件进行:真空度~0.1MPa,旋转速度100~200rpm,温度50℃~80℃浓缩。将 L~茶氨酸浓缩液进行降温结晶。提取收率为70.0~88.5%。
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
接种大肠杆菌原始菌株到斜面,生化培养箱37℃培养20h,再经梯度稀释,涂布于完全培养基(LB)上,挑取单个菌落分别接种到斜面上,生化培养箱35~40℃培养20h。挑取单菌落接种到500mL种子瓶中,培养条件:温度35~40℃、摇床转速200rmp培养OD值长到10.0。
接种到发酵培养基中,接种量:7%,培养条件:初始发酵温度35-40℃,摇床转速200rmp,当培养OD值达到20,添加D~木糖使得D~木糖的浓度为5g/L,并降温至28~35℃诱导4~5h后,开始以发酵液与乙胺溶液体积比为100:1的恒定流速补加体积浓度为40%的乙胺溶液,继续在pH7.0~7.2、温度35~40℃,溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h,发酵结束后检测 L~茶氨酸含量为38.37g/L。
作为对照,采用相同的发酵方法,在发酵阶段补加相同浓度的乙胺盐酸盐溶液,检测 L~茶氨酸含量为25.65g/L。采用本发明所述方法,相比对照,产量提高了49.95%。
实施例2
从新鲜斜面上挑取一环大肠杆菌接种到500mL种子瓶中,培养条件:温度35~40℃、摇床转速200rmp,当OD值长到15.0时,将摇瓶种子以10%的接种量接入装有3L发酵培养基的5L全自动发酵罐中进行二级种子培养。培养温度35~40℃,罐压0.01~0.05MPa,空气流量1~8L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~50%,pH值控制在6.5~7.5之间,培养时间为5~8h。
将二级种子以10%接种量接入装有18L发酵培养基的30L全自动发酵罐中进行产酸发酵。发酵初始温度35~40℃,罐压0.01~0.15MPa,空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~40%,发酵pH值控制在6.5~7.5之间,摇床转速200rmp,当培养OD值达到25,添加D~木糖使得D~木糖的浓度为15g/L,并降温至28~35℃诱导4~5h后,开始以发酵液与乙胺溶液体积比为300:1的恒定流速补加体积浓度为70%的乙胺溶液,继续在pH6.5~7.2、温度35~40℃,溶氧10~50%的条件下发酵培养20-30h,发酵结束后检测L-茶氨酸含量为120.33g/L。作为对照,采用相同的方法,在发酵阶段补加相同浓度的乙胺盐酸盐溶液,检测L~茶氨酸含量为67.24g/L。采用本发明所述方法,相比对照,产量提高了78.96%。
实施例3
从新鲜斜面上挑取一环大肠杆菌接种到500mL种子瓶中,培养条件:温度35~40℃、摇床转速200rmp,当OD值长到20.0左右时,将摇瓶种子接入装有0.6m3发酵培养基的2m3发酵罐中进行二级种子培养。培养温度35~40℃,罐压0.01~0.05MPa,空气流量0.1~0.6m3/min和搅拌速度100~300r/min使溶氧维持在10~50%,pH值控制在6.5~7.5之间,培养时间为5~8h。
将二级种子以10%接种量分别接入装有6 m3发酵培养基的10 m3发酵罐中进行产酸发酵。发酵初始温度35~40℃,罐压0.01~0.15MPa,使溶氧维持在10~40%,发酵pH值控制在6.5~7.5之间,摇床转速200rmp,当培养OD值达到30,添加D~木糖使得D~木糖的浓度为20g/L,并降温至28~35℃诱导4~5h后,开始以发酵液与乙胺溶液体积比为200:1的恒定流速补加体积浓度为80%的乙胺溶液,继续在pH6.5~7.2、温度35~40℃,溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h,发酵结束后检测L-茶氨酸含量为117.86g/L。作为对照,采用相同的方法,在发酵阶段补加相同浓度的乙胺盐酸盐溶液,检测 L~茶氨酸含量为61.25g/L。采用本发明所述方法,相比对照,产量提高了91.42%。
需要说明的是,以上所述的实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的保护范围,本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法,其特征在于:所述方法是在发酵培养过程中,将发酵罐中的大肠杆菌培养至OD为20-30时,向发酵罐中添加D~木糖使D~木糖的浓度为5~20g/L并调温至28~35℃诱导4~5h;然后以发酵液与乙胺溶液体积比为100~300:1的恒定流速补加体积浓度为40-80%的乙胺溶液,继续在pH6.5~7.5、温度35~40℃、溶氧10~40%的条件下发酵培养20-30h,合成 L-茶氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法,其特征在于:所述方法包括菌种活化、种子培养和发酵培养;
所述种子培养是将活化菌种接种到种子培养基中进行培养,培养条件为:温度35~40℃、摇床转速200rmp、培养至OD为10-20;
所述发酵培养是将菌种以5-15%的接种量接种至发酵培养基后进行产酸发酵,培养条件为:初始发酵温度35~40℃,空气流量5~50L/min和搅拌速度200~800r/min使溶氧维持在10~40%,发酵pH值控制在6.5-7.5之间,摇床转速200rmp。
3.根据权利要求2所述的一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法,其特征在于:所述种子培养基的配方为:葡萄糖20~30g/L,K2HPO4 10-20g/L, MgSO4·7H2O 0.5~3.0g/L,KH2PO4 10-20g/L,酵母粉0.5-5.0g/L,(NH4)2SO4 5.0~10.0g/L,微量元素5~10.0mL/L,pH67。
4.根据权利要求2所述的一种利用大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸的方法,其特征在于:所述发酵培养基的配方为:葡萄糖20~30g/L,K2HPO4 10-20g/L,MgSO4·7H2O 0.5~3.0g/L,酵母粉0.5-3.0g/L,(NH4)2SO4 5.0~10.0g/L,微量元素5~10.0mL/L,初始pH7.0。
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GR01 | Patent grant | ||
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