CN107760642B

CN107760642B - 一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN107760642B
Application number: CN201710904085.XA
Authority: CN
Inventors: 娄文勇; 区晓阳; 李慧娴; 宗敏华; 徐培; 魏萍
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2037-09-29
Also published as: CN107760642A

Abstract

本发明公开了一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明以大肠杆菌DH5α工程菌为宿主，将克隆得到的甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因依次连接在载体上得到重组质粒，并转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，诱导培养得到重组大肠杆菌。本发明的重组大肠杆菌同时含有甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因，能同时表达甲酰胺酶分解甲酰胺生成NH₄ ⁺和表达亚磷酸脱氢酶把亚磷酸盐氧化磷酸盐，为重组大肠杆菌工程菌提供生长繁殖所需要的氮源和磷源，而其他微生物不具备这两条获取营养途径，使重组大肠杆菌成为优势菌，解决了大肠杆菌在工业发酵中染菌问题，同时降低了发酵设备需求以及减少了抗生素的添加。

Description

一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

近年来，随着发酵行业的迅速发展，发酵技术、发酵设备不断发展更新，在发酵管理经验越来越丰富，技术手段越发成熟的情况下，各企业的发酵染菌率也有下降。但工业发酵过程中染菌现象还是时有发生，并且一旦染菌，不仅造成原材料浪费，而且会影响生产效率，费事费力，破坏生产计划、扰乱生产秩序等。所以，要解决发酵中的染菌依旧是发酵企业最关切的问题之一。发酵过程通常是微生物纯种培养过程，培养过程中只允许特定的微生物生长，如果发酵过程中除目的菌以外还有其他微生物存在，就视为染菌。染菌严重影响目的菌的生长，导致发酵失败。造成发酵染菌的原因很多，除了人为操作上的原因，设备造成的发酵染菌占了很大部分。

目前关于发酵染菌的研究多集中在发酵染菌的来源(途径)及相关的菌形、不同发酵阶段染菌对发酵的影响及防治措施、从设备角度的分析和防治等方面。发酵企业为了降低染菌率，主要是从发酵设备的维护和处理入手，比如控制发酵罐空气输入***和水循环***无菌过滤处理，确保蒸汽消毒***灭菌彻底，发酵环境卫生和物料处理，菌种的纯度等。但是微生物无处不在，特别是一些具有孢子结构的微生物，蒸汽消毒可能也不能把它们“杀死”。所以，在发酵工程中难免会有杂菌的污染。

针对染菌现象，研究者很少从营养物质底物谱的摄取进行研究，本研究以大肠杆菌宿主细胞作为研究对象，因为大肠杆菌是使用最广泛、最成功的表达体系。对大肠杆菌的营养代谢途径进行改造，使改造后的大肠杆菌工程菌能分解甲酰胺产生氨作为氮源和分解氧化亚磷酸盐成为磷酸盐作为磷源，改变其氮源和磷源的来源途径，使其在特定的MOPS培养基中能正常生长，而不同时具有这两条代谢途径的杂菌微生物就会由于缺乏氮源或磷源营养物质的来源而被“饿死”，从而使改造过的大肠杆菌工程菌成为特定培养基的优势菌，杂菌就不能生长繁殖。经改造的大肠杆菌优势工程菌的应用，一方面保证工程菌正常生长繁殖并表达质粒上的目标基因，另一方面还能在未灭菌的、开放式的发酵罐中进行发酵生产，而杂菌不能生长繁殖，而达到纯培养的目的。

在分子生物学中，基因的重组表达技术已经相当成熟，可以利用基因工程的手段把不同来源的基因实现在同一大肠杆菌中共表达，从而可以赋予大肠杆菌拥有其他菌株的一些特殊代谢功能，使其能在发酵工业中得到更广泛的应用，降低生产成本和设备要求。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌。该重组大肠杆菌同时含有甲酰胺酶(FOR)基因和亚磷酸脱氢酶(PTDH)基因，能同时表达甲酰胺酶分解甲酰胺生成NH₄ ⁺和表达亚磷酸脱氢酶把亚磷酸盐氧化磷酸盐，为重组大肠杆菌工程菌提供生长繁殖所需要的氮源和磷源，而其他不同时具有这两条代谢途径的微生物则会由于缺乏氮源和磷源的代谢途径而被“饿死”。

本发明的目的还在于提供所述的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法。该构建方法以大肠杆菌DH5α工程菌为宿主，将克隆自类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611的甲酰胺酶(FOR)基因和肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumonia.OU7的亚磷酸脱氢酶(PTDH)基因，分别连接在载体pETDuet-1的两个多克隆位点上，并将得到的重组质粒pETDuet-for-ptx转化入DH5α，再将得到的重组大肠杆菌DH5α(pETDuet-for-ptx)转化入大肠杆菌表达菌株E.coliBL21(DE3)中，得到重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)，并继续在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中诱导培养重组大肠杆菌。

含有甲酰胺酶基因的类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611和含有亚磷酸脱氢酶基因的肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7为构建重组大肠杆菌提供了相应的酶基因，把来源于不同菌株的酶基因通过PCR手段扩增出来，再把两个酶基因构建在同一大肠杆菌工程菌里，使两个酶基因得到表达，发挥其酶催化功能，实现重组大肠杆菌在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中正常生长繁殖并使其功能得到表达。

本发明的目的还在于提供所述的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)设计引物，PCR扩增甲酰胺酶基因

上游引物A1(5'-CGC

GATGAACGGACTGGGCGGCTTGAAC-3')，下划线斜体为BamH I酶切点；下游引物A2(5'-CCG

CGTCGCGCCGCGCCTCCCTTCGCTC-3')，下划线斜体为EcoR I酶切点；

以类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611的基因组为模板，克隆出1011bp的甲酰胺酶基因序列，命名为for；将克隆得到的基因序列for连接到载体pETDuet-1上的第一个多克隆位点，再将得到的重组载体pETDuet-for转化到大肠杆菌DH5α，得到含有重组载体pETDuet-for的重组大肠杆菌DH5α(pETDuet-for)；

(2)设计引物，PCR扩增亚磷酸脱氢酶基因

上游引物B1(5'-GA

GATGCTGCCGAAACTCGTTATAACTC-3')，下划线斜体为BglⅡ酶切点；下游引物B2(5'-GG

ACATGCGGCAGGCTCGGCCTTGGGC-3')，下划线斜体为KpnⅠ酶切点；

以肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7基因组为模板，克隆出1008bp的亚磷酸脱氢酶基因序列，命名为ptx；将克隆得到的基因序列ptx连接到pETDuet-for的第二个多克隆位点上，得到甲酰胺酶基因for和亚磷酸脱氢酶基因ptx同时连接到同一表达质粒的重组质粒，命名为pETDuet-for-ptx；将重组质粒pETDuet-for-ptx转化入DH5α，得到重组大肠杆菌DH5α(pETDuet-for-ptx)；

(3)转化表达重组菌株

从重组大肠杆菌DH5α(pETDuet-for-ptx)中提取重组质粒pETDuet-for-ptx，并将重组质粒pETDuet-for-ptx转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)；

(4)诱导培养重组大肠杆菌

将得到的重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)接种到LB培养基中，进行诱导培养后，收集菌体并加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，继续诱导培养重组大肠杆菌。

进一步地，步骤(1)中，所述类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611的甲酰胺酶基因序列如序列表SEQ1所示，片段长度为1011bp，编码337个氨基酸。

进一步地，步骤(1)中，所述类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611于2014年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2014458。

进一步地，步骤(1)中，所述PCR扩增的条件为：94℃反应5min；于98℃反应10s、55℃反应5s、72℃反应70s，并循环30次；再于72℃反应7min；最后降温至16℃。

进一步地，步骤(2)中，所述肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7的亚磷酸脱氢酶基因序列如序列表SEQ2所示，片段长度为1008bp，编码336个氨基酸。

进一步地，步骤(2)中，所述肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7于2017年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2017449。

进一步地，步骤(2)中，所述PCR扩增的条件为：94℃反应5min；于98℃反应10s、55℃反应5s、72℃反应70s，并循环30次；再于72℃反应7min；最后降温至16℃。

进一步地，步骤(4)中，所述诱导培养是在LB培养基中，37℃、180rpm培养12小时后，再接种于新鲜的LB培养基中，37℃、180rpm诱导培养至重组菌浓度至OD₆₀₀＝0.6，降温至20℃后，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导16h。

进一步地，步骤(4)中，所述收集菌体是将诱导培养结束后的菌液在4℃、8000rpm、离心5min后，再用预冷至4℃的生理盐水悬浮，再次4℃、8000rpm、离心5min，重复用盐水悬浮并离心的步骤两次，以洗除残留的LB培养基，收集菌体。

进一步地，步骤(4)中，所述含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，甲酰胺的终浓度为200mM，亚磷酸盐的终浓度为1.32mM。

进一步地，步骤(4)中，收集的菌体加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中后，菌体浓度OD₆₀₀＝0.1。

进一步地，步骤(4)中，所述继续诱导培养是在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中加入终浓度为0.2mM的IPTG，并于30℃、180rpm继续培养4天。

MOPS培养基中缺乏基础营养成分NH₄ ⁺和HPO₄ ^2-而添加有甲酰胺和亚磷酸盐，同时杂菌微生物不具备分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐获取营养成分的功能，使杂菌微生物缺乏氮源和磷源，使重组大肠杆菌由于具有高效的分解甲酰胺和氧化亚磷酸的功能而获得充足的营养成分而成为优势菌。

由上述任一项所述方法构建得到的能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌，其中，甲酰胺酶(FOR)基因和亚磷酸脱氢酶(PTDH)基因在大肠杆菌中是单一载体，采用双启动子实现的共表达，共表达载体为pETDuet-for-ptx，且甲酰胺酶(FOR)基因和亚磷酸脱氢酶(PTDH)基因都分别在含有GST标签的质粒pGEX-2T中实现可溶性表达。

构建得到的能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌，能同时表达甲酰胺酶分解甲酰胺生成NH₄ ⁺和表达亚磷酸脱氢酶把亚磷酸盐氧化磷酸盐，为重组大肠杆菌的正常生长繁殖提供氮源和磷源，而其他微生物由于缺乏拥有这两条途径，所以无法在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中生长繁殖，从而使重组大肠杆菌成为优势菌，防止重组大肠杆菌在生产发酵过程中被杂菌污染。

所述的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌应用于大肠杆菌工业发酵酶促合成包括抗体或药物中间体的有价值的物质。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明的重组大肠杆菌能同时表达甲酰胺酶分解甲酰胺生成NH₄ ⁺和表达亚磷酸脱氢酶把亚磷酸盐氧化磷酸盐，为重组大肠杆菌的正常生长繁殖提供氮源和磷源，而其他微生物由于缺乏拥有这两条途径，无法在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中生长繁殖，解决了大肠杆菌在工业发酵中染菌问题，同时降低了发酵设备需求以及减少了抗生素的添加；

(2)本发明通过基因工程的生物技术解决了大肠杆菌发酵过程中的染菌问题，目的性强，具有彻底有效性；

(3)本发明的重组大肠杆菌应用于大肠杆菌工业发酵酶促合成包括抗体或药物中间体的有价值的物质，使酶促合成包括抗体或药物中间体的有价值的物质的过程高效，合成的物质纯度高，无杂菌产物污染。

附图说明

图1为重组共表达质粒pETDuet-for-ptx的构建过程图；

图2为重组大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)在MOPS培养基中的生长曲线图；

图3为重组大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)同化代谢利用甲酰胺和亚磷酸盐而成为培养基中的优势工程菌过程图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，以下结合实施例及附图对本发明技术方案作进一步阐述，但所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不限制本发明。

本发明具体实施例中采用的类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611于2014年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2014458，并已完成全基因组测试，其中的甲酰胺酶基因的片段如序列表SEQ1所示，长度为1011bp，编码337个氨基酸。

本发明具体实施例中的肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7于2017年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌路珞珈山武汉大学，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO.M 2017449，且肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7为通过如下方法培养自主筛选得到，具体包括如下步骤：

采用的培养基为蒙金娜固体培养基(1L)：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，MgSO₄·H₂O0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.0036g，MnSO₄·H₂O0.03g，CaSO₄·2H₂O 1g，KH₂PO₃ 0.6g以及琼脂20g，超纯水定容至1L。

(1)富集培养：在厨房下水沟取样，取1mL样品，加入到100mL的无菌水中，充分摇匀，制成菌悬液；分别取1mL菌悬液接入到事先灭好菌的5mL富集培养基中，37℃富集培养48h；

(2)平板初筛：将富集培养后的菌液10倍逐级稀释，分别取稀释倍数为10^-3、10^-5、10^-7的菌悬液0.5mL涂布于含有亚磷酸盐的选择培养基平板，37℃培养48h，将长出来的较大的单菌落挑入斜面蒙金娜固体培养基，如此反复多次，直至确定为纯菌，使用斜面培养基保藏原始菌种。

自主筛选的肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7的16S rDNA与NCBI已公布的菌株Klebsiella sp.F5-1和Klebsiella sp.CCFM8375比对菌为99％。

自主筛选的肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7通过全基因组测试，其中的亚磷酸脱氢酶基因的片段如序列表SEQ2所示，长度为1008bp，编码336个氨基酸。

自主筛选的肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7的亚磷酸脱氢酶基因序列与NCBI网站公开的Klebsiella pneumonia strain AR、Klebsiella pneumonia strainMNCRE53的亚磷酸脱氢酶基因同源性为100％，与Pseudomonas stutzeri strain 273的亚磷酸脱氢酶基因的同源性为99％。

实施例1

甲酰胺酶基因for的获取

将类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611利用LB培养基在37℃、180rpm培养一天；将培养好的菌体于4℃、8000rpm、离心5min收集菌体，用生理盐水洗涤2次，以去掉残留的培养基，然后按照OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒的具体方法对类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611基因组进行提取；

以提取的Paenibacillus pasadenensis.CS0611基因组为模板，以A1(5'-CGC

GATGAACGGACTGGGCGGCTTGAAC-3')和A2(5'-CCG

CGTCGCGCCGCGCCTCCCTTCGCTC-3')分别为上、下游引物，采用PCR扩增甲酰胺酶基因；

PCR所用的酶试剂为TaKaRa公司的

HS DNA Polymerase with GCbuffer；PCR反应体系及条件如下：

PCR反应条件：94℃反应5min；再依次于98℃反应10s、55℃反应5s、72℃反应70s，并循环30次；最后于72℃反应7min。

将PCR扩增得到的DNA产物利用1wt％琼脂糖胶电泳，并使用OMEGA公司胶回收试剂盒，按照说明书步骤进行切胶回收，然后送检测序，结果显示已得到一段长度为1011bp的甲酰胺酶基因序列，命名为for。

实施例2

亚磷酸脱氢酶基因ptx的获得

亚磷酸脱氢酶基因来源于自主筛选的肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7，通过自主筛选得到，筛选培养基采用蒙金娜固体培养基(g)：葡萄糖10，(NH₄)₂SO₄ 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.3，NaCl 0.3，KCl 0.3，FeSO₄·7H₂O 0.0036，MnSO₄·H₂O 0.03，KH₂PO₃ 0.3，Agar 20，用超纯水定容至1L；

将在筛选平板上长出的单一菌落用接种针蘸取一下，然后继续在新的筛选平板进行分级划线，直到出现单一菌落，达到纯化，最终分离纯化出一株在此筛选培养基上长势很好的一株菌株，通过16S rDNA测序，结果显示为肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7。

按照OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒的具体方法对自主筛选的肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7基因组进行提取，以自主筛选的肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumonia.OU7的基因组为模板，以B1(5'-GA

GATGCTGCCGAAACTCGTTATAACTC-3')和B2(5'-GG

ACATGCGGCAGGCTCGGCCTTGGGC-3')分别为上、下游引物，采用PCR扩增亚磷酸脱氢酶基因；

PCR所用的酶试剂为TaKaRa公司的

HS DNA Polymerase with GCbuffer；PCR反应体系及条件如下：

将PCR扩增得到的DNA产物利用1wt％琼脂糖胶电泳，并使用OMEGA公司胶回收试剂盒，按照说明书步骤进行切胶回收，然后送检测序，结果显示已得到一段长度为1008bp的亚磷酸脱氢酶基因序列，命名为ptx。

实施例3

重组菌BL21(DE3)(pETDuet-for)的构建

将实施例1中得到的基因片段for和质粒pETDuet-1分别利用BamH I和EcoR I进行双酶切，上游引物下划线斜体为BamH I酶切点，下游引物下划线斜体为EcoR I酶切点，酶切条件为：37℃，酶切60min；

将酶切后的产物分别进行切胶回收，回收方法及步骤参照OMEGA公司的胶回收试剂盒；回收后利用1wt％琼脂糖胶电泳，检测回收率；然后将回收的目的片段和质粒进行连接，连接试剂盒采用Thermo Fisher SCIENTIFIC公司的T4DNA Ligase，连接体系如下：

目的片段与质粒摩尔比为3：1。

将连接产物转化入大肠杆菌DH5α，转化步骤如下：将10μL连接产物与100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入890μL LB培养基，37℃、180rpm摇床培养1h后，4000rpm离心5分钟收集菌体，取上清培养基890μL，将管底的菌体重悬，均匀地涂布在含氨苄抗性素LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素钠)，37℃培养16小时，待平板长出转化子后，挑取转化子进行PCR验证并送检测序，并利用DNAssist软件对测序结果进行ORF查找。

结果显示，得到甲酰胺酶基因序列for已正确地***pETDuet-1的第一个多克隆位点上，成功获得了pETDuet-for质粒，并转化入BL21(DE3)，得到重组菌BL21(DE3)(pETDuet-for)。

实施例4

重组菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)的构建

将实施例2得到的亚磷酸脱氢酶基因ptx和实施例3得到的pETDuet-for分别利用BglⅡ和Kpn I进行双酶切，上游引物下划线斜体为BglⅡ酶切点，下游引物下划线斜体为Kpn I酶切点，酶切条件为：37℃，酶切60min；

酶切体系、回收方法和连接转化方法与实施例3相同，具体重组质粒pETDuet-for-ptx的构建过程图如图1所示，先把甲酰胺酶基因亚克隆进质粒pETDuet-1第一个克隆位点，得到重组质粒pETDuet-for。再把第二段亚磷酸脱氢酶基因克隆进pETDuet-for的第二个多克隆位点，得到重组质粒pETDuet-for-ptx。

挑取克隆子进行PCR验证，并送检测序；结果显示，亚磷酸脱氢酶基因ptx已经成功地连接入pETDuet-for上的第二个多克隆位点，得到了重组质粒pETDuet-for-ptx，并把重组质粒转化入BL21(DE3)，得到的菌株即为所要构建的重组大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)。

实施例5

重组大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)在特定MOPS培养基中的生长

将获得的重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)进行诱导培养，具体过程如下：

将BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)按照体积比1：100接种到含有50mL的LB培养基，37℃、180rpm过夜培养12小时；进行诱导培养，取1mL过夜培养的重组大肠杆菌接种到装有100mL新鲜的LB培养基，于37℃、180rpm培养重组菌浓度至OD₆₀₀＝0.6，降温至20℃后，加入终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导16h后，4℃、8000rpm、离心5min收集菌体；

用生理盐水(4℃预冷)悬浮收集的菌体，4℃、8000rpm、离心5min收集菌体，并重复此步骤2次，洗除残留的LB培养基；再把菌体加入到含有甲酰胺(200mM)和亚磷酸盐(1.32mM)的基础MOPS培养基，使菌体OD₆₀₀为0.1，加入终浓度为0.2mM的IPTG，30℃、180rpm培养重组大肠杆菌。

考察重组菌在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中的生长情况，重组菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)在含有甲酰胺(200mM)和亚磷酸盐(1.32mM)的MOPS培养基中的生长曲线图如图2所示，由图2可知重组菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)能在该培养基中生长，到第三天后，菌浓度达到最大值，A₆₀₀为1.321；而对照菌株BL21(DE3)在该MOPS培养基基本没有生长。

重组大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)同化代谢利用甲酰胺和亚磷酸盐而成为培养基中的优势工程菌过程图如图3所示，大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)由于***了甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因，所以改造后的大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)既能分解甲酰胺成NH₄ ⁺，又能氧化亚磷酸盐成磷酸盐，从而能为大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)提供生长利用的氮源和磷源，而其他杂菌微生物由于缺乏同时拥有这两条途径，所以不能生长。

MOPS培养基缺乏NH₄ ⁺和HPO₄ ^2-，而是添加了甲酰胺和亚磷酸盐作为氮源和磷源的来源，重组大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)能表达甲酰胺酶和亚磷酸脱氢酶，甲酰胺酶能分解甲酰胺成为NH₄ ⁺，同时亚磷酸脱氢酶氧化亚磷酸盐成为磷酸盐，为重组菌BL21(DE3)(pETDuet-for-ptx)自身生长繁殖提供必需的营养物质(氮源和磷源)，而其他微生物由于不同时具有这两条代谢途径，就会缺乏两种营养物质(氮源和磷源)其中的一种或者同时缺乏两种营养物质而被“饿死”。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1014

<212> DNA

<213> 类芽孢杆菌(Paenibacillus pasadenensis. CS0611)

<400> 1

atgaacggac tgggcggctt gaacaaatcg ccggacggcg tcgtcatcgg cctcgcgcag 60

ctgcagctgc cggccgtcga gacgccggag cagctggcgg cgcaggcgag gcgcatcgcg 120

gagatgacgg ccaaggcgcg gaagggctcg cgctcgatgg atctgatcgt atttcccgaa 180

tattcgctgc atggcctatc gatgaatacc gatccggcgc tcatgtgccg ggtcgacggg 240

ccggaggtcg agctgtggcg ggaggcctgc cgcgagcatc gcatctgggg ctgcttcagc 300

atcatggagc tcaatccgga cggcaatccg tacaacacgg ggctcatcat cgacgacgaa 360

ggcggaatcc ggctgaagta ccgcaagctg catccgtggg tgccggtgga gccgtgggag 420

ccgggcgatc tcggcatccc gatgtgcgac gggccgaacg gcagccggtt ggcgctcgtc 480

atctgccatg acggcatgtt cccggaaatg gcgcgcgaat gcgcctatct cggtgcggac 540

atcatgctgc gcacggccgg ctatacggct ccgatccgcc atgcatggca ggtgacgaac 600

caggcgcacg ccttttgcaa cctgatgtac accgcctcgg tctgcctgag tggcagcgac 660

ggcgtcttcg actcgatggg cgaggcgatg atcgtcggct tcgacggcat gacgctcgtc 720

cacggcggcg gacggcccga cgagatcgtg gccggcgagg tgcggccgtc gctcgtccgc 780

gaggcgcgcc gcatctgggg cgtggagaac aacctgtacc agctcggcca tcgcggctac 840

gtcgcggtgc agggcggcgc aggcgactgt ccgtacacct acatgcatga tctcgccgcc 900

ggccgctacc ggctgccttg ggaggatgag gtgctcatca aggacggcac gagcgagggg 960

ttcccgccgc cggagcggcg atatggcgga gcgaagggag gcgcggcgcg atga 1014

<210> 2

<211> 1008

<212> DNA

<213> 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia. OU7)

<400> 2

atgctgccga aactcgttat aactcaccga gtacacgatg agatcctgca actgctggcg 60

ccacattgcg agctggtgac caaccagacc gacagcacgc tgacgcgcga ggaaattctg 120

cgccgctgtc gcgatgctca ggcgatgatg gcgttcatgc ccgatcgggt cgatgcagac 180

tttcttcaag cctgccctga gctgcgtgta gtcggctgcg cgctcaaggg cttcgacaat 240

ttcgatgtgg acgcctgtac tgcccgcggg gtctggctga ccttcgtgcc tgatctgttg 300

acggtcccga ctgccgagct ggcgatcgga ctggcggtgg ggctggggcg gcatctgcgg 360

gcagcagatg cgttcgtccg ctctggcgag ttccagggct ggcaaccaca gttctacggc 420

acggggctgg ataacgctac ggtcggcatc cttggcatgg gcgccatcgg actggccatg 480

gctgagcgct tgcagggatg gggcgcgacc ctgcagtacc acgaggcgaa ggctctggat 540

acacaaaccg agcaacggct cggcctgcgc caggtggcgt gcagcgaact cttcgccagc 600

tcggacttca tcctgctggc gcttcccttg aatgccgata cccagcatct ggtcaacgcc 660

gagctgcttg ccctcgtacg gccgggcgct ctgcttgtaa acccctgtcg tggttcggta 720

gtggatgaag ccgccgtgct cgcggcgctt gagcgaggcc agctcggcgg gtatgcggcg 780

gatgtattcg aaatggaaga ctgggctcgc gcggaccggc cgcggctgat cgatcctgcg 840

ctgctcgcgc atccgaatac gctgttcact ccgcacatag ggtcggcagt gcgcgcggtg 900

cgcctggaga ttgaacgttg tgcagcgcag aacatcatcc aggtattggc aggtgcgcgc 960

ccaatcaacg ctgcgaaccg tctgcccaag gccgagcctg ccgcatgt 1008

Claims

1.一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）设计引物，PCR扩增甲酰胺酶基因

上游引物A1即5'-CGC GGATCC GATGAACGGACTGGGCGGCTTGAAC-3'，下划线斜体为BamH I酶切点；下游引物A2即5'-CCG GAATTC CGTCGCGCCGCGCCTCCCTTCGCTC-3'，下划线斜体为EcoR I酶切点；

以保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M2014458的类芽孢杆菌（Paenibacillus pasadenensis.） CS0611的基因组为模板，克隆出1011 bp的甲酰胺酶基因序列，命名为for；将克隆得到的基因序列for连接到载体pETDuet-1上的第一个多克隆位点，再将重组载体转化到大肠杆菌DH5α，得到含有重组载体pETDuet-for的重组大肠杆菌DH5α；

（2）设计引物，PCR扩增亚磷酸脱氢酶基因

上游引物B1即5'-GA AGATCT GATGCTGCCGAAACTCGTTATAACTC-3'，下划线斜体为Bgl Ⅱ酶切点；下游引物B2即5'-GG GGTACC ACATGCGGCAGGCTCGGCCTTGGGC-3'，下划线斜体为Kpn Ⅰ酶切点；

以保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO. M 2017449肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia. ）OU7的基因组为模板，克隆出1008bp的亚磷酸脱氢酶基因序列，命名为ptx；将克隆得到的基因序列ptx连接到pETDuet-for的第二个多克隆位点上，得到甲酰胺酶基因for和亚磷酸脱氢酶基因ptx同时连接到同一表达质粒的重组质粒，命名为pETDuet-for-ptx；将重组质粒pETDuet-for-ptx转化入重组大肠杆菌DH5α；

（3）转化表达重组菌株

从重组大肠杆菌DH5α中提取重组质粒pETDuet-for-ptx，并将重组质粒pETDuet-for-ptx转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中；

（4）诱导培养重组大肠杆菌

将得到的重组表达菌株BL21(DE3)接种到LB培养基中，进行诱导培养后，收集菌体并加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，继续培养得到重组大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis. CS0611的甲酰胺酶基因序列如SEQ ID NO.1所示，片段长度为1011 bp，编码337个氨基酸；所述类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis. CS0611于2014年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M2014458。

3.根据权利要求1所述的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia. OU7的亚磷酸脱氢酶基因序列如SEQ ID NO.2所示，片段长度为1008 bp，编码336个氨基酸；所述肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia. OU7于2017年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO. M 2017449。

4.根据权利要求1所述的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤（1）、（2）中，所述PCR扩增的条件均为：94℃反应5min；于98℃反应10s、55℃反应5s、72℃反应70s，并循环30次；再于72℃反应7min；最后降温至16℃。

5.根据权利要求1所述的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤（4）中，所述诱导培养是在LB培养基中，37℃、180rpm培养12小时后，再接种于新鲜的LB培养基中，继续于37℃、180rpm培养至重组菌浓度至OD₆₀₀=0.6，降温至20℃后，加入终浓度为0.2 mM 的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导 16 h。

6.根据权利要求1所述的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤（4）中，所述收集菌体是将诱导培养结束后的菌液在4℃、8000rpm、离心5 min后，再用预冷至4℃的盐水悬浮，再次4℃、8000 rpm、离心5 min，重复用盐水悬浮并离心的步骤两次，收集菌体。

7.根据权利要求1所述的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤（4）中，所述含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，甲酰胺的终浓度为200 mM，亚磷酸盐的终浓度为1.32 mM。

8.根据权利要求1所述的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤（4）中，收集的菌体加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中后，菌体浓度OD₆₀₀=0.1；所述继续培养是在培养基中加入终浓度为0.2 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，并于30℃、180 rpm继续培养4天。

9.由权利要求1~8任一项所述方法构建得到的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌。

10.权利要求9所述的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌在大肠杆菌工业发酵酶促合成中的应用。