CN108342370B

CN108342370B - 一种新型果糖基肽氧化酶及其应用

Info

Publication number: CN108342370B
Application number: CN201710046116.2A
Authority: CN
Inventors: 杨广宇; 谢渊; 冯雁; 马富强
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: WUHAN NEW BIOCALYSIS SOLUTION Co.,Ltd.
Priority date: 2017-01-22
Filing date: 2017-01-22
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2037-01-22
Also published as: CN108342370A

Abstract

本发明涉及一组果糖基肽氧化酶突变体及其应用。本发明通过对果糖基肽氧化酶的突变体筛选，获得了稳定性明显提高的果糖基肽氧化酶突变体。本发明还涉及了果糖基肽氧化酶在催化果糖基肽化合物氧化脱糖基中的应用，可进一步用于检测糖化血红蛋白的试剂盒或传感器中。

Description

一种新型果糖基肽氧化酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种热稳定性提高的果糖基肽氧化酶及其在美德拉化合物脱糖基反应中的应用。

背景技术

人体内的糖化血红蛋白(HbA1c)是一种美德拉化合物(Amadori化合物)。血液中游离的葡萄糖将红细胞内的血红蛋白β链N端缬氨酸的游离氨基果糖基化，从而产生HbA1c。这个糖基化反应在体内持续、缓慢、不可逆地进行着，它的速度受血糖水平的直接影响。所以人体内HbA1c的浓度可以反映一段较长时间内的血糖水平。这就很好地克服了目前广泛使用的空腹测血糖受短期饮食、作息、药物等因素影响的弊端，因此，国际糖尿病联盟推出的新版亚太糖尿病防治指南中，明确指出糖化血红蛋白测定是国际公认的糖尿病监控“金标准”。

HbA1c水平测定依赖于果糖基肽氧化酶。HbA1c首先被蛋白酶消化成短肽，暴露出末端的果糖基缬氨酸(Fru-Val)或果糖基缬氨酸-组氨酸(Fru-Val-His)，在果糖基肽氧化酶的催化下，通过检测其过氧化物产物，就可以快速对HbA1c浓度进行定量。来自Eupenicillium terrenum ATCC 18547的果糖基肽氧化酶(Fructosylpeptide oxidase E,FPOX-E)(Biochem Biophys Res Commun.2003Nov 7；311(1):104-11)具有理想的底物选择性与较高的催化活性，很适合HbA1c的水平测定；但是，FPOX-E热稳定性较差，40℃保温2小时就有明显沉淀，在检测试剂的储存、运输的条件高，极大地限制了这一检测方法的应用。

因此，亟待获得一种高热稳定性且高活性的新型果糖基肽氧化酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种果糖基肽氧化酶突变体及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种果糖基肽氧化酶突变体，所述果糖基肽氧化酶与SEQ ID NO:2具有至少90％的氨基酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位置的突变，所述突变位点包括SEQ ID NO:2的第30、60、66、95、138、161、171、184、272或388位中的至少一个或者其相应的位置；所述的突变为在所述的突变位点上发生取代、***或删除一个或多个氨基酸残基。

优选地，所述果糖基肽氧化酶与SEQ ID NO:2具有至少93％的氨基酸序列一致性；更优选地，所述果糖基肽氧化酶与SEQ ID NO:2具有至少95％的氨基酸序列一致性。

优选地，所述的突变为取代突变，至少包含以下一个或多个氨基酸残基的取代：

第30位丝氨酸被精氨酸取代；或

第60位甘氨酸被天冬酰胺或丙氨酸或丝氨酸取代；或

第66位甘氨酸被天冬氨酸取代；或

第95位异亮氨酸被亮氨酸取代；或

第138位丙氨酸被酪氨酸或缬氨酸或异亮氨酸取代；或

第161位丙氨酸被天冬氨酸取代；或

第171位异亮氨酸被精氨酸取代；或

第184位甘氨酸被天冬氨酸取代；或

第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代；或

第388位组氨酸被酪氨酸取代。

更优选地，所述的突变为以上突变的组合，选自：

(1)包含第30位丝氨酸被精氨酸取代和第66位甘氨酸被天冬氨酸取代；或

(2)包含第66位甘氨酸被天冬氨酸取代和第95位异亮氨酸被亮氨酸取代；或

(3)包含第161位丙氨酸被天冬氨酸取代和第138位丙氨酸被异亮氨酸取代；或

(4)包含第161位丙氨酸被天冬氨酸取代和第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代；或

(5)包含第30位丝氨酸被精氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

(6)包含第161位丙氨酸被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

(7)包含第184位甘氨酸被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

(8)包含第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

(9)包含第66位甘氨酸被天冬氨酸取代、第161位丙氨酸被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

(10)包含第161位丙氨酸被天冬氨酸取代、第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

(11)包含第66位甘氨酸被天冬氨酸取代、第161位丙氨酸被天冬氨酸取代、第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

(12)包含第66位甘氨酸被天冬氨酸取代、第138位丙氨酸被异亮氨酸取代、第161位丙氨酸被天冬氨酸取代、第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代。

在另一优选实施例中，所述的突变为以上突变间的重新组合。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的果糖基肽氧化酶突变体。

在一优选实施例中，可以在所述多核苷酸的末端增加上用于下一步纯化与分析的分子标签，如组氨酸标签等。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体包括所述的多核苷酸。

在一优选实施例中，所述的表达载体选用pET-28a。

在本发明的另一方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞包括所述的表达载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

所述的基因工程化细胞可以为***，如枯草芽孢杆菌；也可以是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌；也可以是放线菌，如链霉菌；还可以是真菌，如酵母类、曲酶菌等其他宿主微生物；

在一优选实施例中，所述的基因工程化细胞选用大肠杆菌。

在本发明的另一方面，提供一种提高果糖基肽氧化酶热稳定性的方法，在生物酶法催化体系中，使用了所述的果糖基肽氧化酶。

在一优选实施例中，所述的生物酶法催化体系为体外酶法；

在一优选实施中，所述的生物酶法催化体系为全细胞催化；

所述的生物酶法催化体系还包括固定化酶催化、纯化后的酶催化以及含有人工代谢途径的细胞工厂等。

在本发明的另一方面，提供一种果糖基肽氧化酶在催化美德拉化合物氧化脱糖基中的应用，具体地，以美德拉化合物原料，在果糖基肽氧化酶的催化作用下，糖基从美德拉化合物上脱离，并生成过氧化物。

在一优选实施例中，美德拉化合物为糖化血红蛋白。

在一优选实施例中，美德拉化合物为糖化血红蛋白的蛋白酶解产物果糖基-缬氨酸-组氨酸二肽。

根据本发明，提供了具有优良热稳定性的果糖基肽氧化酶和编码果糖基肽氧化酶的基因，并将其用作糖尿病的诊断用酶。

在本发明的另一方面，提供了一种检测糖化血红蛋白的试剂盒，该试剂盒里包含有所述的果糖基肽氧化酶。

其检测方法为：在全血经溶血处理后，用特异蛋白内切酶将糖化血红蛋白酶解消化成果糖基肽，再经果糖基肽氧化酶作用下产生过氧化氢(hydrogen peroxide，H₂O₂)，H₂O₂的浓度与血液中糖化血红蛋白的含量成正比，H₂O₂在过氧化物酶的作用下与相应的色原耦联，从而根据颜色变化程度可得H₂O₂浓度，进而得知样本中糖化血红蛋白的含量。

在本发明的另一方面，提供了一种检测糖化血红蛋白的传感器，该传感器里包含有所述的果糖基肽氧化酶。

其检测方法为：将所述的果糖基肽氧化酶固定在载体上，载体包括但不限于无机材料、天然材料、高分子材料等，形成作用电极，与对极及参考电极一起***到适合本发明的缓冲液中，整个体系保持恒定稳定，在作用电极上施加固定电压，再加入待测样品，测量由反应产生的过氧化氢导致的电流强度的增加，从而得知样品中糖化血红蛋白的含量。

所述的对极优选为铂电极；

所述的参考电极优选为银电极或氯化银电极。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.FPOX-E晶体结构示意图及突变位点在结构上的分布。显示了突变位点在FPOX-E蛋白结构中的分布。图中可以看出，这25个突变位点均匀分布在蛋白结构中，其中，18个位于蛋白loop区，其余7个位于蛋白二级结构中。

图2.FPOX-E酶法与HPLC法检测血红蛋白的比较

具体实施方式

本发明人经过研究筛选，提供了一组新型的果糖基肽氧化酶，其具备显著提高的热稳定性。本发明的果糖基肽氧化酶特别适用于催化果糖基肽化合物的氧化脱糖基反应。本发明还提供了一种果糖基肽氧化酶在检测糖化血红蛋白试剂盒或传感器中的应用。

本发明提供了果糖基肽氧化酶FPOX-E的热稳定性提高的突变体，所述突变体的序列与SEQ ID NO:2具有至少90％至100％范围内的任意氨基酸序列一致性，且包含以下一个或多个位置的突变，所述的突变位点包括SEQ ID NO:2的第30、60、66、95、138、161、171、184、272、388位或它们的相应位置。

本发明还包括突变酶的衍生物和类似物。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的突变酶相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，果糖基肽氧化酶突变酶还包括具有与突变酶相同功能的、上述突变序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-3个、1-2个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(例如为300个以内，较佳地200个以内，更佳地100个以内，更佳地50个以内，例如40、30、20、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括突变酶的活性片段和活性衍生物。

本发明中，也包括为了增加突变酶的稳定性、半衰期、促进功效而对一个或几个氨基酸加以修饰后构成的修饰形式的多肽(通常不改变一级结构)，包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了抗水解性能或优化了溶解性能的突变酶。

本发明还提供了编码本发明果糖肌肽氧化酶的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。也即，“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还进一步提供了包含编码上述果糖基肽氧化酶或其突变体基因的重组载体，以及包含所述重组载体的转化体(例如本发明所述的微生物)。

本发明所述的重组载体，应理解为现有技术中任意的基因的重组载体，例如各种质粒，即将果糖基肽氧化酶突变体的突变基因导入能使该果糖基肽氧化酶突变体稳定表达的DNA载体质粒。

而所述的重组载体的转化体，即指重组载体的宿主细胞，例如，本发明实施例1所述的微生物E.coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL的宿主细胞；当然，现有技术常用的宿主细胞的微生物包括***如枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，放线菌如链霉菌，酵母如酿酒酵母，真菌如曲霉菌，它们的细胞均是常用的重组载体的宿主细胞。

美德拉化合物(Amadori化合物)是还原糖和氨基化合物发生非酶促棕色化反应所生成的一类关键化合物，基本结构为1-胺基-1去氧-2酮糖，如葡糖胺在酸的作用下开环，一位生成烯胺，五位变成羟基。通过葡糖胺重排，二位变为酮，五位上的羟基进攻酮羰基，关环后，获得果糖胺。

生物酶法催化体系为一类利用生物酶为催化剂，实现氧化、合成、水解等功能，制备或生产相应大分子或小分子化合物的过程，现有主要的生物酶法反应***包括，体外酶法、全细胞催化、固定化酶催化、纯化后的酶催化以及含有人工代谢途径的细胞工厂等。

体外酶法催化是指酶在体外作为催化剂进行工业生产。

全细胞催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行生物转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化。

固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。固定化酶催化是指用固定化酶作为催化剂在体外进行的催化反应。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所述的生物材料的来源的一般性说明：

1、引物合成：本发明中所使用的引物均由苏州金唯智公司合成制备。部分引物采用简并碱基，相关的简并碱基包括：

n为a，c，g或t；k为g或t；m为a或c。

2、实验中所使用T4DNA连接酶等购自于NewEngland Biolabs公司；PrimeSTAR HS高保真酶购自TakaRa公司；限制性内切酶均购自于Fermentas公司；使用的DNA胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自于Axygen公司。

3，本发明所改造的果糖基肽氧化酶来自Eupenicillium terrenum ATCC 18547的果糖基肽氧化酶(Fructosylpeptide oxidase E,FPOX-E)

实施例1野生型果糖基氧化酶FPOX-E基因的克隆

野生型果糖基肽氧化酶FPOX-E基因以大肠杆菌为宿主进行密码子优化(SEQ IDNO：1，编码蛋白序列为SEQ ID NO：2)，并由苏州金唯智公司合成，通过以下引物以扩增目的基因。

上游引物5’-ATCGCACATATGGCCCATTCACGCGCAAGCA-3’

(带下划线碱基为限制性内切酶NdeI识别位点，SEQ ID NO：3)

和下游引物5’-ATCGGACTCGAGTTACAGGTGGGCGTCATGCTT-3’

(带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点，SEQ ID NO：4)

该PCR反应使用Takara的PrimeSTAR HS聚合酶，PCR反应条件为：98℃2min，然后98℃10sec，55℃15sec，72℃90sec，共25个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到1.4kb大小的条带，与预期结果相符。DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET28a(Novagen)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明克隆的果糖基肽氧化酶FPOX-E基因序列正确，且正确连入pET28a中，将该重组质粒命名为pET28a-FPOX-E。

实施例2 FPOX-E的表达、纯化及活力测定

将甘油管中的工程菌按体积比1％接种到含100ug/mL卡那霉素的4mL LB培养基试管中，37℃220rpm培养12h。将该4mL菌液转接至含50μg/mL卡那霉素的1L LB培养基摇瓶中，37℃220rpm培养约2.5h，使OD600达到0.9左右，加入0.1mM IPTG诱导剂，25℃200rpm诱导培养12-16h。将发酵后收获的大肠杆菌菌体悬液超声破碎，再经过一步Ni-NTA亲和层析处理后就能得到95％以上纯度的目的蛋白。

果糖基肽氧化酶活力测定参见文献Biosci Biotechnol Biochem.2002Jun；66(6):1256-61。果糖基肽氧化酶半衰期的测定方法为：在一定温度下下孵育酶液，在不同处理时间取样，测定果糖基肽氧化酶残余活力百分比。以残余活力百分比的ln值对时间t(min)作图，直线的斜率为失活常数k_inact，由t_1/2＝ln2/k_inact得到果糖基肽氧化酶在该温度下的半衰期。

实施例3 FPOX-E突变热点的选择

1.我们获得了FPOX-E的晶体，并通过X-ray衍射的方法对其结构进行解析。并筛选出最有可能提高FPOX-E热稳定性的突变体，筛选条件如下：

(1)判断某一位点为待选位点的标准为：①该家族大多数蛋白在该位点处氨基酸丰度总体高度较高；②该位点氨基酸保守；③该位点出现频率较高的氨基酸与FPOX-E该位点处的氨基酸有较大的理化性质差异，如电荷差异、极性强弱、空间位阻大小等。

(2)除去活性中心附近，即距离催化残基(283位谷氨酸)

范围内的氨基酸残基，除去处于包埋或半包埋状态的氨基酸残基。

经过两步筛选，此时共剩余106个差异位点，大多数位于蛋白分子的表面。

(3)根据FPOX-E晶体结构，逐个详细分析上述106种突变形式，筛选出可能提高FPOX-E热稳定性的突变体。

主要判断准则为：①突变应消除原有的不利于热稳定的作用力形式，如静电排斥作用、电荷聚集等；②突变不应破坏现有的利于热稳定的作用力形式和稳定的蛋白结构；③突变应引入新的利于热稳定的作用力形式，如氢键、盐桥、疏水相互作用等。

共设计单点突变体25个：

L25Y，S30R，V42K，G66D，Q70R，Q80R，N81E，F89Y，G103E，V126H，L135R，A136R，A138Y，A161D，I171R，F172E，G184D，G184K，G186T，T199R，D229K，A238R，N272D，N356H，H388Y

2.Fold-X方法设计

Fold-X(http://foldxsuite.crg.eu/)是一款生物信息算法软件，它主要提供相互作用对于蛋白(复合物)稳定性影响的快速量化的估计。输入果糖基肽氧化酶晶体结构文件，我们编写脚本用Fold-X对果糖基肽氧化酶每个位点的饱和突变前后能量变化进行计算，并通过排序得出了突变后能量变化较大的几个位点，分别是：G60，W79，I95，I303，C347，A402，P429这7个位点。

3，B-factor筛选策略

B-factor是基于结构生物学和生物信息学的一个方法。我们利用果糖基肽氧化酶的晶体结构和Reetz团队提供的B-FITTER软件就可以计算出蛋白的B因子值。B-FITTER软件能够计算各个氨基酸的B-factor值作为它的除氢以外所有原子的平均B-factor值，从而产生一个根据B-factor排序的输出文件。我们选取B-factor值最高的前20个位点，结合Fold-X的结果，我们选择了以下8个突变位点进行饱和突变库的构建，分别是：S30，G60，W79，I95，E102，S130，A138和N272。

实施例4 FPOX-E突变体的构建、表达、纯化及性质表征

1，定点突变体的构建

以重组质粒pET28a-FPOX-E为模板，以带有突变位点的一对互补的寡核苷酸为引物，用PrimeSTAR HS高保真酶(TakaRa公司)进行全质粒PCR扩增，获得具有特定突变位点的重组质粒。引物序列如下：

L25Y

5'TAGTTCCACGGCTTACCACCTGATTCGTTC 3'(SEQ ID NO：5)

5'GAATCAGGTGGTAAGCCGTGGAACTACCGA 3'(SEQ ID NO：6)

S30R

5'CTGATTCGTCGTGGCTATACCCCGTCGAAC 3'(SEQ ID NO：7)

5'GGGTATAGCCACGACGAATCAGGTGCAGAG 3'(SEQ ID NO：8)

V42K

5'CTGGATAAGTACAAAACCCCGTCGCTG 3'(SEQ ID NO：9)

5'GGGGTTTTGTACTTATCCAGCACCGTAATG 3'(SEQ ID NO：10)

G66D

5'TCTGCGCAATGATCCGGATCTGCAGCTGTC 3'(SEQ ID NO：11)

5'TGCAGATCCGGATCATTGCGCAGACGGATG 3'(SEQ ID NO：12)

Q70R

5'GTCCGGATCTGCGGCTGTCTCTGGAAAGTC 3'(SEQ ID NO：13)

5'TCCAGAGACAGCCGCAGATCCGGACCATTG 3'(SEQ ID NO：14)

Q80R

5'TGGATATGTGGCGGAACGACGAACTGTTTA 3'(SEQ ID NO：15)

5'TTCGTCGTTCCGCCACATATCCAGACTTTC 3'(SEQ ID NO：16)

N81E

5'ATATGTGGCAAGAAGACGAACTGTTTAAAC 3'(SEQ ID NO：17)

5'ACAGTTCGTCTTCTTGCCACATATCCAGAC 3'(SEQ ID NO：18)

F89Y

5'TTTAAACCGTTTTACCACCAAGTGGGCATG 3'(SEQ ID NO：19)

5'CACTTGGTGGTAAAACGGTTTAAACAGTTC 3'(SEQ ID NO：20)

G103E

5'AGAAGAGATCGAAAATCTGCGTCGCAAGTA 3'(SEQ ID NO：21)

5'AGATTTTCGATCTCTTCTTTACTAGAGCTG 3'(SEQ ID NO：22)

V126H

5'AAAAAACGAACCACTGGCTGGAATCCGAAG 3'(SEQ ID NO：23)

5'ATTCCAGCCAGTGGTTCGTTTTTTCCAGAC 3'(SEQ ID NO：24)

L135R

5'AAGACGAAATCCGGGCCAAAGCACCGAATT 3'(SEQ ID NO：25)

5'TGCTTTGGCCCGGATTTCGTCTTCGGATTC 3'(SEQ ID NO：26)

A136R

5'CGAAATCCTGCGGAAAGCACCGAATTTTAC 3'(SEQ ID NO：27)

5'ATTCGGTGCTTTCCGCAGGATTTCGTCTTC 3'(SEQ ID NO：28)

A138Y

5'TCCTGGCCAAATACCCGAATTTTACCCGTG 3'(SEQ ID NO：29)

5'AAAATTCGGGTATTTGGCCAGGATTTCGTC 3'(SEQ ID NO：30)

A161D

5'CTGGATGCGGCAAAAGCCATTAATGCAATT 3'(SEQ ID NO：31)

5'TGCCGCATCCAGCCAACCGCCATCCGTACA 3'(SEQ ID NO：32)

I171R

5'ATGCAATTGGCAGGTTTCTGCAAGACAAAG 3'(SEQ ID NO：33)

5'TCTTGCAGAAACCTGCCAATTGCATTAATG 3'(SEQ ID NO：34)

F172E

5'ATTGGCATCGAGCTGCAAGACAAAGGCGTG 3'(SEQ ID NO：35)

5'TTGTCTTGCAGCTCGATGCCAATTGCATTA 3'(SEQ ID NO：36)

G184D

5'TTTTGGCGATGCGGGTACCTTTCAGCAAC 3'(SEQ ID NO：37)

5'GTACCCGCATCGCCAAAACCGAACTTCAC 3'(SEQ ID NO：38)

G184K

5'TTTTGGCAAAGCGGGTACCTTTCAGCAA 3'(SEQ ID NO：39)

5'GTACCCGCTTTGCCAAAACCGAACTTCA 3'(SEQ ID NO：40)

G186T

5'GGCGGTGCGACTACCTTTCAGCAACCGCTG 3'(SEQ ID NO：41)

5'TGAAAGGTAGTCGCACCGCCAAAACCGAAC 3'(SEQ ID NO：42)

T2199R

5'GGATGGCAAACGCTGCATCGGTCTGGAAAC 3'(SEQ ID NO：43)

5'CCGATGCAGCGTTTGCCATCCGCAGCGAAC 3'(SEQ ID NO：44)

D229K

5'CCTGGTGAAGCTGGAAGACCAGTGTGTTAG 3'(SEQ ID NO：45)

5'CTTCCAGCTTCACCAGGGTCGGAGACCATG 3'(SEQ ID NO：46)

A238R

5'AAACGATGGGTCTTCGCGCATATTCAACTG 3'(SEQ ID NO：47)

5'CGCGAAGACCCATCGTTTACTAACACACTG 3'(SEQ ID NO：48)

N272D

5'TTGAACCGGATGAATACGGCGTCATTAAAG 3'(SEQ ID NO：49)

5'ACGCCGTATTCATCCGGTTCAAAGAAAAAG 3'(SEQ ID NO：50)

N356H

5'CTGACGCGCACCTGCTGATTTGTGAACATC 3'(SEQ ID NO：51)

5'ACAAATCAGCAGGTGCGCGTCAGCCGTATC 3'(SEQ ID NO：52)

H388Y

5'TCGGCAAGTACGTTGTCGAACTGCTGGAAG 3'(SEQ ID NO：53)

5'TTCGACAACGTACTTGCCGATATTCGGCAG 3'(SEQ ID NO：54)

扩增体系为：PrimeSTAR Buffer(5×)10μL、dNTP(2.5mM)4μL、重组质粒模板20ng、引物(10μM)各2μL、PrimeSTAR HS高保真酶0.5μL、补充双蒸水至50μL。扩增条件为98℃预变性1min；98℃变性10sec、68℃退火及延伸7min(30个循环)。胶回收PCR产物，用DpnI酶(Fermentas公司)在37℃条件下消化胶回收产物2h，降解初始模板。消化产物转化至E.coliBL21(DE3)-CodonPlus-RIL，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证。得到果糖基肽氧化酶突变体的重组菌。

2，饱和突变库的构建与筛选

本实验中采用简易全质粒PCR突变法(

site-directed mutagenesismethod)引入定点饱和突变。引物序列如下：

S30 5'CTGATTCGTNNKGGCTATACCCCGTCGAAC 3'(SEQ ID NO：55)

5'GGGTATAGCCMNNACGAATCAGGTGCAGAG 3'(SEQ ID NO：56)

G60 5'AAATTATGNNKATCCGTCTGCGCAATGGT 3'(SEQ ID NO：57)

5'CAGACGGATMNNCATAATTTTGTTCAGGTC 3'(SEQ ID NO：58)

W79 5'CTGGATATGNNKCAAAACGACGAACTGTT 3'(SEQ ID NO：59)

5'CGTCGTTTTGMNNCATATCCAGACTTTCCA 3'(SEQ ID NO：60)

I95 5'GTGGGCATGNNKGATTGCAGCTCTAGTAAAG 3'(SEQ ID NO：61)

5'GCTGCAATCMNNCATGCCCACTTGGTGGAA 3'(SEQ ID NO：62)

S130 5'GCTGGAANNKGAAGACGAAATCCTGGCCAA 3'(SEQ ID NO：63)

5'CAGGATTTCGTCTTCMNNTTCCAGCCAGAC 3'(SEQ ID NO：64)

A138 5'TCCTGGCCAAANNKCCGAATTTTACCCGTG 3'(SEQ ID NO：65)

5'AAAATTCGGMNNTTTGGCCAGGATTTCGTC 3'(SEQ ID NO：66)

N272 5'TTGAACCGNNKGAATACGGCGTCATTAAAG 3'(SEQ ID NO：67)

5'ACGCCGTATTCMNNCGGTTCAAAGAAAAAG 3'(SEQ ID NO：68)

该PCR反应使用Takara的PrimeSTAR HS聚合酶，PCR反应条件为：98℃2min，然后98℃10sec，55℃15sec，72℃7min，共25个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到7kb大小的条带，与预期结果相符。DpnI消化模板后，使用Axygen PCR clean up试剂盒回收纯化PCR产物，转化至BL21(DE3)codon plus-RIL感受态细胞，得到饱和突变文库，且库容量大于300个克隆。

用微生物菌落筛选***Qpix2挑取单菌落于96孔板中，在每孔中加入200μl含100mg/L Kan的LB培养基，放入摇床37℃400rpm过夜培养，次日在每孔中加入甘油使终浓度为15％，-80℃冻存作为饱和突变文库母版。吸取20μl母版中的母菌液加入含有130μl，100mg/L Kan的LB培养基中，放入摇床37℃，400rpm培养至菌液0D₆₀₀为0.6-0.8(约4小时)，再加入混有IPTG的LB培养基至200μl，使IPTG终浓度为1μM。在28℃,400rpm诱导6-8h后，将装有菌液的96孔板用高速冷冻离心机4500rpm，离心1h，取出并弃尽上清液，菌体放入-80℃冰箱过夜冻存。次日将96孔板从-80℃冰箱中取出在室温下自然融化1h后再次放入冰箱2h,如此反复冻融3次，使细胞充分破碎，再加入200μl 50mM Tris-Hcl(pH 8.0)，放置于震板仪上充分摇匀，用高速冷冻离心机4500rpm离心1 5min后，所得上清液即为粗酶液。将上清液分别加入两块96孔板，孔中含有100μL粗酶液，将其中一块置于室温下，另一块放置于45℃水浴锅中加热20min，分别用排枪吸取两块板各孔25μL的酶液加入100μL的底物中，检测单位时间内吸光值的变化，筛选热稳定性提高的突变体。测序结果表明，热稳定性提高突变体分别为：A138V，A138I，G60S，G60N，G60A，I95L和N272D。

3，突变体的性质表征

按照实施例2的方法得到果糖基肽氧化酶定点突变突变体的纯酶液，并表征这31个单点突变体。结果表明，这31个单点突变体中，10个突变体的热稳定性得到明显改善，4个突变体(I171R、G60A、G60N和G60S)的催化活性有所提高，其余16个突变体的热稳定性未得到提升。表1总结了热稳定性得到提高的突变体的酶学性质。

我们将稳定性提高的突变体进行累加组合：使用与单点突变体相似的构建方法，成功构建8个组合突变体：S30R/G66D、G66D/I95L、A161D/A138I、A161D/N272D、S30R/H388Y、A161D/H388Y、G184D/H388Y、N272D/H388Y、G66D/A161D/H388Y、A161D/N272D/H388Y、G66D/A161D/N272D/H388Y、G66D/A138I/A161D/N272D/H388Y，并逐一表达、纯化、表征。这些组合突变体的表达量及可溶蛋白量较野生型FPOX-E有显著提高。所有组合突变体与单点突变体相比均表现出热稳定化的叠加效果。表二详细总结了FPOX-E野生型酶、热稳定突变体酶学性质，稳定性最高突变体的42℃半衰期大约是野生型的570倍(表1)。

表1.FPOX-E野生型及单点突变体的酶学性质表征

此外，对第30、60、66、95、138、161、171、184、272、388位执行删除突变，或者对第30、60、66、95、138、161、171、184、272、388位点***1个或多个氨基酸残基，均可以获得热稳定性提高的突变酶。

实施例5 FPOX-E突变体酶法检测糖化血红蛋白含量

1.试剂准备

试剂Ⅰ：辣根过氧化物酶溶于200mM磷酸钾缓冲溶液(pH 7.5)中，终浓度1.8U/mL。

试剂Ⅱ：50mM 2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠(TOOS)溶液。

试剂Ⅲ：45mM 4-氨基吡啶(4-AP)溶液。

试剂Ⅳ：果糖基肽氧化酶酶液(取适量酶液或酶冻干粉溶于适量100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中，配制酶液浓度为1U/mL，冰上放置待用)。

样品：从患者处采取全血，红细胞自然沉降10分钟回收。取20μL沉降的红细胞与400μl溶血缓冲液(日本积水医疗株式会社)混合，分装待用。

2.操作步骤

在蛋白酶的作用下，切断源于血红蛋白A1c的β链N末端的糖化缬氨酸组氨酸二肽，同时通过测定600nm与800nm的吸光度差，求出血红蛋白(Hb)的浓度。

依次加入表2试剂溶液混合于比色皿中(光程1cm)，37℃预热5min。

表2检测糖化血红蛋白的相关试剂

向37℃预热反应混合液中加入试剂Ⅳ0.02mL，混匀。使用紫外分光光度计测定在37℃下，555nm处，3分钟后检测吸光度值A_测定。向反应液中加入0.02mL磷酸钾缓冲液，相同条件下测定吸光度值A_空白。根据ΔA＝(A_测定-A_空白)即可求出糖化血红蛋白(HbAlc)浓度。

根据求得的HbA1c浓度与Hb浓度计算出HbA1c(％)。

该方法可特异地测定HbA1c衍生而来的糖化二肽，无需复杂的试剂配制，对反应杯无污染，适用于多种自动分析仪，且不稳定型HbA1c及修饰Hb(羰基化及乙酰化等)对测定值无影响。与HPLC方法相比具有良好的线性关系(图2)，回归方程为y＝1.025x-0.5857，R²＝0.9904：检测灵敏度为3-16％。

3.FPXO-E突变体与野生型的比较

将实施例4的FPOX-E突变体换成FPOX-E野生型，使用HbAlc浓度为8％的标准品测定，其他条件一致。结果表明，野生型与突变体在短时间内均能准确测定HbAlc浓度，但是野生型在25℃放置四天后，检测结果明显失真；而实施例4所述突变体(G67D/A162D/H389Y)在25℃下放置三个月活力仍能准确测出HbAlc浓度。

表3 FPOX-E野生型与突变酶的热稳定性效果比较

如表1所述的其他突变酶也有和表3相似的实验效果，即均可以相对野生型FPOX-E具有更加稳定的性能，在常温(25℃)下放置多天，均可以检测出HbAlc的浓度。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一组新型果糖基肽氧化酶及其应用

<130> <待立案后加入>

<160> 68

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

atggcccatt cacgcgcaag caccaaagtt gtcgtcgtcg gcggcggcgg caccatcggt 60

agttccacgg ctctgcacct gattcgttcg ggctataccc cgtcgaacat tacggtgctg 120

gatgtttaca aaaccccgtc gctgcagagc gcaggtcatg acctgaacaa aattatgggc 180

atccgtctgc gcaatggtcc ggatctgcag ctgtctctgg aaagtctgga tatgtggcaa 240

aacgacgaac tgtttaaacc gtttttccac caagtgggca tgattgattg cagctctagt 300

aaagaaggta tcgaaaatct gcgtcgcaag tatcaaaccc tgctggatgc gggcattggt 360

ctggaaaaaa cgaacgtctg gctggaatcc gaagacgaaa tcctggccaa agcaccgaat 420

tttacccgtg aacaggttaa aggctggaag ggtctgttct gtacggatgg cggttggctg 480

gcggcggcaa aagccattaa tgcaattggc atctttctgc aagacaaagg cgtgaagttc 540

ggttttggcg gtgcgggtac ctttcagcaa ccgctgttcg ctgcggatgg caaaacctgc 600

atcggtctgg aaaccacgga tggcacgaaa tactttgccg acaaggtggt tctggccgca 660

ggtgcatggt ctccgaccct ggtggatctg gaagaccagt gtgttagtaa agcgtgggtc 720

ttcgcgcata ttcaactgac gccgaaagaa gctgatgcgt ataagaacgt tccggtcgtg 780

tatgacggcg aatacggctt tttctttgaa ccgaatgaat acggcgtcat taaagtgtgc 840

gatgaatttc cgggtttttc ccgtttcaag ctgcaccagc cgtatggcgc tgcgtcaccg 900

aaaatgatct cggtgccgcg cagccatgca aagcacccga ccgatacgta cccggacgcg 960

agcgaagtta ccattcgtaa agccatcgca cgctttctgc cggaatttaa ggataaggaa 1020

ctgttcaacc gtacgatgtg ctggtgtacc gatacggctg acgcgaacct gctgatttgt 1080

gaacatccga aatggaagaa ttttatcctg gccaccggcg attccggtca ttcattcaaa 1140

ctgctgccga atatcggcaa gcacgttgtc gaactgctgg aaggctccct gtcacaggaa 1200

atggcaggtg catggcgttg gcgtccgggc ggtgatgcac tgcgcagccg tcgcggcgct 1260

ccggcaaaag atctggctga aatgccgggt tggaagcatg acgcccacct gtaa 1314

<210> 2

<211> 437

<212> PRT

<213> Eupenicillium terrenum

<400> 2

Met Ala His Ser Arg Ala Ser Thr Lys Val Val Val Val Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Ile Arg Ser Gly Tyr

20 25 30

Thr Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Val Tyr Lys Thr Pro Ser Leu

35 40 45

Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg

50 55 60

Asn Gly Pro Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ser Leu Asp Met Trp Gln

65 70 75 80

Asn Asp Glu Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Gln Val Gly Met Ile Asp

85 90 95

Cys Ser Ser Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asn Leu Arg Arg Lys Tyr Gln

100 105 110

Thr Leu Leu Asp Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Val Trp Leu

115 120 125

Glu Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro Asn Phe Thr Arg Glu

130 135 140

Gln Val Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Thr Asp Gly Gly Trp Leu

145 150 155 160

Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Ile Phe Leu Gln Asp Lys

165 170 175

Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Thr Phe Gln Gln Pro Leu

180 185 190

Phe Ala Ala Asp Gly Lys Thr Cys Ile Gly Leu Glu Thr Thr Asp Gly

195 200 205

Thr Lys Tyr Phe Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser

210 215 220

Pro Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val

225 230 235 240

Phe Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Lys Glu Ala Asp Ala Tyr Lys Asn

245 250 255

Val Pro Val Val Tyr Asp Gly Glu Tyr Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn

260 265 270

Glu Tyr Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg

275 280 285

Phe Lys Leu His Gln Pro Tyr Gly Ala Ala Ser Pro Lys Met Ile Ser

290 295 300

Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala

305 310 315 320

Ser Glu Val Thr Ile Arg Lys Ala Ile Ala Arg Phe Leu Pro Glu Phe

325 330 335

Lys Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Thr Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr

340 345 350

Ala Asp Ala Asn Leu Leu Ile Cys Glu His Pro Lys Trp Lys Asn Phe

355 360 365

Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn

370 375 380

Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Leu Glu Gly Ser Leu Ser Gln Glu

385 390 395 400

Met Ala Gly Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Arg Ser

405 410 415

Arg Arg Gly Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Glu Met Pro Gly Trp Lys

420 425 430

His Asp Ala His Leu

435

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 3

atcgcacata tggcccattc acgcgcaagc a 31

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 4

atcggactcg agttacaggt gggcgtcatg ctt 33

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 5

tagttccacg gcttaccacc tgattcgttc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 6

gaatcaggtg gtaagccgtg gaactaccga 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 7

ctgattcgtc gtggctatac cccgtcgaac 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 8

gggtatagcc acgacgaatc aggtgcagag 30

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 9

ctggataagt acaaaacccc gtcgctg 27

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 10

ggggttttgt acttatccag caccgtaatg 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 11

tctgcgcaat gatccggatc tgcagctgtc 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 12

tgcagatccg gatcattgcg cagacggatg 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 13

gtccggatct gcggctgtct ctggaaagtc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 14

tccagagaca gccgcagatc cggaccattg 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 15

tggatatgtg gcggaacgac gaactgttta 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 16

ttcgtcgttc cgccacatat ccagactttc 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 17

atatgtggca agaagacgaa ctgtttaaac 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 18

acagttcgtc ttcttgccac atatccagac 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 19

tttaaaccgt tttaccacca agtgggcatg 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 20

cacttggtgg taaaacggtt taaacagttc 30

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 21

agaagagatc gaaaatctgc gtcgcaagta 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 22

agattttcga tctcttcttt actagagctg 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 23

aaaaaacgaa ccactggctg gaatccgaag 30

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 24

attccagcca gtggttcgtt ttttccagac 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 25

aagacgaaat ccgggccaaa gcaccgaatt 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 26

tgctttggcc cggatttcgt cttcggattc 30

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 27

cgaaatcctg cggaaagcac cgaattttac 30

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 28

attcggtgct ttccgcagga tttcgtcttc 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 29

tcctggccaa atacccgaat tttacccgtg 30

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 30

aaaattcggg tatttggcca ggatttcgtc 30

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 31

ctggatgcgg caaaagccat taatgcaatt 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 32

tgccgcatcc agccaaccgc catccgtaca 30

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 33

atgcaattgg caggtttctg caagacaaag 30

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 34

tcttgcagaa acctgccaat tgcattaatg 30

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 35

attggcatcg agctgcaaga caaaggcgtg 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 36

ttgtcttgca gctcgatgcc aattgcatta 30

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 37

ttttggcgat gcgggtacct ttcagcaac 29

<210> 38

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 38

gtacccgcat cgccaaaacc gaacttcac 29

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 39

ttttggcaaa gcgggtacct ttcagcaa 28

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 40

gtacccgctt tgccaaaacc gaacttca 28

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 41

ggcggtgcga ctacctttca gcaaccgctg 30

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 42

tgaaaggtag tcgcaccgcc aaaaccgaac 30

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 43

ggatggcaaa cgctgcatcg gtctggaaac 30

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 44

ccgatgcagc gtttgccatc cgcagcgaac 30

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 45

cctggtgaag ctggaagacc agtgtgttag 30

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 46

cttccagctt caccagggtc ggagaccatg 30

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 47

aaacgatggg tcttcgcgca tattcaactg 30

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 48

cgcgaagacc catcgtttac taacacactg 30

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 49

ttgaaccgga tgaatacggc gtcattaaag 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 50

acgccgtatt catccggttc aaagaaaaag 30

<210> 51

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 51

ctgacgcgca cctgctgatt tgtgaacatc 30

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 52

acaaatcagc aggtgcgcgt cagccgtatc 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 53

tcggcaagta cgttgtcgaa ctgctggaag 30

<210> 54

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 54

ttcgacaacg tacttgccga tattcggcag 30

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 55

ctgattcgtn nkggctatac cccgtcgaac 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 56

gggtatagcc mnnacgaatc aggtgcagag 30

<210> 57

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 57

aaattatgnn katccgtctg cgcaatggt 29

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 58

cagacggatm nncataattt tgttcaggtc 30

<210> 59

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 59

ctggatatgn nkcaaaacga cgaactgtt 29

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 60

cgtcgttttg mnncatatcc agactttcca 30

<210> 61

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 61

gtgggcatgn nkgattgcag ctctagtaaa g 31

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 62

gctgcaatcm nncatgccca cttggtggaa 30

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 63

gctggaannk gaagacgaaa tcctggccaa 30

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 64

caggatttcg tcttcmnntt ccagccagac 30

<210> 65

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 65

tcctggccaa annkccgaat tttacccgtg 30

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 66

aaaattcggm nntttggcca ggatttcgtc 30

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 67

ttgaaccgnn kgaatacggc gtcattaaag 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 68

acgccgtatt cmnncggttc aaagaaaaag 30

Claims

1.一种热稳定性提高的果糖基肽氧化酶，其特征在于，所述果糖基肽氧化酶与SEQ IDNO:2相比存在突变，所述的突变选自以下任一项：

第30位丝氨酸被精氨酸取代；或

第60位甘氨酸被丝氨酸取代；或

第66位甘氨酸被天冬氨酸取代；或

第95位异亮氨酸被亮氨酸取代；或

第138位丙氨酸被缬氨酸或异亮氨酸取代；或

第161位丙氨酸被天冬氨酸取代；或

第184位甘氨酸被天冬氨酸取代；或

第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代；或

第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

第30位丝氨酸被精氨酸取代和第66位甘氨酸被天冬氨酸取代；或

第66位甘氨酸被天冬氨酸取代和第95位异亮氨酸被亮氨酸取代；或

第161位丙氨酸被天冬氨酸取代和第138位丙氨酸被异亮氨酸取代；或

第161位丙氨酸被天冬氨酸取代和第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代；或

第30位丝氨酸被精氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

第161位丙氨酸被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

第184位甘氨酸被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

第66位甘氨酸被天冬氨酸取代、第161位丙氨酸被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

第161位丙氨酸被天冬氨酸取代、第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

第66位甘氨酸被天冬氨酸取代、第161位丙氨酸被天冬氨酸取代、第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代；或

第66位甘氨酸被天冬氨酸取代、第138位丙氨酸被异亮氨酸取代、第161位丙氨酸被天冬氨酸取代、第272位天冬酰胺被天冬氨酸取代和第388位组氨酸被酪氨酸取代。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的果糖基肽氧化酶。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞包括权利要求3所述的表达载体或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种提高果糖基肽氧化酶热稳定性的方法，其特征在于，使用了如权利要求1所述的果糖基肽氧化酶。

6.如权利要求1所述的果糖基肽氧化酶在美德拉化合物氧化脱糖反应中应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的美德拉化合物为糖化血红蛋白及其蛋白酶解衍生物。

8.一种测量糖化血红蛋白的试剂盒或传感器，其中包含了如权利要求1所述的果糖基肽氧化酶。