JP4143274B2

JP4143274B2 - アルカリプロテアーゼ

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Publication number: JP4143274B2
Application number: JP2001114048A
Authority: JP
Inventors: 晃範小川; 勇二秦田; 裕行荒木; 剛佐藤; 勝久佐伯; 泰影山; 修次川合
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2001-04-12
Filing date: 2001-04-12
Publication date: 2008-09-03
Anticipated expiration: 2021-04-12
Also published as: JP2002306176A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗剤配合用酵素として優れた洗浄性能を有するアルカリプロテアーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プロテアーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化助剤あるいは消炎剤といった医薬品等の多分野で利用されてきた。その中でも最も大量に工業生産され市場規模が大きいのは洗剤用プロテアーゼであり、多くのプロテアーゼが市販されている。
【０００３】
ところが、衣料等の汚れは蛋白質だけでなく、脂質、固体粒子など複数の成分が含まれていることが殆どであり、斯かる実際の複合汚れに対して洗浄力の高い洗浄剤が望まれている。このような観点から、本発明者は、高濃度の脂肪酸存在下でもカゼイン分解活性を保持し、蛋白だけでなく皮脂等の汚れのある複合汚れ条件下でも優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼを見出し、先に特許出願した（ＷＯ９９／１８２１８）。
【０００４】
しかし、さらに優れた洗浄性能を有し、幅広い組成の洗剤に適用できるアルカリプロテアーゼが求められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、変異酵素を中心として前記アルカリプロテアーゼを探索してきたが、従来行なわれているズブチリシンに代表されるセリンプロテアーゼと前記アルカリプロテアーゼとは、酵素学的性質が全く異なり、ズブチリシン等の変異箇所は全く参考にならなかった。そしてさらに検討したところ、前記アルカリプロテアーゼの特性を保持し、洗浄力を向上させるには、ある種のアルカリプロテーアーゼにおいて、当該アミノ酸配列の特定位置に特定のアミノ酸残基が必要であることを見出した。
【０００６】
すなわち本発明は、配列番号１の（ａ）８４位、（ｂ）１０４位、（ｃ）２５６位若しくは（ｄ）３６９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：アルギニン残基、
（ｂ）位置：プロリン残基、
（ｃ）位置：アラニン、セリン残基、
（ｄ）位置：アスパラギン残基、
から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ、それをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、及び該ベクターを含有する形質転換体を提供するものである。
【０００７】
また本発明は、このアルカリプロテアーゼを含有する洗剤組成物を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のアルカリプロテアーゼは、上記のように、配列番号１の（ａ）８４位、（ｂ）１０４位、（ｃ）２５６位若しくは（ｄ）３６９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基；（ａ）位置：アルギニン残基、（ｂ）位置：プロリン残基、（ｃ）位置：アラニン、セリン残基、（ｄ）位置：アスパラギン残基、から選ばれたものである。すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼにおける前記（ａ）〜（ｄ）から選ばれる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の当該位置に相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は特定のアミノ酸残基であるプロテアーゼを意味し、これらは野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【０００９】
ここで、「他種アルカリプロテアーゼ」としては、野生型又は野生型の変異体であってもよく、酸化剤耐性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００であることが好ましく、配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するものがより好ましい。特に配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するものであって、酸化剤耐性を有し、アルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定であり、５０℃においてもpH１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存性を示し、ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で阻害され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００のものが好ましい。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを５０mM過酸化水素（５mM塩化カルシウムを含有）溶液中で、pH１０（２０mMグリットンロビンソン緩衝液）で、２０℃２０分間の残存活性（合成基質法）が少なくとも５０％以上を保持していることをいう。
【００１０】
ここで、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、ＫＰ４３〔バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭＢＰ−６５３２）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕が挙げられ、「配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＫＰ９８６０〔バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭＢＰ−６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＥ−１〔バチルス No.Ｄ−６（ＦＥＲＭＰ−１５９２）由来、ＪＰ７４０７１０〕、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＹａ〔バチルスエスピーＹ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２９）由来、ＪＰ８６１２１０〕、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＳＤ５２１〔バチルスＳＤ５２１株（ＦＥＲＭＰ−１１１６２）由来、ＪＰ９１０８２１〕、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−１（ＮＣＩＢ１２２８９由来、ＷＯ８８０１２９３）、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−２（ＮＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ８８０１２９３）等が挙げられる。このうち、配列番号２〜７から選ばれるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが好ましく、さらにこれと９０％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼがより好ましく、特に９５％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが好ましい。
なお、アミノ酸配列の相同性は、リップマン−パーソン（Lipman-Pearson）法（Science, 227,1435,1985）によって計算される。
【００１１】
また、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較することにより行うことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、相当する位置のアミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。相当する位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００１２】
すなわち、（ａ）配列番号１の８４位のアミノ酸残基はリジン残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えば配列番号３においてはそれぞれ８３位のリジン残基というように特定することができる。
当該アミノ酸残基は、アルギニンであるのが好ましい。
【００１３】
（ｂ）配列番号１の１０４位のアミノ酸残基はロイシン残基であるが、当該アミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基はプロリン残基であるのが好ましい。
【００１４】
（ｃ）配列番号１の２５６位のアミノ酸残基はメチオニン残基であるが、当該アミノ酸残基は特にアラニンあるいはセリン残基であるのが好ましい。
【００１５】
（ｄ）配列番号１の３６９位のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基であるが、当該アミノ酸残基又はこれに相当するアミノ酸残基は、アスパラギン残基であるのが好ましい。
【００１６】
プロテアーゼＫＰ４３のアミノ酸配列（配列番号１）の（ａ）〜（ｄ）位に相当する位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記「他種アルカリプロテアーゼ」のうちの好適に用いられるもので示す（表１）。
【００１７】
【表１】

【００１８】
また、本発明アルカリプロテアーゼにおけるアミノ酸残基の欠失又は（ａ）〜（ｄ）の選択は、２個所以上が同時になされていていもよい。
【００１９】
本発明のアルカリプロテアーゼが変異体である場合、変異を施す前のアルカリプロテアーゼ（親アルカリプロテアーゼということがある）としては、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼ」又は上述した「他種アルカリプロテアーゼ」として示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すことにより本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。例えばプロテアーゼＫＰ４３の配列番号１で示されるアミノ酸配列の前記（ａ）〜（ｄ）から選ばれる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列、具体的には配列番号２〜７で示されるアミノ酸配列の前記位置に相当する位置のアミノ酸残基を欠失又は他のアミノ酸残基に置換することにより得られる。
【００２０】
本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。すなわち、クローニングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子に対して変異を与え、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養することにより得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばＷＯ９９／１８２１８、ＪＰ９０１１２８、ＷＯ９８／５６９２７記載の方法に従って行えばよい。
【００２１】
親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えば宝酒造社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００２２】
得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテアーゼの生産方法は、例えば当該変異遺伝子を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させる、あるいは当該変異遺伝子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させるなどの方法で本発明の変異プロテアーゼをコードするＤＮＡを安定に増幅し、さらに該遺伝子を安定にかつ効率よく発現させることが可能である宿主に導入させ、変異プロテアーゼを生産させる方法が採用できる。この条件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌などが挙げられる。
【００２３】
かくして得られる本発明のアルカリプロテアーゼは、アルカリ側で活性を有し、高級脂肪酸によってカゼイン分解活性の阻害を受けず、且つ優れた洗浄力を示すものである。従って、本発明の変異プロテアーゼは、各種洗剤組成物配合用酵素として有用である。
本発明の洗剤組成物中への上記プロテアーゼの含有量は変異プロテアーゼが活性を示す量であればよく、洗浄組成物１kg当たり０．１〜５０００Ｐ．Ｕ．が含有できるが、経済性を考慮し１０００Ｐ．Ｕ．以下、好ましくは５００Ｐ．Ｕ．以下である。
【００２４】
本発明の洗剤組成物は、本発明のアルカリプロテアーゼ以外にさまざまな酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、プロテアーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ及び本発明に用いるアルカリプロテアーゼ以外のプロテアーゼ等が好ましい。
【００２５】
プロテアーゼとしては市販のアルカラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ（以上、ノボノルディスク社）、プロペラーゼ、プラフェクト（ジェネンコア社）、ＫＡＰ（花王社）等が挙げられる。セルラーゼとしては、セルザイム、ケアザイム（以上ノボノルディスク社）、ＫＡＣ（花王社）、特開平１０−３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ等が挙げられる。アミラーゼとしては、ターマミル、デュラミル（以上、ノボノルディスク社）、プラスター（ジェネンコア社）、ＫＡＭ（花王社）等が挙げられる。リパーゼとしてはリポラーゼ、リポラーゼウルトラ（以上、ノボノルディスク社）等が挙げられる。これらの酵素は０．００１〜１０％、好ましくは０．０３〜５％配合される。
【００２６】
界面活性剤は、洗剤組成物中０．５〜６０重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉体状洗剤組成物については１０〜４５％、液体洗剤組成物については２０〜５０％配合することが好ましい。また本発明洗剤組成物が漂白洗剤又は自動食器洗浄機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。
【００２７】
二価金属イオン捕捉剤は０．０１〜５０％、好ましくは５〜４０％配合される。
【００２８】
アルカリ剤及び無機塩は０．０１〜８０％、好ましくは１〜４０％配合される。
【００２９】
再汚染防止剤は０．００１〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。
【００３０】
漂白剤（例えば過酸化水素、過炭酸塩等）は１〜１０％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０％配合することができる。
【００３１】
蛍光剤はビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘ）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料）等が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２％配合するのが好ましい。
【００３２】
本発明の洗剤組成物は、上記方法で得られるアルカリプロテアーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は、用途に応じて選択することができ、例えば、液体、粉体、顆粒等にすることができる。
なお、本発明のアルカリプロテアーゼを粉末洗剤組成物に用いる場合は、洗剤製造時、あるいは使用時に作業者や消費者が酵素との接触をできるだけ避ける目的や、熱による失活あるいは分解を防ぐため特開昭６２−２５７９９０号公報に記載の方法に基づき製造した顆粒を洗剤粒子製造後に混合することが好ましい。
【００３３】
かくして得られる本発明洗剤組成物は、衣料用洗剤、漂白洗剤、自動食器洗浄機用洗剤、配水管洗浄剤、義歯洗浄剤等として使用できるが、特に衣料用洗剤、漂白洗剤、自動食器洗浄機用洗剤として好適に使用することができる。
【００３４】
【実施例】
（洗浄力の測定法）
変異酵素の洗浄力評価は、ターゴトメーター（上島製作所製）を用いて行った。市販の衣料用洗剤を所定の使用濃度になるように調製した溶液に、変異酵素を最終濃度で１０mPU/L、２０mPU/Lになるように添加した。次いで、変異酵素の洗浄力評価に供する汚染布ＥＭＰＡ１１７（ＥＭＰＡ社製、血液／ミルク／カーボン）を６×６ｃｍ画に裁断したものを添加し、特に断らない限り２０℃で洗浄（１００ｒｐｍ）を行った。水道水によるすすぎを行った後、色彩色差計（ＭＩＮＯＬＴＡ、ＣＭ３５００ｄ）を用いて明度を測定し、洗浄前後における明度の変化から洗浄率を算出した。
【００３５】
（カゼイン分解活性の測定法）
１％（ｗ／ｖ）カゼイン（ハマーステイン：メルク社製）を含む５０mmol／Ｌホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（pH１０．５）１mLを３０℃で５分間保温した後、０．１mLの酵素溶液を添加し、３０℃で１５分間反応を行った。ＴＣＡ溶液（０．１１mol／Ｌトリクロロ酢酸：０．２２mol／Ｌ酢酸ナトリウム：０．３３mol／Ｌ酢酸）２mLを添加して反応を停止し、室温で１０分間放置した後、酸変性蛋白を濾過（No．２濾紙：ワットマン社製）した。そして濾液０．５mLにアルカリ性銅試薬（１％（ｗ／ｖ）酒石酸カリウム・ナトリウム：１％（ｗ／ｖ）硫酸銅：２％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウム、０．１mol／Ｌ水酸化ナトリウム＝１：１：１００（ｖ／ｖ））２．５mLを添加し、３０℃、１０分間保温した後、希釈フェノール試薬（フェノール試薬（関東化学社製）をイオン交換水で２倍に希釈したもの）０．２５mLを加え、３０℃、３０分間保温した後、６６０nmにおける吸光度を測定した。上記の酵素反応系に反応停止液を混合した後、酵素溶液を加えた系をブランクとした。
なお、酵素１単位（Ｐ．Ｕ．）は、上記の反応条件において１分間に１mmolのチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を遊離する酵素量とした。
【００３６】
実施例１
プロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約２．０kbの範囲に対しランダムに変異を与えることとした。先ず、本２．０kbを増幅できるプライマーを用いＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液は鋳型ＤＮＡを５ng、リン酸化プライマーを２０pmoL、各ｄＮＴＰを２０nmoL、１μmoLのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５μmoLのＫＣｌ、０．１５μmolのＭｇＣｌ₂、そして２．５ＵＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有し、最終液量を１００μLとした。ＰＣＲ温度条件は、９４℃において５分間放置し鋳型を変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１．５分間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。ＰＣＲ product purificaton Kit（ベーリンガー社）によってＰＣＲ産物を精製し１００μＬの滅菌水で溶出させた。引き続き、１μLの溶出液を使用して２回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は鋳型ＤＮＡ以外は全て１回目のＰＣＲ条件と同じである。２回目のＰＣＲ後に１回目と同様にＰＣＲ産物を精製し１００μLの滅菌水で溶出させた。
【００３７】
増幅ＤＮＡ断片のベクターへの組み込みはTaKaRa社製のＬＡＴａｑを用いたポリメラーゼ反応による方法によって行った。詳細に説明すると、２回目の精製溶出液３５μLにＬＡＴａｑ用のバッファー（１０倍濃縮液）を５μL、ｄＮＴＰ溶液を８μL、ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼを０．５μL、さらに鋳型としてプラスミドｐＨＡ６４ＴＳ（発現ベクターｐＨＡ６４にプロテアーゼ構造遺伝子を連結）を２０ng添加後、最終液量を５０μLにし、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃４分間を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。その後エタノール沈澱によってＰＣＲ産物を回収した。このＰＣＲ産物はプライマー位置の５′側にニックを有するプラスミドの形状を成しており、このニック部分を連結させるために、さらにＴ４リガーゼ（TaKaRa社）によるリガーゼ反応処理を行った。
【００３８】
次に、同リガーゼ反応液１０μLを用いてBacillus subtilis ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行ったところ約４×１０⁵個の形質転換体が取得された。そこでＩＳＷ１２１４株の形質転換体をスキムミルク含有培地（スキムミルク１％、バクトトリプトン１％、塩化ナトリウム１％、酵母エキス０．５％、寒天１．５％、テトラサイクリン７．５μg／mL）上に生育させ、プロテアーゼ分泌量を反映していると考えられるハローの形成状態を観察した。
【００３９】
実施例２
実施例１で得られた変異プロテアーゼの洗浄力の測定結果を図１に示す。本発明の変異アルカリプロテアーゼはいずれも変異を導入する前の野生型酵素に比べて優れた洗浄力を有していた。
【００４０】
実施例３
（１）粒状洗剤の調製
ＷＯ９９／２９８３０号公報の実施例３に記載の洗剤を用いて洗浄力評価を行った。即ち攪拌翼を有した１ｍ³の混合槽に水４６５kgを加え、水温が５５℃に達した後に、５０％（ｗ／ｖ）ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液４８kg、４０％（ｗ／ｖ）ポリアクリル酸ナトリウム水溶液１３５kgを添加した。１５分間攪拌した後、炭酸ナトリウム１２０kg、硫酸ナトリウム６０kg、亜硫酸ナトリウム９kg、蛍光染料３kgを添加した。更に１５分間攪拌した後、ゼオライト３００kgを添加し、３０分間攪拌して均質なスラリーを得た（スラリー中の水分は５０重量％）。このスラリーを噴霧乾燥塔の塔頂付近に設置した圧力噴射ノズルから噴霧することでベース顆粒を得た（噴霧乾燥塔に供給する高温ガスは塔下部より温度が２２５℃で供給し、塔頂より１０５℃で排出）。
次に非イオン界面活性剤１５重量部と５０重量％のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液１５重量部とポリエチレングリコール１重量部を７０℃になるように加熱混合し、混合液を作製した。レディゲミキサー（松坂技研（株）製、容量２０Ｌ、ジャケット付）に上記ベース顆粒１００重量部を投入し、主軸（１５０rpm）とチョッパー（４０００rpm）の攪拌を開始した。なお、ジャケットに７５℃の温水を１０Ｌ／分で流し、そこに上記混合液を３分間で投入し、その後５分間攪拌を行った。更にこの洗剤粒子群の粒子表面に結晶性アルミノ珪酸塩１０重量部で表面被覆を行い、最終粒状洗剤を得た。
［使用した原料］
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液：ネオペレックスＦ６５（花王（株）製）
非イオン界面活性剤：エチレンオキサイド平均付加モル数が８．５のエマルゲン１０８ＫＭ（花王（株）製）
ポリアクリル酸ナトリウム水溶液：平均分子量１００００（特公平２−２４２８３号公報の実施例に記載の方法に従って製造した）
炭酸ナトリウム：デンス灰（セントラル硝子（株）製）
ゼオライト：平均粒径が３．５μｍのゼオライト４Ａ型（東ソー（株）製）
ポリエチレングリコール：Ｋ−ＰＥＧ６０００（平均分子量８５００（花王（株）製）
蛍光染料：チノパールＣＢＳ−Ｘ（チバガイギー社製）
【００４１】
（２）プロテアーゼ造粒物の調製
本発明のアルカリプロテアーゼ及び親アルカリプロテアーゼの精製標品から特開昭６２−２５７９９０号公報に記載の方法に基づきプロテアーゼ造粒物を調製した（６Ｐ．Ｕ．／ｇ）。
【００４２】
（３）洗浄力の測定
２０℃に温度調節した１Ｌのカルシウム水溶液（７１．２mg炭酸カルシウム／１Ｌ）に表２に示す洗剤組成物を０．６７ｇ溶解した。試験布（ＥＭＰＡ１１７（ＥＭＰＡ社製、血液／ミルク／カーボン））を６×６cmに裁断後、Ｔｅｒｇ−Ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒ（上島製作所製）を使用し、２０℃、１００rpmで１０分間洗浄を行った。濯ぎ、乾燥後、色彩色差計（ＭＩＮＯＬＴＡ、ＣＭ３５００ｄ）を用いて明度を測定し、下式より洗浄率を算出した。結果を表２に併せて示す。
【００４３】
【数１】

【００４４】
【表２】

【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、高濃度の脂肪酸存在下でも活性を有し、かつ洗浄力が高く、洗剤配合用酵素として有用なアルカリプロテアーゼを提供できる。
【００４６】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】各変異アルカリプロテアーゼの洗浄力を示す図である。

Claims

配列番号１の（ａ）８４位、（ｂ）１０４位、（ｃ）２５６位若しくは（ｄ）３６９位のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：アルギニン残基、
（ｂ）位置：プロリン残基、
（ｃ）位置：アラニン、セリン残基、
（ｄ）位置：アスパラギン残基、
から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ。
配列番号１に示すアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号１の（ａ）８４位、（ｂ）１０４位、（ｃ）２５６位若しくは（ｄ）３６９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：アルギニン残基、
（ｂ）位置：プロリン残基、
（ｃ）位置：アラニン、セリン残基、
（ｄ）位置：アスパラギン残基、
から選ばれたものであるアルカリプロテアーゼ。
配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが、配列番号２，６及び７から選ばれるアミノ酸配列からなる請求項２記載のアルカリプロテアーゼ。
請求項１〜３記載のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
請求項４記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
請求項５記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
宿主が微生物である請求項６記載の形質転換体。
請求項１〜３のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼを含有する洗剤組成物。