CN104198669A - 利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及测定气管炎疫苗免疫活性的技术领域，尤其是一种利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法，包括如下工艺步骤：试验准备→免疫→脾细胞悬液制备→SRBC悬液配制→补体制备→抗体形成细胞检测→统计学分析→不同浓度气管炎疫苗免疫。本发明工艺将溶血空斑形成试验和分光光度法测定抗体形成细胞两种方法进行优化和创新，建立了微量溶血分光光度法测定抗体形成细胞。反应在96孔细胞培养板内进行，用酶标仪一次大量检测样品；本发明工艺经过经过多次重复均能得出相应结果，固采用该方法科学、准确，重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及测定气管炎疫苗免疫活性的技术领域，尤其是一种利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法。
背景技术
免疫活性是研究药物的生化、生理效应及机制以及剂量与效应之间的关系，其目的是确定药物预期用于临床防、诊、治目的的疗效，确定药物的作用强度，阐明药物的作用部位和机制，发现预期用于临床以外的广泛药理作用。
溶血空斑形成试验(PFC)和分光光度法测定抗体形成细胞(QHS)，前者是抗体形成细胞释放溶血素，借助于补体使绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的空斑，计算形成空斑数目；后者是通过分光光度法测定抗体形成细胞介导溶血反应中绵羊红细胞溶解后释放血红蛋白的量。通过抗体形成细胞形成空斑数目和释放血红蛋白量的多少，可以反映抗体形成细胞产生抗体的功能。
由于目前气管炎疫苗成品标准中没有活性检测方法，国内主治功能为预防呼吸道的反复感染及慢性支气管炎的生物制品中有细菌溶解产物(泛福舒)，此制品的活性检测为“溶血空斑法”，由于此方法通过肉眼观察、人工计数，主观因素影响较大，客观性和重复性相对较差。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：基于上述问题，本发明提供一种科学、准确，重复性好利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法，包括如下工艺步骤：
(1)试验准备：
a.供试品：制备气管炎疫苗：将甲型溶血性链球菌、白色葡萄球菌、奈瑟氏双球菌经培养基培养采集后用甲醛杀菌，经离心洗涤后按照三种菌等量浓度混合，经PBS稀释而成；
b试验对象：50只雄性BABL/C小鼠，5～6的周龄，体重为18～22g，以及5只体重为250-300g的豚鼠，其中，小鼠共分5组，每组10只小鼠，具体为：
第一组：绝对空白对照组；
第二组：羊红细胞对照组；
第三组：气管炎疫苗第一试验组；
第四组：气管炎疫苗第二试验组；
第五组：气管炎疫苗第三试验组；
c.试验溶液：无菌脱纤维绵羊血，D-PBS，pH7.2-7.4；
d.试验仪器：显微镜，酶标仪，高速冷冻离心机；
(2)免疫：将第二组到第五组的小鼠分别用生理盐水和气管炎疫苗在第一天、第七天、第十四天颈背部皮下进行0.5ml/只的免疫，且这些小鼠在第22天腹腔内注射20％浓度绵羊红细胞悬液0.2ml/只，4天后将小鼠断颈脊髓处死，取脾脏；
(3)脾细胞悬液制备：将步骤(2)中收集到的脾脏经研磨、过滤，使其成为单个脾细胞，用D-PBS溶液洗涤并配制成2.9×107/ml的细胞悬液；
(4)SRBC悬液配制：取绵羊血，经无菌生理氯化钠溶液1500rpm离心10min洗涤3次，分别配制成20％和1％的积压绵红细胞悬液；
(5)补体制备：取3～5只未免疫豚鼠，采血分离血清后混合，取压积SRBC，按SRBC与豚鼠血清1∶3的比例加入压积SRBC，混匀，置4℃冰箱30min，2000r/min离心10min去除SRBC，以吸收豚鼠血清中存在的抗SRBC抗体；
(6)抗体形成细胞检测：取96孔板，依据分组要求，按生理盐水200ul，1％绵羊红细胞100ul，补体100ul，脾细胞100ul加入1ml离心管中，37℃孵育1h，在冰浴条件下停止反应，2000rpm离心10min，取上清150微升至96孔细胞板，酶标仪450nm读数；
(7)统计学分析：应用SPSS17.0软件进行统计学分析，各实验组与对羊红细胞对照组采用t检验，以p＞0.05为无统计学差异；以p＜0.05为有统计学差异；p＜0.01为有非常显著性差异；
(8)不同浓度气管炎疫苗免疫：将含菌6×108/ml的气管炎疫苗对倍稀释至0.375×108/ml，共分成5组作为实验组同时与羊红细胞组、空白组，按上述试验操作方法进行。
本发明的有益效果是：本发明工艺将溶血空斑形成试验和分光光度法测定抗体形成细胞两种方法进行优化和创新，建立了微量溶血分光光度法测定抗体形成细胞。反应在96孔细胞培养板内进行，用酶标仪一次大量检测样品；本发明工艺经过经过多次重复均能得出相应结果，固采用该方法科学、准确，重复性好。
具体实施方式
现在结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
一种利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法，包括如下工艺步骤：
(1)试验准备：
a.供试品：制备气管炎疫苗：将甲型溶血性链球菌、白色葡萄球菌、奈瑟氏双球菌经培养基培养采集后用甲醛杀菌，经离心洗涤后按照三种菌等量浓度混合，经PBS稀释而成；
b试验对象：50只雄性BABL/C小鼠，5～6的周龄，体重为18～22g，以及5只体重为250-300g的豚鼠，其中，小鼠共分5组，每组10只小鼠，具体为：
第一组：绝对空白对照组；
第二组：羊红细胞对照组；
第三组：气管炎疫苗第一试验组；
第四组：气管炎疫苗第二试验组；
第五组：气管炎疫苗第三试验组；
c.试验溶液：无菌脱纤维绵羊血，D-PBS，pH7.2-7.4；
d.试验仪器：显微镜，酶标仪，高速冷冻离心机；
(2)免疫：将第二组到第五组的小鼠分别用生理盐水和气管炎疫苗在第一天、第七天、第十四天颈背部皮下进行0.5ml/只的免疫，且这些小鼠在第22天腹腔内注射20％浓度绵羊红细胞悬液0.2ml/只，4天后将小鼠断颈脊髓处死，取脾脏；
(3)脾细胞悬液制备：将步骤(2)中收集到的脾脏经研磨、过滤，使其成为单个脾细胞，用D-PBS溶液洗涤并配制成2.9×107/ml的细胞悬液；
(4)SRBC悬液配制：取绵羊血，经无菌生理氯化钠溶液1500rpm离心10min洗涤3次，分别配制成20％和1％的积压绵红细胞悬液；
(5)补体制备：取3～5只未免疫豚鼠，采血分离血清后混合，取压积SRBC，按SRBC与豚鼠血清1∶3的比例加入压积SRBC，混匀，置4℃冰箱30min，2000r/min离心10min去除SRBC，以吸收豚鼠血清中存在的抗SRBC抗体；
(6)抗体形成细胞检测：取96孔板，依据分组要求，按生理盐水200ul，1％绵羊红细胞100ul，补体100ul，脾细胞100ul加入1ml离心管中，37℃孵育1h，在冰浴条件下停止反应，2000rpm离心10min，取上清150微升至96孔细胞板，酶标仪450nm读数；
(7)统计学分析：应用SPSS17.0软件进行统计学分析，各实验组与对羊红细胞对照组采用t检验，以p＞0.05为无统计学差异；以p＜0.05为有统计学差异；p＜0.01为有非常显著性差异；
(8)不同浓度气管炎疫苗免疫：将含菌6×108/ml的气管炎疫苗对倍稀释至0.375×108/ml，共分成5组作为实验组同时与羊红细胞组、空白组，按上述试验操作方法进行。
三批气管炎疫苗的结果如下：
试验组在450nm下OD值明显高于阴性对照组，见表1：
表1实验组和对照组样本A450值
结果从OD值表明，实验组与阴性对照组的抗体形成细胞介导溶血反应中释放的血红蛋白的量不同，试验组明显高于阴性组。
将绝对空白组、试验组分别与羊红细胞组进行t检验，统计结果显示各组与羊红细胞对照组有显著差异(p＜0.05)结果表明，在抗体形成细胞介导的溶血反应中，实验组与对照组中绵羊红细胞溶解后释放血红蛋白的量不同。
不同浓度气管炎疫苗免疫后的结果
将不同浓度的气管炎疫苗试验组和羊红细胞组、空白组在450nm下OD值，见表2：
表2实验组和对照组样本A450值
结果从OD值表明，气管炎疫苗随着浓度的降低其OD值也成降低趋势。
将绝对空白组、试验组分别与羊红细胞组进行t检验，统计结果显示空白组和气管炎疫苗浓度为6×108/ml、3×108/ml、1.5×108/ml时与羊红细胞对照组有显著差异(p＜0.05)，在气管炎疫苗浓度为0.75×108/ml与羊红细胞组不存在显著差异(P＝0.066)，在浓度为0.375×108/ml与羊红细胞组不存在显著差异(P＝0.517)。结果表明，在抗体形成细胞介导的溶血反应中，不同浓度的气管炎疫苗对小鼠刺激后产生抗体释放血红蛋白的量不同、且随着浓度的降低释放血红蛋白的量也降低。
分光光度法是通过被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。微量溶血分光光度法测定抗体形成细胞也是通过溶解后释放血红蛋白的量进行定性分析的方法，它应用溶血空斑形成试验结合用分光光度法测定抗体形成细胞，能够反映抗体形成细胞的数量变化规律。
气管炎疫苗免疫活性的研究通过绝对空白组、实验组与绵羊红细胞对照组效应关系实验加以证明。实验结果表明，实验组浓度在达到1.5×108/ml以上时与对照组相比均有显著性差异(p＜0.05)，同时在气管炎疫苗浓度低于0.75×108/ml时不存在显著差异(p＞0.05)。气管炎疫苗在国内用于治疗和预防呼吸道疾病已经有很长一段时间，效果显著，在动物实验中，可以提高动物对实验性感染的抵抗力，对巨噬细胞和B淋巴细胞有刺激作用，并可增强呼吸道粘膜的免疫球蛋白分泌。在人体中可增加循环中T淋巴细胞数量，提高唾液中sIgA含量，增强对多克隆有丝***原的非特异性反应，证明气管炎疫苗对呼吸道的感染及慢性支气管炎均有的免疫疗效。
本实施例从非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫角度，研究气管炎疫苗对机体免疫增强作用及免疫调节作用。实验表明，气管炎疫苗在浓度为1.5×108/ml以上时就可以达到增强小鼠免疫功能。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (1)
1.一种利用微量溶血分光光度法测定气管炎疫苗免疫活性的方法，其特征在于，包括如下工艺步骤：
(1)试验准备：
a.供试品：制备气管炎疫苗：将甲型溶血性链球菌、白色葡萄球菌、奈瑟氏双球菌经培养基培养采集后用甲醛杀菌，经离心洗涤后按照三种菌等量浓度混合，经PBS稀释而成；
b试验对象：50只雄性BABL/C小鼠，5～6的周龄，体重为18～22g，以及5只体重为250-300g的豚鼠，其中，小鼠共分5组，每组10只小鼠，具体为：
第一组：绝对空白对照组；
第二组：羊红细胞对照组；
第三组：气管炎疫苗第一试验组；
第四组：气管炎疫苗第二试验组；
第五组：气管炎疫苗第三试验组；
c.试验溶液：无菌脱纤维绵羊血，D-PBS，pH7.2-7.4；
d.试验仪器：显微镜，酶标仪，高速冷冻离心机；
(2)免疫：将第二组到第五组的小鼠分别用生理盐水和气管炎疫苗在第一天、第七天、第十四天颈背部皮下进行0.5ml/只的免疫，且这些小鼠在第22天腹腔内注射20％浓度绵羊红细胞悬液0.2ml/只，4天后将小鼠断颈脊髓处死，取脾脏；
(3)脾细胞悬液制备：将步骤(2)中收集到的脾脏经研磨、过滤，使其成为单个脾细胞，用D-PBS溶液洗涤并配制成2.9×107/ml的细胞悬液；
(4)SRBC悬液配制：取绵羊血，经无菌生理氯化钠溶液1500rpm离心10min洗涤3次，分别配制成20％和1％的积压绵红细胞悬液；
(5)补体制备：取3～5只未免疫豚鼠，采血分离血清后混合，取压积SRBC，按SRBC与豚鼠血清1∶3的比例加入压积SRBC，混匀，置4℃冰箱30min，2000r/min离心10min去除SRBC，以吸收豚鼠血清中存在的抗SRBC抗体；
(6)抗体形成细胞检测：取96孔板，依据分组要求，按生理盐水200ul，1％绵羊红细胞100ul，补体100ul，脾细胞100ul加入1ml离心管中，37℃孵育1h，在冰浴条件下停止反应，2000rpm离心10min，取上清150微升至96孔细胞板，酶标仪450nm读数；
(7)统计学分析：应用SPSS17.0软件进行统计学分析，各实验组与对羊红细胞对照组采用t检验，以p＞0.05为无统计学差异；以p＜0.05为有统计学差异；p＜0.01为有非常显著性差异；
(8)不同浓度气管炎疫苗免疫：将含菌6×108/ml的气管炎疫苗对倍稀释至0.375×108/ml，共分成5组作为实验组同时与羊红细胞组、空白组，按上述试验操作方法进行。
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