CN113082088B - 一种兽用治疗仔猪腹泻珠芽蓼提取物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种兽用治疗仔猪腹泻珠芽蓼提取物制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种兽用治疗仔猪腹泻珠芽蓼提取物制剂及其制备方法，将珠芽蓼粉碎后，先在水中浸泡28‑32min，然后加入超纯水为粉碎原料药质量的6‑10倍，采用超声法提取，提取温度为40‑60℃，时间为90‑150min，提取功率为400‑600W，反复提取2‑3次，过滤并合并上清液，对上清液用95％乙醇进行沉淀，收集沉淀物得珠芽蓼提取物。本发明还建立了高效液相色谱法用于测定提取物中没食子酸的含量，用以控制珠芽蓼提取物的质量。本发明还提供该珠芽蓼提取物在治疗仔猪细菌性腹泻的药物中的应用，研究表明珠芽蓼提取物对2‑11龄仔猪腹泻具有良好的治疗作用，可用于仔猪细菌性腹泻化学药物和抗生素的的替代补充药物。

Description

一种兽用治疗仔猪腹泻珠芽蓼提取物制剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种兽用治疗仔猪腹泻珠芽蓼提取物制剂及其制备方法和应用。
背景技术
珠芽蓼Polygonum viviparum L.系蓼科蓼属植物，主要生长于山坡林下，高山或亚高山草甸，海拔1200-5100m处。其性凉，味苦、涩，具有清热解毒、散疲止血的功效，常用于治疗扁桃体炎、咽喉炎、肠炎及跌打损伤等。珠芽寥含有挥发油、黄酮、酚酸及其他类成分。珠芽蓼主要活性成分为没食子酸、槲皮素、绿原酸等。
腹泻是当今危害仔猪最严重的传染病之一，严重威胁着养猪业的健康发展，导致饲料报酬降低，仔猪成活率下降，生长缓慢，生长发育停滞(僵猪)，甚至死亡。引起仔猪腹泻的病因十分复杂，主要包括细菌，病毒，日粮抗原过敏，营养因子缺乏等，其中仔猪细菌性腹泻病原常见的有致病性大肠杆菌、产气荚膜梭菌、福氏志贺氏菌、沙门氏菌等。
珠芽蓼中没食子酸、绿原酸、槲皮素的含量测定已有文献报道，为了有效控制药材的质量，本发明建立了高效液相色谱法同时测定珠芽蓼提取物中没食子酸的含量。该法简便、准确，适用于珠芽蓼提取物的质量分析和控制。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种兽用治疗仔猪腹泻珠芽蓼提取物制剂及其制备方法，本发明还提供其在制备治疗仔猪细菌性腹泻的药物中的应用。
本发明提供珠芽蓼提取物的制备方法，将珠芽蓼粉碎后，加入超纯水浸泡，比如浸泡28-32min，水的加入量为粉碎原料药质量的6-10倍；然后采用超声法提取，超声提取温度为40-60℃，超声时间为90-150min，超声提取功率为400-600W，反复提取2-3次，合并并过滤收集上清液，对上清液用95％乙醇进行沉淀，收集沉淀物得到珠芽蓼提取物。
作为优选，所述水溶液的加入量为粉碎原料药质量的8倍；和/或
所述超声提取温度为50℃；和/或
所述超声时间为90min；和/或
所述超声功率为500W。
本发明还提供一种兽用治疗仔猪腹泻的珠芽蓼提取物，是应用上述的方法制备得到的。
本发明还提供一种兽用治疗仔猪腹泻的药物制剂，所述药物制剂包括上述的珠芽蓼提取物。
作为优选，所述药物制剂还包括药学上可接受的辅料。
本发明还提供上述的珠芽蓼提取物、药物制剂在制备抑制大肠杆菌、产气荚膜梭菌、福氏志贺氏菌和/或沙门氏菌的药剂中的应用。
本发明还提供上述的珠芽蓼提取物、药物制剂在制备治疗仔猪细菌性腹泻的药物中的应用。
作为优选，导致仔猪细菌性腹泻的病原为大肠杆菌、产气荚膜梭菌、福氏志贺氏菌和沙门氏菌中的一种或几种。
本发明还提供上述的珠芽蓼提取物中没食子酸含量的HPLC测定方法，色谱条件为：Agilent 1260C18色谱柱，柱温30℃；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱，检测波长为275nm和360nm，体积流量0.8mL/min，进样量10μL。
作为优选，所述梯度洗脱具体为：
0-8min，流动相A为99％，流动相B为1％；
8-10min，流动相A由99％匀速变为93％，流动相B由1％匀速变为7％；
10-32min，流动相A由93％匀速变为85％，流动相B由7％匀速变为15％；
32-44min，流动相A由85％匀速变为82％，流动相B由15％匀速变为18％；
44-55min，流动相A由82％匀速变为68％，流动相B由18％匀速变为32％；
55-65min，流动相A由68％匀速变为95％，流动相B由32％匀速变为5％。
本发明以总黄酮提取率为指标，对珠芽蓼提取物的提取方法进行了优化，得到的珠芽蓼提取物能够有效治疗仔猪细菌性腹泻，研究表明珠芽蓼提取物对2-11日龄仔猪细菌性腹泻具有良好的治疗作用。本发明为仔猪细菌性腹泻提供了一种的有效的中药提取物治疗方法，安全可靠，绿色环保，可用于仔猪细菌性腹泻化学药物和抗生素的的替代补充药物。本发明还建立了高效液相色谱法用于测定珠芽蓼提取物中没食子酸的含量用以控制珠芽蓼提取物的质量标准，该法简便准确，可用于珠芽蓼提取物的质量分析和控制。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为不同因素交互作用的响应面图和等高线图。
图2为珠芽蓼提取物中的β-谷甾醇与β-谷甾醇标准品的TLC鉴别结果。
图3为对照品(A)和珠芽蓼提取物的液相色谱谱图(B)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
珠芽蓼提取物提取方法的优化步骤如下：
1.材料与仪器
珠芽蓼(甘肃复兴厚生物医药科技有限公司)，芦丁(中国药品生物制品检定所)，粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，TG-328B分析天平(湘仪天平仪器)；KH7200DB型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，酶标仪(基因有限公司)。
2.方法
2.1珠芽蓼提取物的提取方法
取珠芽蓼作为原料，将原料进行风干并粉碎，得到粉碎原料药；将得到的原料药浸泡在水溶液中30min，然后进行超声提取，其中水溶液的加入量为粉碎原料药质量的6-10倍；超声提取温度为40-60℃，超声时间为90-150min，超声提取功率为400-600W，按上述提取方式重复2-3次，得到超声提取后的溶液；将以上得到的重复2-3次超声提取后的溶液合并并过滤，在4500g下离心10min，收集上清液；向得到的上清液中按1:8的体积比加入70％的乙醇溶液醇沉，将醇沉溶液放入4℃下过夜，弃去上清，离心得到沉淀，将沉淀物冷冻干燥后得到珠芽蓼提取物。
本发明采用水提醇沉法获得珠芽蓼提取物，通过这一方法获得的主要成分为黄酮类成分，因此，通常采用总黄酮提取率进行提取工艺优化。
2.2珠芽蓼提取物中总黄酮含量测定方法
2.2.1总黄酮标准曲线的制备
称取芦丁2.5mg用70％乙醇定容至25ml(0.1mg/ml)，取0、1、2、3、4和5ml醇溶液于10ml试管中，加入5％的亚硝酸钠溶液0.5ml，静置6min；加入10％的硝酸铝溶液0.5ml，静置6min；加入4％氢氧化钠溶液4ml，静置15min；最后，在波长为510nm处测定吸光值。
2.2.2珠芽蓼提取物中总黄酮含量测定
精密称取0.5g珠芽蓼粉末置于50mL的三角瓶中，在所设定的条件下进行超声辅助提取，提取完成后趁热过滤，滤渣冲洗3次，滤液置于100mL容量瓶中，用70％(体积分数)乙醇定容，得供试液，在波长510nm处测定吸光值。按以下公式计算珠芽蓼提取物提取率：
Figure BDA0003004460720000041
其中：C为根据标准曲线计算出的珠芽蓼提取物质量浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为定容体积，mL；M为珠芽蓼干粉的的质量，g。
2.2.3珠芽蓼提取物提取工艺的Box-Benhnken试验
根据单因素试验结果，选择超声功率、料液比、超声温度和超声时间为考察因素，以珠芽蓼中总黄酮的提取率为评价，采用Box-Benhnken选取最优提取工艺条件。
表1试验因素与水平编码
因素/水平 -1 0 1
超声温度/℃ 40 50 60
料液比/(质量比) 1:6 1:8 1:10
超声时间/min 90 120 150
超声功率/W 400 500 600
表2Box-Benhnken实验设计表与效应值表
Figure BDA0003004460720000051
2.4数据分析
采用Design Expert8.0.6对数据进行处理及分析，建立回归方程。
3结果与分析
3.1响应面试验优化珠芽蓼提取物提取工艺
3.1.1回归模型的建立
从表3可知不同处理的珠芽蓼提取率。对数据进行拟合分析得线性回归方程模型:Y＝6.33-0.32A-0.68B+0.048C+0.41D+0.34AB+0.33AC-0.23AD-0.21BC-0.048BD-0.15CD-0.55A2+0.011B2-0.32C2-1.78D2。方差分析表明，该回归模型P＜0.0001，该模型极显著；且失拟值不显著，R2＝0.7992,R2 adj＝0.5985，表明该模型可靠。
表3回归方程中系数的显著性检验
Sumof Mean F p-value
Source Squares df Square Value Prob>F
Model 32.17 14 2.30 3.98 0.0072 significant
A-温度 1.23 1 1.23 2.13 0.1668
B-固液比 5.55 1 5.55 9.62 0.0078
C-时间 0.027 1 0.027 0.048 0.8304
D-功率 2.00 1 2.00 3.46 0.0838
AB 0.46 1 0.46 0.80 0.3858
AC 0.44 1 0.44 0.76 0.3973
AD 0.21 1 0.21 0.36 0.5554
BC 0.17 1 0.17 0.30 0.5922
BD 9.210E-03 1 9.210E-03 0.016 0.9013
CD 0.090 1 0.090 0.16 0.6985
A<sup>2</sup> 1.98 1 1.98 3.43 0.0852
B<sup>2</sup> 7.699E-04 1 7.699E-04 1.334E-03 0.9714
C<sup>2</sup> 0.65 1 0.65 1.12 0.3080
D<sup>2</sup> 20.66 1 20.66 35.78 <0.0001
Residual 8.08 14 0.58
LackofFit 8.08 10 0.81
PureError 0.000 4 0.000
CorTotal 40.25 28
表中P>F值小于0.05表明模型或考察因素有显著影响；P>F值小于0.01表明影响高度显著。
从表3回归系数的显著性检验可知，温度、功率及料液比之间的交互作用对珠芽蓼提取率影响较为显著，自变量与因变量的等高线及响应面图见图1。
图1为不同因素交互作用的响应面图和等高线图。
经超声时间、超声温度、料液比和超声功率等单因素试验后，来确定珠芽蓼提取的最优条件：采用响应面试验法进行试验，Box-Benhnken试验设计与结果分析如表3和图1所示。根据响应面回归方程绘制的响应曲面图和等高线图可进一步直观反映各因素的交互作用。其具体做法是将其它因素置于零点水平的条件下，绘制响应量与任意两个因素交互作用的三维曲面图，曲面的陡峭程度可反映各因素对响应值的影响，等高线图的椭圆程度则反映了两因素间交互作用显著程度，圆心处为极值存在的条件。本实验中4个因素两两交互响应曲面图和等高线图如图1所示。分析可知，超声功率与超声时间>交互作用显著，超声时间与液料比交互作用相对显著，其余因素两两交互作用均为不显著。同时也表明，较低的实验温度，适中的超声功率、超声时间及较小的液料比将有利于提高珠芽蓼的提取物。
3.2结论
利用Design-Expert 8.0.6软件分析，综合回归方程和响应面及等高线图得出，提取珠芽蓼提取物的最优工艺条件为：水溶液的加入量为珠芽蓼粉碎原料药质量的8倍；超声温度为50℃；超声时间为90min；超声功率为500W，在其条件下所得的珠芽蓼提取物总黄酮提取率达到4.1365％以上。
实施例1珠芽蓼提取物的提取方法
取珠芽蓼作为原料，将原料进行风干并粉碎，得到粉碎原料药；将得到的原料药浸泡在水溶液中30min，然后进行超声提取，其中水溶液的加入量为粉碎原料药质量的8倍；提取温度为50℃，超声时间为90min，超声提取功率为500W，按上述提取方式重复3次，得到超声提取后的溶液；将以上得到的重复3次超声提取后的溶液合并并过滤，在4500g下离心10min，合并上清液；向得到的上清液中按1:8的体积比加入70％的乙醇溶液醇沉，将醇沉溶液放入4℃下过夜，弃去上清，离心得到沉淀，将沉淀物冷冻干燥后得到珠芽蓼提取物。珠芽蓼提取物中总黄酮的提取率为6.2194％。
实施例2珠芽蓼提取物的提取方法
取珠芽蓼作为原料，将原料进行风干并粉碎，得到粉碎原料药；将得到的原料药浸泡在水溶液中30min，然后进行超声提取，其中水溶液的加入量为粉碎原料药质量的6-10倍；提取温度为40℃，超声时间为150min，超声提取功率为600W，按上述提取方式重复2次，得到超声提取后的溶液；将以上得到的重复2次超声提取后的溶液合并并过滤，在4500g下离心10min，合并上清液；向得到的上清液中按1:8的体积比加入70％的乙醇溶液醇沉，将醇沉溶液放入4℃下过夜，弃去上清，离心得到沉淀，将沉淀物冷冻干燥后得到珠芽蓼提取物。珠芽蓼提取物中总黄酮的提取率为4.1365％。
实施例3珠芽蓼提取物的提取方法
取珠芽蓼作为原料，将原料进行风干并粉碎，得到粉碎原料药；将得到的原料药浸泡在水溶液中30min，然后进行超声提取，其中水溶液的加入量为粉碎原料药质量的6-10倍；提取温度为60℃，超声时间为90min，超声提取功率为400W，按上述提取方式重复3次，得到超声提取后的溶液；将以上得到的重复3次超声提取后的溶液合并并过滤，在4500g下离心10min，合并上清液；向得到的上清液中按1:8的体积比加入70％的乙醇溶液醇沉，将醇沉溶液放入4℃下过夜，弃去上清，离心得到沉淀，将沉淀物冷冻干燥后得到珠芽蓼提取物。珠芽蓼提取物中总黄酮的提取率为4.4016％。
实施例4珠芽蓼提取物的提取方法
取珠芽蓼作为原料，将原料进行风干并粉碎，得到粉碎原料药；将得到的原料药浸泡在水溶液中30min，然后进行超声提取，其中水溶液的加入量为粉碎原料药质量的6-10倍；提取温度为45℃，超声时间为110min，超声提取功率为450W，按上述提取方式重复3次，得到超声提取后的溶液；将以上得到的重复3次超声提取后的溶液合并并过滤，在4500g下离心10min，合并上清液；向得到的上清液中按1:8的体积比加入70％的乙醇溶液醇沉，将醇沉溶液放入4℃下过夜，弃去上清，离心得到沉淀，将沉淀物冷冻干燥后得到珠芽蓼提取物。珠芽蓼提取物中总黄酮的提取率为5.1684％。
实施例5珠芽蓼提取物的提取方法
取珠芽蓼作为原料，将原料进行风干并粉碎，得到粉碎原料药；将得到的原料药浸泡在水溶液中30min，然后进行超声提取，其中水溶液的加入量为粉碎原料药质量的6-10倍；提取温度为55℃，超声时间为130min，超声提取功率为550W，按上述提取方式重复2次，得到超声提取后的溶液；将以上得到的重复2次超声提取后的溶液合并并过滤，在4500g下离心10min，合并上清液；向得到的上清液中按1:8的体积比加入70％的乙醇溶液醇沉，将醇沉溶液放入4℃下过夜，弃去上清，离心得到沉淀，将沉淀物冷冻干燥后得到珠芽蓼提取物。珠芽蓼提取物中总黄酮的提取率为5.6632％。
实施例6TLC鉴别珠芽蓼提取物中β-谷甾醇(β-谷甾醇是总黄酮成分之一，在药典上的定性检测采用了β-谷甾醇)
1.珠芽蓼提取物的提取制备
取珠芽蓼粉末约2.0g(60℃烘干)，精密称定，置索氏提取器中，加入V(石油醚)∶V(CHCl3)＝4：3加热回流至无色，提取液浓缩至近干，CHCl3定容至5mL，备用。
2.TLC鉴别珠芽蓼提取物中β-谷甾醇
硅胶G254板，展开剂V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝1：3，30％磷钼酸显色，105℃烘烤5min，样品在与β-谷甾醇标准品相同显相同斑点，结果见图2。
图2为珠芽蓼提取物中的β-谷甾醇与β-谷甾醇标准品的TLC鉴别结果。其中，1为β-谷甾醇标准品；2为珠芽蓼提取物。
实施例7HPLC法测定珠芽蓼提取物中没食子酸的含量
1.仪器与试剂
Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(9.4mm×250mm，5μm)，美国Agilent公司；没食子酸(批号:Y19M8C36143)对照品均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷均为分析纯。
2.方法
2.1色谱条件
Agilent 1260C18色谱柱(9.4mm×250mm,5μm)，柱温30℃；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱(梯度洗脱时间见表1)，检测波长为275nm和360nm，体积流量0.8mL/min，进样量10μL。
表4洗脱时间
Figure BDA0003004460720000091
2.2溶液制备
对照品溶液制备：精密称取没食子酸10.7mg置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得对照品储备液。精密量取上述储备液4mL置于50mL量瓶中，以甲醇定容至刻度，即得每1mL甲醇含没食子酸85.6μg的对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取按照实施例1方法制备的珠芽蓼提取物1g，置于30mL容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，放置2h后，在50℃条件下，超声提取30min，以0.45μm微孔滤膜滤过，取滤液即得。
2.3线性关系的分析
分别精密吸取“2.2”项下对照品溶液3μL、5μL、10μL、15μL、20μL注入色谱仪，以峰面积为纵坐标，以对照品溶液中没食子酸质量为横坐标绘制标准曲线，得到没食子酸的回归方程为Y＝3658475X+34321，相关系数为0.9992及线性范围0.1864～1.6234μg。
2.4精密度试验
精密吸取“2.2”条件下对照品溶液10μL，按照“2.2”条件下色谱条件连续进样6次，结果没食子酸峰面积的RSD(n＝6)为0.75％。
2.5重复性试验
按“2.2”条件下供试品溶液制备方法，平行制备6份珠芽蓼提取物供试品溶液，以“2.2”条件下色谱条件进样。结果没食子酸的含量平均值为1.73mg，表明各个被测成分重复性良好。
2.6稳定性试验
按“2.2”项下制备珠芽蓼提取物供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、10h按照“2.2”条件下色谱条件进样，计算样品中没食子酸的RSD为0.76％，结果表明供试品溶液在10h内稳定。
2.7回收率试验
精密量取已知没食子酸含量的样品，加入一定量的没食子酸对照品，按样品处理方法提取、测定，平行6组，计算平均加样回收率和RSD％。结果见表5。
表5加样回收率
Figure BDA0003004460720000101
Figure BDA0003004460720000111
3.珠芽蓼提取物中没食子酸含量的测定
采用所建立的液相分析方法对珠芽蓼提取物样品进行分析，色谱图见图3，共有9个色谱峰。通过与对照品进行色谱峰保留时间比对，鉴定了样品中成分为没食子酸等。
对珠芽蓼提取物样品的没食子酸进行HPLC测定，将峰面积分值代入回归方程中计算，得出没食子酸的含量为1.25mg/ml～2.76mg/ml。
图3为对照品和珠芽蓼提取物的液相色谱谱图。图中，A：对照品，B：珠芽蓼提取物，1没食子酸。
实施例8珠芽蓼提取物体外抑菌试验
腹泻是当今危害仔猪最严重的传染病之一，严重威胁着养猪业的健康发展，导致饲料报酬降低，仔猪成活率下降，生长缓慢，生长发育停滞(僵猪)，甚至死亡。引起仔猪腹泻的病因十分复杂，主要包括细菌，病毒，日粮抗原过敏，营养因子缺乏等。其中仔猪细菌性腹泻病原常见的有致病性大肠杆菌、产气荚膜梭菌、福氏志贺氏菌、沙门氏菌等。本实施例针对仔猪细菌性腹泻常见病原开展珠芽蓼体外抑菌活性试验。
1.材料与菌种
大肠杆菌162和大肠杆菌161为本申请人实验室自行分离鉴定的菌株；大肠杆菌：CICC 10389；产气荚膜梭菌：CICC 22949；福氏志贺氏菌：CICC 10865；沙门氏菌：CICC21513；96孔板；MHB培养基；酶标仪(Gene有限公司)，珠芽蓼(甘肃复兴厚生物医药科技有限公司)。
2.方法
2.1珠芽蓼提取液的制备
取珠芽蓼作为原料，将原料进行风干并粉碎，得到粉碎原料药；将得到的原料药浸泡在水中30min，然后进行超声提取，其中水的加入量为粉碎原料药质量的8倍；提取温度为50℃，超声时间为90min，超声提取功率为500W，按上述提取方式重复3次，得到超声提取后的溶液；将以上得到的重复3次超声提取后的溶液合并并过滤，在4500g下离心10min，合并上清液；向得到的上清液中按1:8的体积比加入70％的乙醇溶液醇沉，将醇沉溶液放入4℃下过夜，弃去上清，离心得到沉淀，将沉淀物冷冻干燥后得到珠芽蓼提取物，将珠芽蓼提取物浓度配制为0.5mg/ml，以备后用。
2.2MIC试验测定
将各种细菌隔夜培养16h后在超净台中用MHB培养基稀释500倍(体积比1:500)，需要15-25ml稀释好的菌液。一般是由50mL离心管，稀释后在涡旋上边混匀；然后向96孔板中加入灭菌后的MHB培养基，第一列180μL，其他每列100μL，为了方便快速，可以使用排枪，向无菌的培养皿中倒入适量的MHB培养基，然后用排枪加；向第一列加入药液20μL，吹打3-5次混匀，然后吸出100μL加至第二列，吹打3-5次混匀，这样倍比稀释至第十列，吸出的100μL液体弃去，这样前十列每孔的药物浓度都是上一孔的一半。前十一列加入稀释好的菌液100μL，第十二列加入100μL的无菌培养基，做空白对照，肯定没有细菌生长；第十一列没有药物，是阴性对照，一定有细菌生长。
MIC计算方法：最后一孔不生长细菌的药物浓度即为MIC。
计算方法：第一孔药物浓度＝第一孔加入药物的量/(0.2×2)。原因：在倍比稀释过程中药物吸走了一半加到下一孔了，后来又加入了100μL菌液，最后体积还是0.2mL。
3.结论
将珠芽蓼提取物浓度配制为0.5mg/ml，然后进行稀释加入96孔板中，得到结果如表6所示。从表6可知，珠芽蓼提取物的MIC为0.0625mg/ml。
表6珠芽蓼提取物对不同菌株的的抑菌效果/mm
Figure BDA0003004460720000121
实施例9珠芽蓼提取物对仔猪腹泻临床药效实验
1.仔猪细菌性腹泻发病症状
张掖民乐县某猪场，2-11日龄初生仔猪出现排出黄色粥样或水样粪便，后肢被粪液沾污，不愿吃奶、很快消瘦，脱水，极少迅速死亡的病例。对仔猪的粪便样本进行实验室培养分离检测，判定仔猪为大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌等多重细菌混合感染性腹泻。
2.药效标准
康复：仔猪腹泻症状消失，主动吃奶，体力精神状态恢复。
无效：仔猪腹泻症状加剧，加速消瘦、死亡等。
3.用药方法
每次用药量为2.0g实施例1制备的珠芽蓼提取物/头仔猪；将每2g实施例1制备的珠芽蓼提取物用0.9％的氯化钠注射液4ml稀释后，给仔猪灌服。
4.治疗情况
连续2次用药，对于粪便呈黄色、轻微拉稀有100％疗效；如水样性腹泻，则需用药4次，第一天2次(早晚各一次)、第二天一次、第三天一次，有显著疗效。
共用药治疗33头仔猪，其中康复32头，康复率96％；死亡1头，死亡率4％。具体用药情况见表7。
表7珠芽蓼提取物对仔猪腹泻临床药效实验
用药日龄 用药头数 用药次数 体重(kg) 康复头数 死亡头数
4日龄 2 3 均重1.9 1 1
2日龄 2 3 均重1.7 2 0
7日龄 1 2 3.1 1 0
11日龄 1 2 4 1 0
5日龄 7 3 均重1.8 7 0
7日龄 11 3 均重3.5 11 0
5日龄 9 4 均重2.5 9 0
5.治疗辅助措施
保温箱和产床上撒干燥粉，降低湿度及腹泻粪便交替传播；圈舍温度控制在20-25℃之间。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.珠芽蓼提取物的制备方法，其特征在于：将珠芽蓼粉碎后，加入超纯水浸泡，水的加入量为粉碎原料药质量的6-10倍；然后采用超声法提取，超声提取温度为40-60℃，超声时间为90-150min，超声提取功率为400-600W，反复提取2-3次，合并并过滤收集上清液，对上清液用95％乙醇进行沉淀，收集沉淀物得到珠芽蓼提取物。
2.根据权利要求1所述的珠芽蓼提取物的制备方法，其特征在于：所述水溶液的加入量为粉碎原料药质量的8倍；和/或
所述超声提取温度为50℃；和/或
所述超声时间为90min；和/或
所述超声功率为500W。
3.一种兽用治疗仔猪腹泻的珠芽蓼提取物，是应用权利要求1或2所述的方法制备得到的。
4.一种兽用治疗仔猪腹泻的药物制剂，其特征在于：所述药物制剂包括权利要求3所述的珠芽蓼提取物。
5.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于：所述药物制剂还包括药学上可接受的辅料。
6.权利要求3所述的珠芽蓼提取物、权利要求4或5所述的药物制剂在制备抑制大肠杆菌、产气荚膜梭菌、福氏志贺氏菌和/或沙门氏菌的药剂中的应用。
7.权利要求3所述的珠芽蓼提取物、权利要求4或5所述的药物制剂在制备治疗仔猪细菌性腹泻的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：导致仔猪细菌性腹泻的病原为大肠杆菌、产气荚膜梭菌、福氏志贺氏菌和沙门氏菌中的一种或几种。
9.权利要求1或2所述的珠芽蓼提取物中没食子酸含量的HPLC测定方法，其特征在于：色谱条件为：Agilent 1260C18色谱柱，柱温30℃；流动相A为0.1％的甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱，检测波长为275nm和360nm，体积流量0.8mL/min，进样量10μL。
10.根据权利要求9所述的HPLC测定方法，其特征在于：所述梯度洗脱具体为：
0-8min，流动相A为99％，流动相B为1％；
8-10min，流动相A由99％匀速变为93％，流动相B由1％匀速变为7％；
10-32min，流动相A由93％匀速变为85％，流动相B由7％匀速变为15％；
32-44min，流动相A由85％匀速变为82％，流动相B由15％匀速变为18％；
44-55min，流动相A由82％匀速变为68％，流动相B由18％匀速变为32％；
55-65min，流动相A由68％匀速变为95％，流动相B由32％匀速变为5％。
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