CN104195190A - 一种利用重组大肠杆菌厌氧生产5-氨基乙酰丙酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法，是将重组大肠杆菌接种于AM1-酵母粉无机盐培养基中，先在好氧条件下培养8～15h生长菌体，然后转厌氧发酵，发酵时间为72±10h。本发明方法无需添加昂贵的琥珀酸前体即可通过厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸，且生产的5-ALA不易被降解，简化了工艺，降低了成本。实验证实在厌氧发酵条件下本发明5-ALA的产量最高达1.65g/l，5-ALA/葡萄糖转化率为0.32g/g，提示具有很好的工业开发和应用前景。

Description

一种利用重组大肠杆菌厌氧生产5-氨基乙酰丙酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物技术及发酵工程领域，具体来说，涉及一种利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，简称5-ALA)是一种广泛存在于细菌、真菌、动物和植物体内的非蛋白氨基酸，其分子式为C₅O₃NH₉，分子量为131.13，熔点为118℃。在水溶液中不稳定，易发生缩合反应。5-ALA是吡啶的生物合成中的重要中间产物。因此常作为维生素B12、血红素和叶绿素的前体。医学上，它可以作为光动力学药物治疗各种癌症。农业上，5-ALA由于对作物、动物和人无毒性，可用作植物生长调节剂、除草剂和杀虫剂。此外在工业上，5-ALA是一种重要的有机合成中间体。

自然界中许多生物可以合成5-ALA，如光合细菌是一类能够大量合成5-ALA并分泌到胞外的微生物。自然界生物体内合成5-ALA的途径中，C4途径是利用琥珀酰-CoA和甘氨酸在5-氨基乙酰丙酸合成酶(5-ALAS)催化下一步生成5-ALA；而C5途径则是谷氨酸经过谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS,由gltX基因编码)、谷氨酰-tRNA还原酶(GluTR，由hemA基因编码)和谷氨酸-1-半醛-2，1-氨基转移酶(GSA-AM，由hemL基因编码)三步催化生成5-ALA。在细胞内，5-ALA可以进一步代谢形成亚铁血红素Heme。

目前与生物合成相对应的5-ALA的生物合成方式有利用C4途径生产5-ALA和通过C5途径直接从葡萄糖合成5-ALA两种。利用C4途径生产5-ALA，即通过表达5-ALA合成酶生物转化琥珀酸和甘氨酸生产5-ALA。在这种研究中通过优化5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA基因的表达和发酵条件，可以提高5-ALA的产量。通过C5途径直接从葡萄糖合成5-ALA，即通过C5途径合成5-ALA则需要复杂的代谢工程优化，必须构建基因工程菌株。一旦基因工程菌株构建完成，其生物合成过程相对简单和廉价。检索发现利用光合细菌合成5-ALA的研究也很多，但是光合细菌发酵中需采用光照，从而增加了成本，另外光合细菌生长缓慢，发酵时间长，不适合大规模工业发酵生产。并且，在好氧条件下，5-ALA在发酵后期容易发生降解，进一步向下游代谢被转换成血红素(有氧呼吸电子传递的组成部分)，产量明显下降。同时，血红素合成途径的部分中间产物对细胞具有毒害作用，易导致菌体生长缓慢。

厌氧条件下5-ALA不易被转化降解，有利于5-ALA的生产和使产量提高；同时，厌氧发酵减少了发酵工业中最大的能量消耗成本----通气搅拌成本，培养过程简单、生产规模容易扩大，具有明显的优势。但检索发现有关利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法还未见报道。

发明内容

针对现有方法与技术的不足，本发明的目的是提供一种利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)的方法。

本发明的技术方案是基于5-ALA的C4生物合成途径，利用重组大肠杆菌在AM1酵母粉无机盐培养基条件下以廉价的葡萄糖和甘氨酸为底物厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)。其中，所述重组大肠杆菌是任何能表达5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS)和琥珀酰辅酶A合成酶(SucCD)并在厌氧条件下产生琥珀酸的菌株。

本发明所述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于：利用重组大肠杆菌厌氧生产5-氨基乙酰丙酸的发酵条件为：以体积百分比计为2％～5％的接种量将重组大肠杆菌接种于AM1-酵母粉无机盐培养基中，先在好氧条件下培养8～15h生长菌体，然后转厌氧发酵，发酵时间为72±10h；其中，温度均控制为37±1℃，pH均控制为6.5±0.5，所述AM1-酵母粉无机盐培养基配方是：(NH₄)₂HPO₄，2.6306g/l；NH₄H₂PO₄，0.8709g/l；KCl，0.1491g/l；3-吗啉丙磺酸(MOPS)，20.9270g/l；酵母粉，2g/l；用Na₂CO₃调pH至7.0，余量为水；使用时添加0.15mM MgSO₄·7H₂O及体积比为1‰的微量元素溶液；其中微量元素1000×母液配方是：FeCl₃·6H₂O，2.4003g/l；CoCl₂·6H₂O，0.2998g/l；ZnCl₂，0.2999g/l；Na₂MoO₄·2H₂O，0.3000g/l；H₃BO₄，0.0748g/l，MnCl₂·4H₂O，0.4948g/l；CuCl₂·2H₂O，0.1500g/l；用120mM HCl溶解；其中，所述重组大肠杆菌是任何能表达5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS)和琥珀酰辅酶A合成酶(SucCD)并在厌氧条件下产生琥珀酸的菌株。

上述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法中：所述重组大肠杆菌在好氧条件下优选培养12h，转速为250±10rpm。

进一步的，上述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法具体步骤是：

(1)用接种环从保藏的大肠杆菌重组菌株的甘油管中蘸取菌液后，在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上划线，并将划线的LB平板置于37℃培养12±1h。

(2)将LB平板上的单克隆接种于含50ml LB培养基的300ml摇瓶中，并放置在转速为250rpm，温度为37℃的摇床中，培养12±1h，得到种子培养液。

(3)取2ml种子液接种于含100ml AM1-酵母粉无机盐发酵培养基的300ml摇瓶中，并放置在转速为250rpm，温度为37℃的摇床中进行发酵，并用IPTG诱导。K₂CO₃调pH至6.5。发酵初始添加2g/l甘氨酸。

(4)将培养12h后的发酵液转入含130ml AM1-酵母粉无机盐发酵培养基的厌氧瓶中密封厌氧发酵，条件：37℃，210rpm，pH6.5。分别于12h，22h，28h各补加2g/l甘氨酸，72h结束发酵。每6h取一次样检测5-ALA产量。

上述5-ALA检测方法是：12000rpm离心发酵液2min，将上清转入新的离心管中。按一定比例进行稀释。取稀释液400μl，分别加入200μl的乙酸钠缓冲液和100μl的乙酰丙酮，煮沸反应15min。冷却至室温，加入Modified Ehrlich’s reagent试剂反应10min，然后利用1cm的比色皿在波长554nm下利用分光光度计检测。

上述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法中：所述重组大肠杆菌由如下方法制得：构建含hemA基因的表达载体pTrc99a-hemA，在此基础上再构建含sucCD基因的表达载体pTrc99a-hemA-sucCD，将所构建的重组载体pTrc99a-hemA-sucCD共转化重组大肠杆菌中，获得能同时过量表达hemA和sucCD的重组大肠杆菌；其中，所述hemA是来源于类球红杆菌的hemA基因，所述sucCD基因来源于大肠杆菌。

上述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法中：所述重组大肠杆菌优选是大肠杆菌YL106-hemA-sucCD，大肠杆菌W3110-hemA-sucCD，或大肠杆菌W3110GAB-hemA-sucCD。

其中：上述重组大肠杆菌进一步优选是大肠杆菌YL106-hemA-sucCD，其基因型为MG1655(ptsG poxB pta iclR sdhA arcA adhE ldhA pckA*ldhA::trc-rbs-glf)/pTrc99a-hemA-sucCD，由如下方法制得：构建含hemA基因的表达载体pTrc99a-hemA，在此基础上再构建含sucCD基因的表达载体pTrc99a-hemA-sucCD，将所构建的重组载体pTrc99a-hemA-sucCD共转化重组大肠杆菌YL106中，获得能同时过量表达hemA和sucCD的重组大肠杆菌，即为大肠杆菌YL106-hemA-sucCD；其中，所述hemA是来源于类球红杆菌的hemA基因，所述sucCD基因来源于大肠杆菌；所述重组大肠杆菌YL106已于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M 2013149，其基因型为MG1655ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*glf_ZM。

本发明针对5-ALA好氧生产时不稳定，极易被降解的限制，以及好氧发酵成本高的缺点，提供了一种厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法。本发明方法是通过琥珀酰CoA合酶及5-ALA合成酶hemA的作用，同时添加甘氨酸来生产5-ALA。该方法无需添加昂贵的琥珀酸前体，生产的5-ALA不易被降解；同时，采用廉价无机盐培养基，简化了发酵工艺，降低了生产成本。厌氧发酵条件下5-ALA的产量最高达1.65g/l，5-ALA/葡萄糖转化率为0.32g/g。转化率具有明显优势，提示具有很好的工业开发和应用前景。

附图说明

图1.重组大肠杆菌发酵葡萄糖生产5-ALA的途径。

图2.构建质粒表达载体图谱。

图3.重组大肠杆菌YL106-hemA-sucCD厌氧发酵条件下胞外5-ALA浓度，葡萄糖，菌体密度(OD₆₀₀)，琥珀酸与发酵时间的关系曲线。

具体实施方式

一般性说明：实施例所涉及的酶均购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自天根公司，琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒购自申能***公司，操作完全按照相应说明书进行。质粒构建中基因测序由华大基因公司完成。5-ALA标准样品及其他试剂均购自Sigma公司。DH5α感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。

LB液体培养基配方：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 10g/l，pH 7.0。

LB-氨苄培养基配方：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 10g/l，氨苄青霉素100μg/ml

5-ALA检测方法是：12000rpm离心发酵液1ml，将上清转入新的离心管中。按一定比例进行稀释。取稀释液400μl，分别加入200μl的乙酸钠缓冲液和100μl的乙酰丙酮，煮沸反应15min。冷却至室温，加入Modified Ehrlich’s reagent 700μl，试剂反应10min，然后利用1cm的比色皿在波长554nm下利用分光光度计检测。

乙酸盐缓冲液组成为(1升双蒸水):57ml冰乙酸，82g无水醋酸钠。

改良Ehrlich’s试剂：在50ml的量筒中加入30ml的冰乙酸，1g对-二甲氨基苯甲酸，8ml70％高氯酸，然后定容至50ml。

AM1-酵母粉无机盐培养基配方：(NH₄)₂HPO₄，2.6306g/l；NH₄H₂PO₄，0.8709g/l；KCl，0.1491g/l；3-吗啉丙磺酸(MOPS)，20.9270g/l；酵母粉，2g/l；用Na₂CO₃调pH至7.0，余量为水；121℃灭菌20min。使用时添加0.15mM MgSO₄·7H₂O及1‰(v/v)微量元素溶液。

微量元素溶液(1000×母液)配方：FeCl₃·6H₂O，2.4003g/l；CoCl₂·6H₂O，0.2998g/l；ZnCl₂，0.2999g/l；Na₂MoO₄·2H₂O，0.3000g/l；H₃BO₄，0.0748g/l，MnCl₂·4H₂O，0.4948g/l；CuCl₂·2H₂O，0.1500g/l；用120mM HCl溶解。121℃灭菌20min。

50％的葡萄糖溶液(w/v)，单独灭菌。

重组大肠杆菌(Escherichia coli)YL106，属于革兰氏阴性菌。该菌呈杆状，大小为0.4～0.6微米×1～3微米，有普通菌毛和性菌毛，无芽孢，生长温度范围在15～46℃之间，最适生长温度为37℃。该菌已由申请人于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M2013149。该菌的相关专利申请号为：201310203945.9，申请日为：2013-05-28。该菌株构建的出发菌株是大肠杆菌K-12系列MG1655，其基因组序列号为NC_000913.2。

重组大肠杆菌W3110(来源于美国典型菌种保藏中心，保藏号ATCC27325)。

实施例1、5-氨基乙酰丙酸合成酶(hemA)基因的表达载体的构建

根据NCBI公布的类球红杆菌基因组序列，利用引物hemA-F：5′-GCTCTAGAAGGAGAACAGCTATGGACTACAATCTGGCACTC-3′和hemA-R：5′-CCCAAGCTTCGAAAGAAGTAGCACAGGGC-3'，以含有hemA基因的质粒PUI1014为模板进行PCR，克隆hemA基因。将克隆的hemA片段分别利用核酸内切酶Xbal和PstI消化处理，同时将质粒载体pTrc99a也分别利用核酸内切酶XbaI和PstI消化处理。将消化处理的hemA片段和pTrc99a质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。

连接体系为：

hemA片段：6μl

pTrc99a载体：2μl

10×Buffer：1μl

Τ4连接酶：lμl

25℃连接1h后，将10μl的连接液转化大肠杆菌YL106感受态细胞。

转化过程为：将10μl的连接液加入感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μl的LB培养基，37℃，180rpm，孵化lh，涂布氨苄青霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进ー步测序验证hemA基因的正确。从而获得重组质粒pTrc99a-hemA。

实施例2、琥珀酰辅酶A合成酶(sucCD)基因表达载体的构建

根据NCBI公布的大肠杆菌基因组序列，利用引物HindIII-sucCD-F：5′-CCCAAGCTTAGAAGGAGAACAGCTATGAACTTACATGAATATCAGGCA-3′和HindIII-sucCD-R：5′-CCCAAGCTTTTATTTCAGAACAGTTTTCAGTGC-3′，以大肠杆菌MG1655基因组为模板，PCR扩增sucCD基因。将克隆的sucCD片段利用核酸内切酶HindIII消化处理，同时将质粒载体pTrc99A-hemA也核酸内切酶HindIII消化处理。将消化处理的sucCD片段和pTrc99A-hemA质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。

连接体系为10μl：

sucCD片段：6μl

pTrc99A-hemA载体：2μl

10×Buffer：1μl

T4连接酶：0.5μl

25℃连接1h后，将10μl的连接液转化大肠杆菌YL106感受态细胞。

转化过程为：将10μl的连接液加入100μl的YL106感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μl的LB培养基，37℃，180rpm，孵化lh，涂布氨苄抗性平板，培养12h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证sucCD基因的正确。从而获得过量表达hemA和sucCD的重组质粒pTrc99A-hemA-sucCD。

实施例3、利用工程菌W3110-hemA-sucCD厌氧发酵生产ALA

步骤(1)将所构建的重组载体pTrc99a-hemA-sucCD以常规方法转化重组大肠杆菌W3110(来源于美国典型菌种保藏中心，保藏号ATCC27325)，获得能同时过量表达hemA和sucCD的重组大肠杆菌，命名为大肠杆菌W3110-hemA-sucCD。

步骤(2)用接种环从保藏的W3110-hemA-sucCD的甘油管中蘸取菌液后，在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上划线，并将划线的LB平板置于37℃培养12h。

步骤(3)将LB平板上的单克隆接种于含50ml LB培养基的300ml摇瓶中，并放置在转速为250rpm，温度为37℃的摇床中，培养12h，得到种子培养液。

步骤(4)取2ml种子液接种于含100ml AM1-酵母粉无机盐发发酵培养基的300ml摇瓶中，并放置在转速为250rpm，温度为37℃的摇床中进行发酵，并用IPTG诱导。K₂CO₃调pH6.5。发酵初始添加2g/l甘氨酸。初始葡萄糖浓度为20g/l。

步骤(5)将发酵培养12h后的发酵液转入含130ml AM1-酵母粉无机盐发酵培养基的厌氧瓶中，37℃，210rpm，厌氧发酵。分别于12h，22h，28h各补加2g/l甘氨酸，72h结束发酵。每6h取一次样检测ALA产量。

发酵结果显示，该重组大肠杆菌经过72h厌氧发酵，ALA产量达到84mg/l。

实施例4、产琥珀酸重组菌株W3110GAB的构建

(1).plfB基因的敲除：

菌种：大肠杆菌W3110

所述LB培养基为:蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 10g/l，氨苄青霉素,100mg/l，氯霉素50mg/l。

所述氨苄霉素抗性平板为含有100mg/l的氨苄青霉素，1.5％的琼脂粉的LB固体培养基。

所述氯霉素抗性平板为含有50mg/l的氯霉素，1.5％的琼脂粉的LB固体培养基。

所述SOC培养基为：蛋白胨2g/l，酵母粉0.5g/l，NaCl 0.0585g/l，KCl 0.0186g/l，MgCl₂0.203g，MgSO₄0.246g/l，葡萄糖20mmol/l。

a同源重组片断的克隆

利用Red重组***对目的基因进行敲除。

根据Genbank公布的plfB基因序列设计引物：

pflB_F：5'-

TCGGCAACATTATCGGTGGTGGTTTGTTGGTTGGGTTGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTT-3'

pflB_R：5'-

ATAGATTGAGTGAAGGTACGAGTAATAACGTCCTGCTGCTATGGGAATTAGCCATGGTC-3'

以pKD4通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片断。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。通过DpnI内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片断。

b电转化感受态细胞的制备

(Ⅰ)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌W3110，转入LB培养基中，同时加入0.2％的***糖，培养OD₆₀₀至0.5；

(Ⅱ)冰浴15min，离心菌体，然后利用10％的甘油洗涤三次；

(Ⅲ)加入10％的甘油，浓缩至50倍，分装感受态。

c电转化，筛选重组子

(Ⅰ)吸取1mg的同源重组片断，加入100μl的感受态细胞中，混匀。调节电穿孔仪，2.5Kv，电击；

(Ⅱ)加入900μl的SOC培养基，37℃，150rpm，培养1h；

(Ⅲ)涂布氯霉素抗性平板，调取重组子利用引物

pflB-F:5'-ACTGATAACCTGATTCCGGTTACGA-3'

pflB-R:5'-ATGGGAATTAGCCATGGTCCATATG-3'

进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实pflB基因已被卡那霉素抗性基因替换。

(Ⅳ)FRT位点专一重组

将pCP20转入氯霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高至42℃过夜培养12h，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和氯霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在氯霉素抗性平板上不生长的已被FLP重组酶删除。利用检测引物pflB-F和pflB-R进一步鉴定。

(Ⅴ)获得工程菌株W3110(ΔpflB)。

(2).ptsG基因的敲除：

菌种：大肠杆菌W3110(ΔpflB)

所述LB培养基为:蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 10g/l，氨苄青霉素,100mg/l，氯霉素50mg/l。

所述氨苄霉素抗性平板为含有100mg/l的氨苄青霉素，1.5％的琼脂粉的LB固体培养基。

所述氯霉素抗性平板为含有50mg/l的氯霉素，1.5％的琼脂粉的LB固体培养基。

所述SOC培养基为：蛋白胨2g/l，酵母粉0.5g/l，NaCl 0.0585g/l，KCl 0.0186g/l，MgCl₂0.203g，MgSO₄0.246g/l，葡萄糖20mmol/l。

a同源重组片断的克隆

利用Red重组***对目的基因进行敲除。

根据Genbank公布的ptsG基因序列设计引物：

pKD-ptsG F:

5'-ACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'

pKD-ptsG R:

5'-AGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3'

以pKD3通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有氯霉素抗性的重组片断。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。通过DpnI内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片断。

b电转化感受态细胞的制备

(Ⅰ)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌W3110(ΔpflB)，转入LB培养基中，同时加入0.2％的***糖，培养OD₆₀₀至0.5；

(Ⅱ)冰浴15min，离心菌体，然后利用10％的甘油洗涤三次；

(Ⅲ)加入10％的甘油，浓缩至50倍，分装感受态。

c电转化，筛选重组子

(Ⅰ)吸取1mg的同源重组片断，加入100μl的感受态细胞中，混匀。调节电穿孔仪，2.5Kv，电击；

(Ⅱ)加入900μl的SOC培养基，37℃，150rpm，培养1h；

(Ⅲ)涂布氯霉素抗性平板，调取重组子利用

ptsG test F:5'-CCTGTACACGGCGAGGCTCT-3'

ptsG test R:5'-AATAACACCTGTAAAAAAGGCAGCC-3'

进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实ptsG基因已被氯霉素抗性基因替换。

(Ⅳ)FRT位点专一重组

将pCP20转入氯霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高至42℃过夜12h，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和氯霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在氯霉素抗性平板上不生长的已被FLP重组酶删除。利用检测引物ptsG test F和ptsG test R进一步鉴定。

(Ⅴ)获得工程菌株W3110(ΔpflBΔptsG)。

(3)ldhA基因的敲除

菌株：W3110(ΔpflBΔptsG)

所使用的LB培养基为：1％蛋白胨，1％NaCl，0.5％酵母粉。

所使用的氨苄霉素抗性平板为含有100mg/l氨苄霉素和1.5％琼脂粉的LB固体培养基。

所使用的卡那霉素抗性平板为含有50mg/l卡那霉素和1.5％琼脂粉的LB固体培养基。

a.同源重组片段的克隆

利用Red同源重组***对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的ldhA基因序列在距其上下游约250bp处设计引物：

ldhA-F：5’-CAGCGTCAACGGCACAAGAAT-3’

ldhA-R：5’-GCTGATTTCTGGCGGATTTTT-3’

以MG1655(ΔldhA::kan)为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片段。PCR反应体系如下：

10×缓冲液5μl；10mmol/L dNTP混合液4μl；20μmol/l的ldhA-F引物1μl；20μmol/l的ldhA-R引物1μl；Taq DNA聚合酶0.5μl；模板DNA 1μl，加水补至50μl；

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后72℃终延伸10min，4℃保存。回收纯化浓缩同源重组片断备用。

b.电转化感受态细胞的制备

1)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌W3110(ΔpflBΔptsG)，接种到LB培养基中，同时加入1ml10％***糖，培养OD₆₀₀至0.6；

2)冰浴10min，收集菌体后利用10％的甘油洗涤三～五次；

3)用100μl的10％甘油重悬即得到电转化感受态细胞，置于冰上备用。

c.电转化，筛选重组子

1)取1mg纯化好的重组片段，加入到100μl电转化感受态细胞中，混匀并冰置2min后，2.5Kv电击。

2)迅速加入900μl LB培养基，37℃，150rpm回复培养1h。

3)将菌体涂布于卡那霉素抗性平板上，挑去重组子划线后，利用检测引物

ldhA test F:5’-TGCAATACGTGTCCCGAG-3’

ldhA test R:5’-CAGTTTGCCTTCACCGCT-3’

进行PCR检测。

d.抗性筛选标记的去除

将质粒pCP20转入重组子，30℃220rpm培养6h，然后转入到42℃220rpm培养过夜12h。用接种环蘸取菌液在无抗性平板上划线，将长出的单克隆转接到无抗性平板和卡那霉素抗性平板上，能够在无抗性平板上生长而不能在卡那霉素抗性平板上生长的即为抗性已去除的重组子，然后利用ldhA test F和ldhA test R进一步PCR检测确定是否去除成功。

e.去除抗性成功的重组大肠杆菌菌株命名为产琥珀酸重组大肠杆菌W3110GAB(基因型W3110ΔpflBΔptsGΔldhA)。

实施例4、利用工程菌W3110GAB-hemA-sucCD厌氧发酵生产ALA

步骤(1)将所构建的重组载体pTrc99a-hemA-sucCD以常规方法转化产琥珀酸重组大肠杆菌W3110GAB(基因型为W3110ΔpflBΔptsGΔldhA)，获得能同时过量表达hemA和sucCD的重组大肠杆菌，命名为大肠杆菌W3110GAB-hemA-sucCD。

步骤(2)用接种环从保藏的W3110GAB-hemA-sucCD的甘油管中蘸取菌液后，在含有100μg/ml氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上划线，并将划线的LB平板置于37℃过夜培养12h。

步骤(3)将LB平板上的单克隆接种于含50ml LB培养基的300ml摇瓶中，并放置在转速为250rpm，温度为37℃的摇床中，过夜培养12h，得到种子培养液。

步骤(4)取2ml种子液接种于含100ml AM1-酵母粉无机盐发发酵培养基的300ml摇瓶中，并放置在转速为250rpm，温度为37℃的摇床中进行发酵，并用IPTG诱导。K₂CO₃调pH6.5。发酵初始添加2g/l甘氨酸。初始葡萄糖浓度为20g/l。

步骤(5)将培养12h后的发酵液转入含130ml AM1-酵母粉无机盐发酵培养基的厌氧瓶中，37℃，210rpm，厌氧发酵。分别于12h，22h，28h各补加2g/l甘氨酸，72h结束发酵。每6h取一次样检测ALA产量。

发酵结果所示，该重组大肠杆菌经过72h厌氧发酵，ALA产量达到240mg/l。

实施例5、重组大肠杆菌工程菌YL106-hemA-sucCD厌氧发酵生产5-ALA

步骤(1)将所构建的重组质粒pTrc99a-hemA-sucCD以常规方法转化产琥珀酸重组大肠杆菌YL106中，得到同时过量表达hemA和sucCD的重组大肠杆菌YL106-hemA-sucCD。上述产琥珀酸重组大肠杆菌YL106已于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M 2013149，其基因型为MG1655ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*glfZM。

步骤(2)用接种环从保藏的YL106-hemA-sucCD的甘油管中蘸取菌液后，在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上划线，并将划线的LB平板置于37℃过夜培养12h。

步骤(3)将LB平板上的单克隆接种于含50ml LB培养基的300ml摇瓶中，并放置在转速为250rpm，温度为37℃的摇床中，过夜培养12h，得到种子培养液。

步骤(4)取2ml种子液接种于含100ml AM1-酵母粉无机盐发发酵培养基的300ml摇瓶中，并放置在转速为250rpm，温度为37℃的摇床中进行发酵，并用IPTG诱导。K₂CO₃调pH6.5。发酵初始添加2g/l甘氨酸。初始葡萄糖浓度为20g/l。

步骤(5)将培养12h后的发酵液转入含130ml AM1-酵母粉无机盐发酵培养基的厌氧瓶中，37℃，210rpm，厌氧发酵。分别于12h，22h，28h各补加2g/l甘氨酸，72h结束发酵。每6h取一次样检测5-ALA产量。

发酵结果如图3所示，该重组大肠杆菌经过72h厌氧发酵，5-ALA产量达到1.65g/l，5-ALA/葡萄糖转化率为0.32g/g。

Claims (5)

1.一种利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于：利用重组大肠杆菌厌氧生产5-氨基乙酰丙酸的发酵条件为：以体积百分比计为2％～5％的接种量将重组大肠杆菌接种于AM1-酵母粉无机盐培养基中，先在好氧条件下培养8～15h生长菌体，然后转厌氧发酵，发酵时间为72±10h；其中，温度均控制为37±1℃，pH均控制为6.5±0.5，所述AM1-酵母粉无机盐培养基配方是：(NH₄)₂HPO₄，2.6306g/l；NH₄H₂PO₄，0.8709g/l；KCl，0.1491g/l；3-吗啉丙磺酸，20.9270g/l；酵母粉，2g/l；用Na₂CO₃调pH至7.0，余量为水；使用时添加0.15mM MgSO₄·7H₂O及体积比为1‰的微量元素溶液；其中微量元素1000×母液配方是：FeCl₃·6H₂O，2.4003g/l；CoCl₂·6H₂O，0.2998g/l；ZnCl₂，0.2999g/l；Na₂MoO₄·2H₂O，0.3000g/l；H₃BO₄，0.0748g/l，MnCl₂·4H₂O，0.4948g/l；CuCl₂·2H₂O，0.1500g/l；用120mM HCl溶解；其中，所述重组大肠杆菌是任何能表达5-氨基乙酰丙酸合成酶和琥珀酰辅酶A合成酶并在厌氧条件下产生琥珀酸的菌株。

2.根据权利要求1所述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌在好氧条件下培养12h，转速为250±10rpm。

3.根据权利要求1或2所述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌由如下方法制得：构建含hemA基因的表达载体pTrc99a-hemA，在此基础上再构建含sucCD基因的表达载体pTrc99a-hemA-sucCD，将所构建的重组载体pTrc99a-hemA-sucCD共转化重组大肠杆菌中，获得能同时过量表达hemA和sucCD的重组大肠杆菌；其中，所述hemA是来源于类球红杆菌的hemA基因，所述sucCD基因来源于大肠杆菌。

4.根据权利要求3所述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌是大肠杆菌YL106-hemA-sucCD，大肠杆菌W3110-hemA-sucCD，或大肠杆菌W3110GAB-hemA-sucCD。

5.根据权利要求4所述利用重组大肠杆菌厌氧发酵生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌是大肠杆菌YL106-hemA-sucCD，其基因型为MG1655ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*glf_ZM/pTrc99a-hemA-sucCD，由如下方法制得：构建含hemA基因的表达载体pTrc99a-hemA，在此基础上再构建含sucCD基因的表达载体pTrc99a-hemA-sucCD，将所构建的重组载体pTrc99a-hemA-sucCD共转化重组大肠杆菌YL106中，获得能同时过量表达hemA和sucCD的重组大肠杆菌，即为大肠杆菌YL106-hemA-sucCD；其中，所述hemA是来源于类球红杆菌的hemA基因，所述sucCD基因来源于大肠杆菌；所述重组大肠杆菌YL106已于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M 2013149，其基因型为MG1655ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*glfZM。