CN104109651A - 利用l-乳酸合成s-1,2-丙二醇的重组大肠杆菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的重组大肠杆菌及其构建方法。该方法，包括如下步骤：1)将大肠杆菌BW25113-△poxB中的lldD基因、adheE基因和ackA-pta基因分别替换为3-羟基丙酸脱氢酶的编码基因、辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因和丙酰辅酶A转移酶的编码基因，得到的重组菌记为BWPDO1；2)敲除所述BWPDO1的ldhA基因和dld基因，得到重组菌BWPDO2；3)向所述BWPDO2中导入丙酮酸脱羧酶的编码基因和NAD依赖型乙醛辅酶A脱氢酶的编码基因，得到重组菌BWPDO3，即为所述重组大肠杆菌。实验证明，本发明所得的重组大肠杆菌可以利用L-乳酸转化生成S-1,2-丙二醇，以200mM乳酸钠为底物，37℃培养24小时可产生3.4mM的S-1,2-丙二醇。本发明为提高生物合成S-1,2-丙二醇的产量和转化率的工作打下了基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的重组大肠杆菌及其构建方法。
背景技术
丙二醇的结构区别将其区分为1,2-丙二醇和1,3-丙二醇。1,2-丙二醇主要用来生产不饱和聚酯树脂、防冻剂、增塑剂替代乙二醇用于防冻飞行器及在食品中作冷却剂和热载体等，它还可用于非离子洗涤剂或保湿剂。丙二醇还是良好的溶剂，可用于食品调味品和香料，或医药工业的软膏油膏等。
光学活性1,2-丙二醇具有活性基团，可作为手性起始物用于药物、除草剂、信息素和液晶的合成，具有很高的研究价值。大肠杆菌中自身存在有生成1,2-丙二醇的代谢通路。在代谢L-鼠李糖和L-岩藻糖途径中，磷酸化后的糖由醛缩酶催化生成L-乳醛和二羟丙酮磷酸(DHAP)，后在厌氧的条件和NADH存在下L-乳醛被催化为L-1,2-丙二醇，即S-1.2-丙二醇。但由于原料价格过高，此通路并没有很好经济效益，所以没有很好的研究价值。在嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)中也有从甲基乙二醛(methylglyoxal)分别生成乳醛(Lactaldehyde)或丙酮醛(Acetol)最终生成1,2-丙二醇的路径，但其中有些路径只是猜想的，目前并没有证据表明存在实际的酶去催化。
关于生物催化合成R-1,2-丙二醇的研究，目前，国外已有关于生物催化合成R-1,2-丙二醇的报道，Tadashi等采用气升式发酵罐对酵母还原丙酮醇生成R-1,2-丙二醇和酵母氧化拆分外消旋1,2-丙二醇进行了研究，但仍未得到工业化应用，而国内少有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的重组大肠杆菌及其制备方法与应用。
本发明所提供的方法可为利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的重组大肠杆菌A的制备方法，具体可包括如下(1)-(3)的步骤：
(1)将大肠杆菌BW25113-△poxB中的lldD基因、adheE基因和ackA-pta基因分别替换为3-羟基丙酸脱氢酶的编码基因(mmsB基因)、辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因(pdcD基因)和丙酰辅酶A转移酶的编码基因(pct基因)，得到的重组菌记为BWPDO1；
所述大肠杆菌BW25113-△poxB为将大肠杆菌BW25113野生型中的poxB基因敲除后所得的菌株；
(2)敲除步骤(1)获得的BWPDO1的ldhA基因和dld基因，得到的重组菌记为BWPDO2；
(3)向步骤(2)获得的BWPDO2中导入丙酮酸脱羧酶的编码基因(ZpPDC基因)和NAD依赖型的乙醛辅酶A脱氢酶的编码基因(mhpf基因)，得到的重组菌记为BWPDO3；所述BWPDO3即为所述重组大肠杆菌A。
其中，所述lldD基因为丙酮酸和L-乳酸转化编码基因、所述ldhA基因和所述dld基因为两个不同的丙酮酸和D-乳酸之间转化蛋白的编码基因。所述adheE基因和所述ackA-pta基因为两个不同的影响底物乙酰辅酶A含量的下游基因。
本发明所提供的方法也可为利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的重组大肠杆菌B的制备方法，包括以上的步骤(1)和步骤(2)；所述步骤(2)中获得的所述BWPDO2即为所述重组大肠杆菌B。
在上述方法的步骤(1)中，所述3-羟基丙酸脱氢酶为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的3-羟基丙酸脱氢酶，其氨基酸序列具体如序列表中序列12所示。所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶为小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)的辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶，其氨基酸序列具体如序列表中序列13所示。所述丙酰辅酶A转移酶为丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰辅酶A转移酶的点突变蛋白，其氨基酸序列具体如序列表中序列14所示。
在上述法的步骤(3)中，所述丙酮酸脱羧酶为棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)的丙酮酸脱羧酶，其氨基酸序列具体如序列表中序列15所示。所述NAD依赖型的乙醛辅酶A脱氢酶为来自大肠杆菌的需NAD的乙醛辅酶A脱氢酶，其氨基酸序列具体如序列表中序列16所示。
进一步，步骤(1)中，所述3-羟基丙酸脱氢酶的编码基因(mmsB基因)的核苷酸序列具体为序列表中序列1的第116-994位；所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因(pdcD基因)的核苷酸序列具体为序列表中序列2的第326-1714位；所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因(pct基因)的核苷酸序列具体为序列表中序列3的第326-1900位。步骤(3)中，所述丙酮酸脱羧酶的编码基因(ZpPDC基因)的核苷酸序列具体为序列表中序列4的第1001-2671位；所述NAD依赖型的乙醛辅酶A脱氢酶的编码基因(mhpf基因)的核苷酸序列具体为序列表中序列4的第3-953位。
另外，步骤(1)中，所述poxB基因的核苷酸序列具体为序列表中序列18所示；所述lldD基因的核苷酸序列具体为序列表中序列5；所述adheE基因的核苷酸序列具体为序列表中序列6；所述ackA-pta基因的核苷酸序列具体为序列表中序列7。步骤(2)中，所述ldhA基因的核苷酸序列具体为序列表中序列8；所述dld基因的核苷酸序列具体为序列表中序列9。
在所述方法的步骤(1)中，所述大肠杆菌BW25113-△poxB，具体是按照包括如下步骤的方法获得的：向含有pKD46质粒的所述大肠杆菌BW25113野生型的感受态中转入序列表中序列17所示的DNA片段17，所述DNA片段17与所述大肠杆菌BW25113野生型的基因组发生同源重组，即实现敲除所述大肠杆菌BW25113野生型的所述poxB基因，获得所述大肠杆菌BW25113-△poxB；事实上，在向所述大肠杆菌BW25113野生型中转入所述DNA片段17后，还包括消除pKD46质粒及转入pCP20质粒的步骤并消除pCP20质粒的步骤(用于去除整合到所述大肠杆菌BW25113野生型基因组中的所述DNA片段17上的Kan抗性基因)。
在所述方法的步骤(1)中，将所述大肠杆菌BW25113-△poxB中的所述lldD基因替换为所述3-羟基丙酸脱氢酶的编码基因，具体是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述大肠杆菌BW25113-△poxB的感受态中转入序列表中序列1所示的DNA片段1，所述DNA片段1与所述大肠杆菌BW25113-△poxB的基因组发生同源重组，即实现将所述lldD基因替换为所述3-羟基丙酸脱氢酶的编码基因。在本发明中，在向所述大肠杆菌BW25113-△poxB中转入所述DNA片段1后，还包括消除pKD46质粒的步骤及转入pCP20质粒的步骤并消除pCP20质粒的步骤(用于去除整合到所述大肠杆菌BW25113-△poxB基因组中的所述DNA片段1上的Kan抗性基因)。
将所述大肠杆菌BW25113-△poxB中的所述adheE基因替换为辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因，具体是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述大肠杆菌BW25113-△poxB的感受态中转入序列表中序列2所示的DNA片段2，所述DNA片段2与所述大肠杆菌BW25113-△poxB的基因组发生同源重组，即实现将所述adheE基因替换为所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因。在本发明中，在向所述大肠杆菌BW25113-△poxB中转入所述DNA片段2后，还包括消除pKD46质粒的步骤及转入pCP20质粒的步骤并消除pCP20质粒的步骤(用于去除整合到所述大肠杆菌BW25113-△poxB基因组中的所述DNA片段2上的Kan抗性基因)。
将所述大肠杆菌BW25113-△poxB中的所述ackA-pta基因替换为丙酰辅酶A转移酶的编码基因，具体是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述大肠杆菌BW25113-△poxB的感受态中转入序列表中序列3所示的DNA片段3，所述DNA片段3与所述大肠杆菌BW25113-△poxB的基因组发生同源重组，即实现将所述ackA-pta基因替换为所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因。在本发明中，在向所述大肠杆菌BW25113-△poxB中转入所述DNA片段3后，还包括消除pKD46质粒的步骤及转入pCP20质粒的步骤并消除pCP20质粒的步骤(用于去除整合到所述大肠杆菌BW25113-△poxB基因组中的所述DNA片段3上的Kan抗性基因)。
在所述方法的步骤(2)中，敲除所述BWPDO1的所述ldhA基因，具体是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述BWPDO1的感受态中转入序列表中序列10所示的DNA片段10，所述DNA片段10与所述BWPDO1的基因组发生同源重组，即实现敲除所述BWPDO1的所述ldhA基因。在本发明中，在向所述BWPDO1中转入所述DNA片段10后，还包括消除pKD46质粒的步骤及转入pCP20质粒的步骤并消除pCP20质粒的步骤(用于去除整合到所述BWPDO1基因组中的所述DNA片段10上的Kan抗性基因)。
敲除所述BWPDO1的所述dld基因，具体是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述BWPDO1的感受态中转入序列表中序列11所示的DNA片段11，所述DNA片段11与所述BWPDO1的基因组发生同源重组，即实现敲除所述BWPDO1的所述dld基因。在本发明中，在向所述BWPDO1中转入所述DNA片段11后，还包括消除pKD46质粒的步骤及转入pCP20质粒的步骤并消除pCP20质粒的步骤(用于去除整合到所述BWPDO1基因组中的所述DNA片段11上的Kan抗性基因)。
在所述方法的步骤(3)中，所述丙酮酸脱羧酶的编码基因和所述NAD依赖型的乙醛辅酶A脱氢酶的编码基因是通过重组表达载体的形式导入所述BWPDO2中的。
在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为将序列表中序列4所示DNA片段***到pBAD43载体的多克隆位点后得到的重组质粒。所述多克隆位点具体可为NcoI(序列4上为BspHI，两者为同尾酶)和SphI。
利用所述方法制备得到的所述重组大肠杆菌A或所述重组大肠杆菌B也属于本发明的保护范围。
所述重组大肠杆菌A或所述重组大肠杆菌B在利用L-乳酸或其盐合成S-1,2-丙二醇中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种利用L-乳酸或其盐合成S-1,2-丙二醇的方法。
本发明所提供的利用L-乳酸或其盐合成S-1,2-丙二醇的方法，可为如下(A)或(B)：
(A)包括如下步骤：向所述重组大肠杆菌B的培养体系中加入终浓度为200mM的L-乳酸或其盐作为底物，于37℃进行发酵培养，从培养液中获得S-1,2-丙二醇；
(B)向所述重组大肠杆菌A的培养体系中加入终浓度为200mM的L-乳酸或其盐作为底物，于37℃培养至OD600至0.6-0.8之间，加入终浓度为2g/L的L-***糖作为诱导剂，于37℃进行发酵培养，从培养液中获得S-1,2-丙二醇。
在所述方法中，所述重组大肠杆菌A或所述重组大肠杆菌B的培养体系中，培养基的碳源为葡萄糖，其含量为10g/L。
在所述方法中，所述发酵培养的培养方式可为振荡培养，转速可为180rpm；时间为24小时。
在所述方法中，所述培养体系中所述重组大肠杆菌A或所述重组大肠杆菌B的初始OD600为0.1。
实验证明，本发明通过Red重组手段对影响L-乳酸到S-1,2-丙二醇反应通路的一些基因进行了基因敲除的工作，同时将三个关键酶的基因***到大肠杆菌的基因组中去，利用T5启动子对其表达进行调控，并通过重组表达载体转入丙酮酸脱羧酶的编码基因(ZpPDC基因)和NAD依赖型的乙醛辅酶A脱氢酶的编码基因(mhpf基因)对菌株进行还原力的平衡(也就是NADH的回补方法)，最终获得了可以生物衍生L-乳酸转化生成S-1,2-丙二醇的代谢工程改造菌株。该重组大肠杆菌以200mM乳酸钠为底物，37℃培养24小时可产生3.4mM的S-1,2-丙二醇。本发明为提高生物合成S-1,2-丙二醇的产量和转化率的工作打下了基础。
附图说明
图1为重组大肠杆菌BWPDO1的PCR鉴定。其中，A为敲除lldD基因的同时替换上mmsB基因；B为敲除adhE基因的同时替换上pdcD基因；C为敲除ackA-pta基因的同时替换上pct基因。A-C中，泳道M1各条带由大到小依次为10.0、8.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.5、1.0、0.5kb；泳道M2各条带由大到小依次为4.5、3.0、2.0、1.2、0.8、0.5kb。
图2为重组大肠杆菌BWPDO1利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的结果。
图3为重组大肠杆菌BWPDO2的PCR鉴定。其中，A为敲除dld基因；B为敲除ldhA基因。A和B中，泳道M各条带由大到小依次为4.5、3.0、2.0、1.2、0.8、0.5kb。
图4为重组大肠杆菌BWPDO2利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的结果。
图5为重组大肠杆菌BWPDO3的PCR验证结果。泳道M各条带由大到小依次为4.5、3.0、2.0、1.2、0.8、0.5kb。
图6为重组大肠杆菌BWPDO3利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pBAD43载体：Youbio公司产品，其产品目录号为VT1293。
pKD46质粒(GenBank ID:AY048746.1)、pCP20质粒(GenBank ID:HB393402.1)：ATCC(美国菌种保藏中心)。参考文献：One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coliK-12using PCR products,DatsenkoKA,Wanner BL.,Proc Natl Acad Sci USA.2000Jun6；97(12):6640-5。
大肠杆菌BW25113野生型：Coli Genetics Stock Center，其产品目录号为CGSC#7636。
大肠杆菌BW25113-△poxB：由大肠杆菌BW25113野生型敲除poxB基因(序列18)所得，具体操作如下：
1、人工合成序列17所示的DNA片段：第1-59位为大肠杆菌BW25113野生型自身的poxB基因的上游序列(即上游同源臂)；第80-113位为FRT位点序列；第488-1282位为Kan抗性基因；第1473-1506位为FRT位点序列；第1527-1585位为大肠杆菌BW25113野生型自身的poxB基因的下游序列(即下游同源臂)该DNA片段用于敲除大肠杆菌BW25113野生型自身的poxB基因。
2、按照如下步骤进行
(1)参照实施例1步骤一1中的(1)中记载的方法，向大肠杆菌BW25113野生型中转入pKD46质粒并制备感受态，从而获得含有pKD46质粒的重组大肠杆菌BW25113野生型的感受态细胞。
(2)参照实施例1步骤一1中的(2)中记载的方法，将以上步骤1人工合成的DNA片段转入含有pKD46质粒的重组大肠杆菌BW25113野生型的感受态细胞。
(3)抗性筛选和PCR鉴定
将步骤(2)电转DNA片段后的重组菌涂布于Kan抗性平板长出的单克隆，进行PCR检测。以挑出的单克隆为模板，以引物poxB-F和poxB-R进行PCR扩增，选择经验证正确(得到大小约为1720bp目的条带)的克隆进行继续划线培养。
poxB-F：5’-ATTAACGGTAGGGTCGTCTCCG-3’；
poxB-R：5’-TCATCGGGCTATTTAACCGTTAGTG-3’。
(4)利用pCP20质粒消除抗性
参照实施例1步骤一1中的(4)中记载的方法进行。对于挑取的单克隆，以引物poxB-F和poxB-R进行PCR扩增，选择经验证正确(得到大小约327bp目的条带)的克隆进行继续划线培养。
(5)将步骤(4)鉴定阳性的克隆接种到LB液体培养基中，在42℃培养，传代两次，划单克隆，以去掉pCP20质粒，最后同时在氨苄抗性和无抗平板上划线，氨苄平板不能生长的菌株为敲除成功的无抗缺失体，即为大肠杆菌BW25113-△poxB。
本发明的发明人进一步利用引物poxB-F和poxB-R对大肠杆菌BW25113-△poxB进行测序工作，确定所***基因序列的正确性。
结果显示，采用引物poxB-F和poxB-R对大肠杆菌BW25113-△poxB进行测序，测序结果显示大肠杆菌BW25113-△poxB在对应序列表中序列17的基因组部分缺失了序列17的第80-1472位，实现了poxB基因的敲除。
实施例1、利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的重组大肠杆菌的构建及功能鉴定
一、重组大肠杆菌BWPDO1的构建及功能鉴定
1、重组大肠杆菌BWPDO1的构建
根据利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的途径确定参与催化的三个关键酶：分别是丙酰辅酶A转移酶(Pct，氨基酸序列为序列14)催化由L-乳酸至L-乳酰辅酶A反应、辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶(PdcD，氨基酸序列为序列13)催化由L-乳酰辅酶A至L-乳醛途径及3-羟基丙酸脱氢酶(MmsB，氨基酸序列为序列12)催化L-乳醛反应最终生成S-1,2-丙二醇。
设计思路：敲除大肠杆菌BW25113-△poxB自身的lldD基因(序列5)的同时替换上mmsB基因，敲除大肠杆菌BW25113-△poxB自身的adhE基因(序列6)的同时替换上pdcD基因，敲除大肠杆菌BW25113-△poxB自身的ackA-pta基因(序列7)的同时替换上pct基因。并且将三个关键酶基因—pct、pdcD和mmsB基因采用T5启动子控制表达，并在T5启动子后接SD序列。
根据如上设计思路，依据Red重组***工作原理，人工合成如下含有同源臂用于敲除替换的三个DNA片段：
DNA片段A：其核苷酸序列如序列表中序列1所示。其中，第1-40位为大肠杆菌BW25113-△poxB自身的lldD基因的上游序列(即上游同源臂)；第41-100位为T5启动子序列；第101-115位为SD序列；第116-994位为mmsB基因序列；第1016-1049位为FRT位点序列；第1424-2218位为Kan抗性基因；第2409-2442位为FRT位点序列；第2443-2482位为大肠杆菌BW25113-△poxB自身的lldD基因的下游序列(即下游同源臂)。该DNA片段A用于敲除大肠杆菌BW25113-△poxB自身的lldD基因同时替换上mmsB基因。
DNA片段B：其核苷酸序列如序列表中序列2所示。其中，第1-250位为大肠杆菌BW25113-△poxB自身的adhE基因的上游序列(即上游同源臂)；第251-310位为T5启动子序列；第311-325位为SD序列；第326-1714位为pdcD基因序列；第1736-1769位为FRT位点序列；第2144-2938位为Kan抗性基因；第3129-3162位为FRT位点序列；第3163-3412位为大肠杆菌BW25113-△poxB自身的adhE基因的下游序列(即下游同源臂)。该DNA片段B用于敲除大肠杆菌BW25113-△poxB自身的adhE基因同时替换上pdcD基因。
DNA片段C：其核苷酸序列如序列表中序列3所示。其中，第1-250位为大肠杆菌BW25113-△poxB自身的ackA-pta基因的上游序列(即上游同源臂)；第251-310位为T5启动子序列；第311-325位为SD序列；第326-1900位为pct基因序列；第1922-1955位为FRT位点序列；第2330-3124位为Kan抗性基因；第3315-3348位为FRT位点序列；第3349-3598位为大肠杆菌BW25113-△poxB自身的ackA-pta基因的下游序列(即下游同源臂)。该DNA片段C用于敲除大肠杆菌BW25113-△poxB自身的ackA-pta基因同时替换上pct基因。
将以上三个DNA片段(DNA片段A、DNA片段B和DNA片段C)通过电转的方式转入大肠杆菌BW25113-△poxB的感受态细胞，分三次实验转入，依次进行，从而实现目的基因的敲除与替换。以DNA片段A的转入实验为例说明具体步骤如下：
(1)把pKD46质粒转化到大肠杆菌BW25113-△poxB的感受态细胞中，30℃摇床180rpm，过夜培养。次日按接种量1％(体积分数)的比例将培养液接种到100mL新的LB培养基(100μg/mL氨苄青霉素)的锥形瓶中，30℃摇床180rpm，培养；OD＝0.1时加入终浓度0.2％(0.2g/100mL)L-***糖；待OD＝0.6-0.7时，将菌液分装成50mL/管，置于冰上冷却至4℃以下；6℃，4000rpm，离心10min，弃上清，收集菌体；每管加25mL10％(体积分数)无菌预冷甘油，轻轻悬浮，4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；每管加15mL10％(体积分数)无菌预冷甘油，轻轻悬浮，4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；每管加2mL10％(体积分数)无菌预冷甘油，轻轻悬浮，4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；每管加200μL无菌预冷甘油，轻轻悬浮，分装成50μL/管。放入-80℃冻存备用。得到含有pKD46质粒的大肠杆菌BW25113-△poxB的感受态细胞。
(2)从-80℃取出步骤(1)制备含有pKD46质粒的大肠杆菌BW25113-△poxB的感受态细胞，置冰上解冻，电击杯(1mm狭缝)晾干后置冰上；取200ng DNA片段(以上获得的DNA片段A)，加入到感受态中，温柔混匀，加到预冷的电极杯中；1800V电击，6ms，立即加入1mL LB培养基；将液体取出放入EP管中，150rpm恒温培养1h；取200μL涂布至含卡那抗生素(35μg/mL)的LB平板；倒置平板，于恒温培养箱中过夜培养。
(3)抗性筛选和PCR鉴定
将步骤(2)电转DNA片段A后涂布于Kan抗性平板长出的单克隆，进行PCR检测。以挑出的单克隆为模板，以表1中给出的编号为1的引物对分别进行PCR扩增，选择经验证正确的克隆进行继续划线培养。PCR扩增同时设置未转入DNA片段A的大肠杆菌BW25113-△poxB作为野生型对照(WT)。扩增产物的理论长度见表1(野生型和突变型KmR)。
表1基因敲除验证引物及理论扩增长度
(4)消除pKD46质粒并利用pCP20质粒消除抗性
挑取单克隆，于试管中42℃培养，180rpm，4-6小时后继续1％(体积分数)转接至新LB培养基中继续培养6-8小时。在终浓度为50μg/mL卡那霉素的平板上，划线，置于42℃，过夜培养。后挑取单克隆，分别在氨苄抗性和卡那抗性的平板上划线，挑选氨苄平板不长但卡那平板长的菌落，用于制备电转感受态。制备感受态后转入pCP20质粒。制备电转感受态和转化的方法同上。转化质粒pCP20后涂布氨苄抗性的平板，置于30℃温箱中培养过夜。挑取单克隆，利用表1中的编号为1的验证引物进行PCR扩增，选择经验证正确的克隆进行继续划线培养。PCR扩增同时设置大肠杆菌BW25113-△poxB作为野生型对照(WT)。扩增产物的理论长度见表1(野生型和突变型KmS)。
(5)将步骤(4)鉴定正确的阳性克隆接种到LB液体培养基中，在42℃培养，传代两次，划单克隆，以去掉pCP20质粒，最后同时在氨苄抗性和无抗平板上划线，氨苄平板不能生长的菌株为敲除成功的无抗缺失体。
经过以上步骤(1)-(5)完成lldD基因的敲除并***mmsB基因；然后开始继续向完成lldD基因的敲除并***mmsB基因的重组菌中转入pKD46质粒，继续制作感受态，即参照上述步骤(1)-(5)转入DNA片段B，验证，完成adhE基因替换为pdcD基因；然后继续参照上述步骤(1)-(5)向完成adhE基因替换为pdcD基因的重组菌中转入DNA片段C，完成ackA-pta基因替换pct基因。将最终获得的重组菌命名为重组菌BWPDO1。
以上步骤(3)对应的检测结果如图1中泳道W和泳道1所示，图中泳道W为野生型片段大小，泳道1为交换后敲除相应基因但是携带筛选抗性Kan的PCR片段大小。从图中可以看出，所得结果均与表1中预测结果一致。选择经验证正确的克隆进行继续划线培养。
以上步骤(4)对应的检测结果如图1中泳道W和泳道2所示，图中泳道W为野生型片段大小，泳道2为利用pCP20消除了两个FRT位点间的Kan抗性后的片段大小。从图中可以看出，所得结果均与表1中预测结果一致。
本发明的发明人进一步利用表1中编号为1-3的三对验证引物进行测序工作，确定所***基因序列的正确性。
结果显示，采用表1中的编号为1的引物对对重组菌BWPDO1进行测序，测序结果显示重组菌BWPDO1在对应序列表中序列1的基因组部分缺失了序列1的第1016-2408位，实现了mmsB基因对lldD基因的替换。采用表1中的编号为2的引物对对重组菌BWPDO1进行测序，测序结果显示重组菌BWPDO1在对应序列表中序列2的基因组部分缺失了序列2的第1736-3128位，实现了pdcD基因对adheE基因的替换。采用表1中的编号为3的引物对对重组菌BWPDO1进行测序，测序结果显示重组菌BWPDO1在对应为序列表中序列3的基因组部分缺失了序列3的第1922-3314位，实现了pct基因对ackA-pta基因的替换。
2、重组大肠杆菌BWPDO1的功能鉴定
将BWPDO1接入到LB培养基中过夜培养，后以1％(体积比)接种至新的LB培养基中，180rpm，37℃，培养12-16h，测定OD600，收菌，4000rpm，4℃离心10min。用生理盐水洗涤2遍，按同样条件离心收集菌体。将菌体重悬至pH7.2-7.4的PBS中，最终OD600至25至30左右，加入L-乳酸钠作为底物，终浓度分别为200mM和50mM，并加入1％(1g/100ml)的葡萄糖，进行休止细胞反应，反应温度设置30℃和37℃，反应24h。随反应进行进行取样，离心，取上清，并测定L-乳酸含量和S-1,2-丙二醇产量。实验重复三次，结果取三次重复的平均值。
结果如图2所示，从图中可以明显看出随着全细胞反应的进行，乳酸含量并没有下降而均有所上升，分析原因可能是并没有敲除丙酮酸至D-乳酸代谢的两个基因dld和ldhA，由于代谢通路中此途径通量较高，所以加入的1％葡萄糖经过糖酵解产生的丙酮酸经过此途径产生D-乳酸，造成所需的产生S-1,2-丙二醇途径代谢通量减少，且乳酸途径反应需NADH作为辅酶，造成所需途径NADH提供量减少，也间接造成产量下降。后期丙二醇产量下降的原因可能是细胞体内代谢及为了维持细胞内NADH水平所导致。为解决此问题，本发明的发明人继续进行了丙酮酸和D-乳酸之间转化蛋白基因ldhA和dld的敲除工作。
二、重组大肠杆菌BWPDO2的构建及功能鉴定
1、重组大肠杆菌BWPDO2的构建
依据Red重组***工作原理，人工合成如下含有同源臂用于敲除ldhA基因(序列8)和dld基因(序列9)的两个DNA片段：
DNA片段D：其核苷酸序列如序列表中序列10所示。其中，第1-59位为大肠杆菌BW25113-△poxB自身的ldhA基因的上游序列(即上游同源臂)；第80-113位为FRT位点序列；第488-1282位为Kan抗性基因；第1473-1506位为FRT位点序列；第1527-1585位为大肠杆菌BW25113-△poxB自身的ldhA基因的下游序列(即下游同源臂)。该DNA片段D用于敲除大肠杆菌BWPDO1自身的ldhA基因。
DNA片段E：其核苷酸序列如序列表中序列11所示。其中，第1-59位为大肠杆菌BW25113-△poxB自身的dld基因的上游序列(即上游同源臂)；第80-113位为FRT位点序列；第488-1282位为Kan抗性基因；第1473-1506位为FRT位点序列；第1527-1585位为大肠杆菌BW25113-△poxB自身的dld基因的下游序列(即下游同源臂)。该DNA片段E用于敲除大肠杆菌BWPDO1自身的dld基因。
将以上两个DNA片段(DNA片段D和DNA片段E)通过电转的方式转入步骤一构建的重组大肠杆菌BWPDO1的感受态细胞，分两次实验转入，依次进行，从而实现目的基因的敲除。以DNA片段D的转入实验为例说明具体步骤如下：
(1)参照步骤一1中的(1)中记载的方法，制备得到含有pKD46质粒的重组大肠杆菌BWPDO1的感受态细胞。
(2)参照步骤一1中的(2)中记载的方法，将以上获得的DNA片段D转入含有pKD46质粒的重组大肠杆菌BWPDO1的感受态细胞。
(3)抗性筛选和PCR鉴定
将步骤(2)电转DNA片段E后涂布于Kan抗性平板长出的单克隆，进行PCR检测。以挑出的单克隆为模板，以表1中给出的编号为4的引物对进行PCR扩增，选择经验证正确的克隆进行继续划线培养。PCR扩增同时设置未转入两个DNA片段的大肠杆菌BW25113-△poxB作为野生型对照(WT)。扩增产物的理论长度见表1(野生型和突变型KmS)。
(4)利用pCP20质粒消除抗性
参照步骤一1中的(4)中记载的方法进行。对于挑取的单克隆，利用表1中的编号为4的验证引物进行PCR扩增，选择经验证正确的克隆进行继续划线培养。PCR扩增同时设置未转入两个DNA片段的大肠杆菌BW25113-△poxB作为野生型对照(WT)。扩增产物的理论长度见表1(野生型和突变型KmS)。
(5)将步骤(4)鉴定正确的阳性克隆接种到LB液体培养基中，在42℃培养，传代两次，划单克隆，以去掉pCP20质粒，最后同时在氨苄抗性和无抗平板上划线，氨苄平板不能生长的菌株为敲除成功的无抗缺失体。
经过以上步骤(1)-(5)完成ldhA基因的敲除；然后开始继续向敲除了ldhA基因的重组菌中转入pKD46质粒，继续制作感受态，即参照上述步骤(1)-(5)转入DNA片段E，验证，完成dld基因的敲除。将最终获得的重组菌命名为重组菌BWPDO2。
以上步骤(3)对应的检测结果如图3中泳道W和泳道1所示，图中泳道W为野生型片段大小，泳道1为交换后敲除相应基因但是携带筛选抗性Kan的PCR片段大小。从图中可以看出，所得结果均与表1中预测结果一致。
以上步骤(4)对应的检测结果如图3中泳道W和泳道2所示，图中泳道W为野生型片段大小，泳道2为利用pCP20消除了两个FRT位点间的Kan抗性后的片段大小。从图中可以看出，所得结果均与表1中预测结果一致。
本发明的发明人进一步利用表1中编号为4和5的两对验证引物进行测序工作，确定所***基因序列的正确性。
结果显示，采用表1中的编号为4的引物对对重组菌BWPDO2进行测序，测序结果显示重组菌BWPDO2在对应序列表中序列10的基因组部分缺失了序列10的第80-1472位，实现了ldhA基因的敲除。采用表1中的编号为5的引物对对重组菌BWPDO2进行测序，测序结果显示重组菌BWPDO2在对应序列表中序列11的基因组部分缺失了序列11的第80-1472位，实现了dld基因的敲除。
2、重组大肠杆菌BWPDO2的功能鉴定
将BWPDO2接入LB培养基中，180rpm，37℃过夜培养。后以1％(体积比)接种量接入含有不同葡萄糖初始浓度(0.5％、1％、2％，单位g/100ml)及不同L-乳酸钠浓度(50、200mM)的M9培养基中(反应初始OD600约为0.1)，180rpm，37℃培养，24h。取样测定各条件下底物L-乳酸钠及产物S-1,2-丙二醇的含量。实验重复三次，结果取三次重复的平均值。
结果如图4所示，不同梯度葡萄糖条件和底物浓度所产生产物浓度均不相同，其中，经24小时发酵，产量最高条件为1％葡萄糖条件下L-乳酸底物浓度为200mM，S-1,2-丙二醇产量约为2mM，较休止细胞体系产量的2.8倍。
三、重组大肠杆菌BWPDO3的构建及功能鉴定
1、重组大肠杆菌BWPDO3的构建
为了进一步提高L-乳酸到S-1,2-丙二醇的转化率及产量，本发明的发明人对重组大肠杆菌BWPDO2菌株继续进行改造，找到两个酶分别是来自棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)的丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase)(ZpPDC，氨基酸序列如序列表中序列15所示)和来自大肠杆菌的NAD依赖型乙醛辅酶A脱氢酶(acetaldehyde-CoA dehydrogenase II,NAD-binding)(mhpf，氨基酸序列如序列表中序列16所示)，利用pBAD43载体对其这两个酶的基因进行串联表达。
(1)合成ZpPDC-mhpf基因片段
人工合成序列表中序列4所示的DNA片段。其中，第1-6位为酶切位点BspHI的识别序列，第3-953位为mhpf基因的序列，第1001-2671位为ZpPDC基因的序列，第2672-2677位为酶切位点SphI的识别序列。
(2)用限制性内切酶BspHI和SphI双酶切步骤(1)合成的两端带有酶切位点的ZpPDC-mhpf基因片段，胶回收后与经过NcoI(与BspHI为同尾酶)和SphI双酶切的pBAD43载体的骨架大片段相连，得到重组质粒。将经测序表明将pBAD43载体的酶切位点NcoI和SphI之间的小片段替换为序列表中序列4的第2-2671位所示DNA片段后得到的重组质粒命名为pBAD-MP。
(3)将步骤(2)所得的重组载体pBAD-MP通过电转的方式转入步骤二构建得到的重组大肠杆菌BWPDO2的感受态细胞中(具体操作参见上文)，挑取单克隆，采用引物pBAD-F和pBAD-R(两引物序列均为pBAD43载体自带序列)针对ZpPDC-mhpf基因片段进行PCR扩增。
pBAD-F：5’-CTGTTTCTCCATACCCGTT-3’；
pBAD-R：5’-CTCATCCGCCAAAACAG-3’。
将经PCR扩增得到大小约为2746bp目的条带(图5)的单克隆采用如上引物对进行测序。将测序结果显示含有序列表中序列4的重组菌命名为BWPDO3。
2、重组大肠杆菌BWPDO3的功能鉴定
将BWPDO3接入LB培养基中，180rpm，37℃过夜培养，为种子菌。后以1％(体积比)接种量接入含有终浓度1％(1g/100ml)葡萄糖及200mM L-乳酸钠的M9培养基中(反应初始OD600约为0.1)，180rpm，37℃培养，OD600至0.6-0.8之间，加入不同浓度L-***糖进行诱导，浓度梯度分别为0.05％，0.1％，0.2％，0.4％(0.05％即相当于0.05g/100ml，依次类推)，后培养24h，同时进行BWPDO2同条件培养进行对照。取样测定各条件下底物L-乳酸钠及产物S-1,2-丙二醇的含量。实验重复三次，结果取三次重复的平均值。
结果如图6所示，可以看出，重组大肠杆菌BWPDO3将L-乳酸合成S-1,2-丙二醇产量有所上升，其中最适诱导剂加入量为0.2％，产量约为3.4mM(即每升发酵液获得3.4mmol的S-1,2-丙二醇)，比重组大肠杆菌BWPDO2产量提升了约1.5倍。
Claims (10)
1.一种利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的重组大肠杆菌A的制备方法，包括如下(1)-(3)的步骤：
(1)将大肠杆菌BW25113-△poxB中的lldD基因、adheE基因和ackA-pta基因分别替换为3-羟基丙酸脱氢酶的编码基因、辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因和丙酰辅酶A转移酶的编码基因，得到的重组菌记为BWPDO1；
所述大肠杆菌BW25113-△poxB为将大肠杆菌BW25113野生型中的poxB基因敲除后所得的菌株；
(2)敲除步骤(1)获得的BWPDO1的ldhA基因和dld基因，得到的重组菌记为BWPDO2；
(3)向步骤(2)获得的BWPDO2中导入丙酮酸脱羧酶的编码基因和NAD依赖型乙醛辅酶A脱氢酶的编码基因，得到的重组菌记为BWPDO3；所述BWPDO3即为所述重组大肠杆菌A。
2.一种利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的重组大肠杆菌B的制备方法，包括权利要求1中的步骤(1)和步骤(2)；所述步骤(2)中获得的所述BWPDO2即为所述重组大肠杆菌B。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述3-羟基丙酸脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列12；所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列13；所述丙酰辅酶A转移酶的氨基酸序列为序列表中序列14；或
步骤(3)中，所述丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列为序列表中序列15；所述NAD依赖型乙醛辅酶A脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列16。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述3-羟基丙酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1的第116-994位；所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2的第326-1714位；所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因的核苷酸序列为序-列表中序列3的第326-1900位；或
步骤(3)中，所述丙酮酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4的第1001-2671位；所述NAD依赖型乙醛辅酶A脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4的第3-953位；或
步骤(1)中，所述poxB基因的核苷酸序列为序列表中序列18所示；所述lldD基因的核苷酸序列为序列表中序列5；所述adheE基因的核苷酸序列为序列表中序列6；所述ackA-pta基因的核苷酸序列为序列表中序列7；或
步骤(2)中，所述ldhA基因的核苷酸序列为序列表中序列8；所述dld基因的核苷酸序列为序列表中序列9。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，
所述大肠杆菌BW25113-ΔpoxB是按照包括如下步骤的方法获得的：向含有pKD46质粒的所述大肠杆菌BW25113野生型的感受态中转入序列表中序列17所示的DNA片段17，所述DNA片段17与所述大肠杆菌BW25113野生型的基因组发生同源重组，即实现敲除所述大肠杆菌BW25113野生型的所述poxB基因，获得所述大肠杆菌BW25113-ΔpoxB；
将所述大肠杆菌BW25113-△poxB中的所述lldD基因替换为所述3-羟基丙酸脱氢酶的编码基因，是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述大肠杆菌BW25113-△poxB的感受态中转入序列表中序列1所示的DNA片段1，所述DNA片段1与所述大肠杆菌BW25113-△poxB的基因组发生同源重组，即实现将所述lldD基因替换为所述3-羟基丙酸脱氢酶的编码基因；
将所述大肠杆菌BW25113-△poxB中的所述adheE基因替换为辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因，是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述大肠杆菌BW25113-△poxB的感受态中转入序列表中序列2所示的DNA片段2，所述DNA片段2与所述大肠杆菌BW25113-△poxB的基因组发生同源重组，即实现将所述adheE基因替换为所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因；
将所述大肠杆菌BW25113-△poxB中的所述ackA-pta基因替换为丙酰辅酶A转移酶的编码基因，是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述大肠杆菌BW25113-△poxB的感受态中转入序列表中序列3所示的DNA片段3，所述DNA片段3与所述大肠杆菌BW25113-△poxB的基因组发生同源重组，即实现将所述ackA-pta基因替换为所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，敲除所述BWPDO1的所述ldhA基因，是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述BWPDO1的感受态中转入序列表中序列10所示的DNA片段10，所述DNA片段10与所述BWPDO1的基因组发生同源重组，即实现敲除所述BWPDO1的所述ldhA基因；
敲除所述BWPDO1的所述dld基因，是通过如下方法实现的：向含有pKD46质粒的所述BWPDO1的感受态中转入序列表中序列11所示的DNA片段11，所述DNA片段11与所述BWPDO1的基因组发生同源重组，即实现敲除所述BWPDO1的所述dld基因。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述丙酮酸脱羧酶的编码基因和所述NAD依赖型乙醛辅酶A脱氢酶的编码基因是通过重组表达载体的形式导入所述BWPDO2中的；
所述重组表达载体具体为将序列表中序列4所示DNA片段***到pBAD43载体的多克隆位点后得到的重组质粒。
8.利用权利要求1-7中任一所述方法制备得到的所述重组大肠杆菌A或所述重组大肠杆菌B。
9.权利要求8所述重组大肠杆菌A或所述重组大肠杆菌B在利用L-乳酸或其盐合成S-1,2-丙二醇中的应用。
10.利用L-乳酸或其盐合成S-1,2-丙二醇的方法，为如下(A)或(B)：
(A)包括如下步骤：向所述重组大肠杆菌B的培养体系中加入终浓度为200mM的L-乳酸或其盐作为底物，于37℃进行发酵培养，从培养液中获得S-1,2-丙二醇；
(B)向所述重组大肠杆菌A的培养体系中加入终浓度为200mM的L-乳酸或其盐作为底物，于37℃培养至OD600至0.6-0.8之间，加入终浓度为2g/L的L-***糖作为诱导剂，于37℃进行发酵培养，从培养液中获得S-1,2-丙二醇。
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