CN114410564A - 一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株及生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于5‑氨基乙酰丙酸生产的菌株,所述菌株进行基因表达抑制;所述抑制的基因为hemF、ybdK、gadB、gadA、mppA或dppA的任一种或几种组合。本发明获得菌株可高量生产5‑氨基乙酰丙酸,最高能使5‑氨基乙酰丙酸产量较原菌株提高2.42倍。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株及生产方法。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,简称5-ALA),分子式C5H9NO3,分子量131.13,是一种两边分别有氨基和羧基的δ型-氨基酸。5-ALA 是四氢吡咯 (四氢吡咯是构成血红素、细胞色素、维生素B12的物质) 的前缀化合物,也是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B12等必不可少的物质,通常以盐酸盐的形式保存并被广泛应用到各个领域。
5-ALA存在于动物、植物以及微生物细胞中,广泛应用于医药、化妆品、农药、肥料、动物饲料以及微生物培养等领域,在生命过程中发挥着重要的作用,因此具有广阔的应用前景和市场开发前景,已经引起国内外学者及业界的广泛关注。
作为一种具有极大潜能的化学物质,其合成同样备受关注。目前主要有化学合成与生物合成两个途径来进行5-ALA的生产。化学合成反应步骤多、副产物多、分离提纯难、ALA的得率低以及环境污染严重等问题,生物法合成ALA已成为未来研究发展的趋势,随着生物技术的进步,应用微生物生产ALA 逐渐为人们所关注。自然界中许多生物可以合成ALA,但这些天然宿主的生产效率并不能让人们满意。
因此本发明尝试将外源基因导入工程菌,并不断对微生物合成5-ALA产量进行着优化,本发明通过应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,对菌株BW25113菌株进行基因编辑,***T7 RNA聚合酶(T7 RNA Polymerase,缩写为T7 RNAP)基因,使得该菌株可以应用T7表达***;再对BW25113-T7菌株进行代谢通路改造,使其更适合用于5-ALA生产。
发明内容
本发明公开一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株,所述菌株进行基因表达抑制;所述抑制的基因为hemF、ybdK、gadB、gadA、mppA或dppA的任一种或几种组合。
在一些实施方式中,在大肠杆菌基因组中***T7 RNAP基因,获得含T7表达***的菌株;优选地,所述大肠杆菌为BW25113或MG1655。
在一些实施方式中,所述T7 RNAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明选择以大肠杆菌作为底盘菌,其具有生长速度快、遗传信息明确等优势,较适合用于代谢工程。但大部分野生型大肠杆菌无法应用T7表达***,因为其基因组上缺少T7 RNAP。而诱导T7表达***的T7 RNAP具有超强的启动其他基因转录的功能,并具有如下优点:T7 RNAP能特异性地识别T7启动子,开启下游基因的转录;T7 mRNA比较稳定;T7 mRNA具有较强的翻译信号。T7表达***能够转录大肠杆菌中的几乎任何基因或其互补序列,但要求大肠杆菌中存在T7 RNAP基因。而部分代谢工程菌株(如MG1655、BW25113等)的基因组中缺少该基因,无法应用T7表达***进行异源蛋白表达。本发明通过将T7 RNAP基因***该菌株的基因组中,使得T7表达***能够在该菌株中得以应用。
为了提高5-ALA的产量,使获得的含T7表达***的大肠菌株更加特化、适合于ALA生产,本发明对BW25113-T7菌株进行代谢通路改造,在BW25113-T7上抑制1-6个基因的表达,所述基因分别是hemF、ybdk、gadB、gadA、mppA或dppA。
在一些实施方式中,所述基因hemF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,所述ybdK的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;所述gadB的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;所述gadA的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示;所述mppA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示;所述dppA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在一些实施方式中,所述菌株基因表达抑制和在大肠杆菌基因组中***T7 RNAP基因采用规律成簇的间隔短回文重复与Cas9核酸内切酶组合(CRISPR/Cas9,ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技术或基因重组技术。
在一些实施方式中,所述菌株基因表达抑制和在大肠杆菌基因组中***T7 RNAP基因也可以利用CRISPR/Cas9技术对目的基因的活性进行编辑,在将所需编辑的基因启动子进行替换或删除,从而使该基因的表达发生正向(强化表达)或逆向(抑制表达)的效果。
在一些实施方式中,所述菌株基因表达抑制和在大肠杆菌基因组中***T7 RNAP基因也可以利用CRISPR技术编辑启动子来弱化基因表达,对基因进行抑制。
在一些实施方式中,所述大肠杆菌基因组中***T7 RNAP基因的具体步骤如下:
(1)将大肠杆菌BW25113基因组上的ybhC片段扩增,并将其连接于pACYCD骨架上,得到pACYCD-ybhC质粒;所述ybhC片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述ybhC的连接位点为pACYCD骨架上的p15a ori与CmR;
(2)扩增 T7 RNAP基因,同时利用反向PCR将pACYCD-ybhC质粒线性化,留下HRL+ori+Cmr+HRR部分,将二者进行连接,得到pACYCD-Donor-T7质粒;
(3)将pACYCD-Donor-T7上的HRL+T7 RNAP+HRR部分扩增,得到Donor DNA-ybhC;所述Donor DNA-ybhC的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
(4)将pTarget-N20载体上的N20片段替换为ybhC的N20片段,获得pTarget-N20-ybhC载体;N20-ybhC核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;
(5)将pTarget-N20-ybhC载体与Donor DNA-ybhC一同进行基因打靶,获得BW25113-T7。
在一些实施方式中,所述基因表达抑制的方法如下:
(1)将大肠杆菌BW25113基因组上的目标基因Gene片段扩增,并将其连接于pACYCD骨架上,得到pACYCD-Gene质粒;所述Gene的连接位点为pACYCD骨架上的p15a ori与CmR;
(2)利用反向PCR将pACYCD-Gene质粒线性化,留下HRL+ori+Cmr+HRR部分,将其与Gene进行连接,得到pACYCD-Donor-Gene质粒;
(3)将pACYCD-Donor-Gene上的HRL+Gene +HRR部分扩增,得到Donor DNA-Gene;
(4)将pTarget-N20载体上的N20片段替换为Gene的N20片段,获得pTarget-N20-Gene载体;
(5)将pTarget-N20-Gene载体与Donor DNA-Gene一同进行基因打靶,获得BW25113-T7-Gene;
所述抑制基因表达为抑制hemF、ybdK 、gadB、gadA、mppA或dppA的任一种或几种基因表达的组合。
在一些实施方式中,当抑制基因表达为抑制两种或两种以上基因组合表达时,所述步骤如下:(1)上述步骤抑制第一个目的基因的表达,获得菌株BW25113-T7-Gene1;(2)以pACYCD-Gene1质粒为骨架,上述步骤(2)抑制第二个目的基因的表达,获得菌株BW25113-T7-Gene1-Gene2;(3)以pACYCD- Gene1-Gene2质粒为骨架,重复上述步骤(2)抑制多个目的基因的表达,获得菌株BW25113-T7-Gene1-Gene2-GeneN;所述Gene1、Gene2、GeneN为抑制的目的基因。
在一些实施方式中,所述抑制目标基因为hemF与ybdK基因组合抑制,或hemF与gadB基因组合抑制,或hemF与gadA基因组合抑制。
在一些实施方式中,所述抑制目标基因为hemF、ybdK与gadA基因组合抑制,或hemF、ybdK与gadB基因组合抑制,或hemF、gadA与gadB基因组合抑制。
在一些实施方式中,所述抑制目标基因为hemF、ybdK、gadA与gadB基因组合抑制。
在一些实施方式中,所述抑制目标基因为hemF、ybdK、gadA、gadB与mppA基因连接,或hemF、ybdK、gadA、gadB与dppA基因组合抑制。
在一些实施方式中,所述抑制目标基因为hemF、ybdK、gadA、gadB、mppA与dppA基因组合抑制。
本发明还提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的方法,将过表达hemA、hemL、eamA的质粒pET28b-ALA-LAA分别转入上述改造菌株中,培养所述菌株,从该发酵培养体系中收获5-氨基乙酰丙酸,得到5-氨基乙酰丙酸。
所述培养选用的培养基碳源为葡萄糖。
本发明选择过表达hemA、hemL、eamA的质粒pET28b-ALA-LAA转入改造菌株中,将葡萄糖作为基础培养基的碳源,在大肠杆菌体内通过三羧酸循环转化为谷氨酸,以谷氨酸为底物,通过hemA和hemL分别表达谷氨酸-tRNA还原酶和GSA转氨酶两个合成酶,将谷氨酸进一步转化为5-ALA;利用eamA基因表达出转运蛋白,将ALA从大肠杆菌体内转移至胞外,从而获得5-ALA。
本发明获得菌株可高量生产5-氨基乙酰丙酸,最高能使5-ALA产量较原BW25113-T7菌株提高2.42倍。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1. ybhC基因***BW25113菌株的位置。
图2. T7 RNAP基因敲入BW25113菌株的示意图。
图3. BW25113***T7 RNAP基因后的基因组。
图4. 三种菌株的生长曲线。
图5. 5-ALA生产路线示意图。
图6. 5-ALA产量结果。
图7. 不同基因抑制的改造菌株的5-ALA产量变化(以原始菌株作为对照)。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。所述方法如无特别说明均为常规方法,所述原料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
主要实验材料和试剂配制
BW25113菌株购自:北京启航立业科技有限公司
BL21(DE3)菌株购自:北京全式金生物技术 (TransGen Biotech) 股份有限公司
质粒pACYCD-Blank购自:北京启航立业科技有限公司
实施例1、BW25113-T7的构建
1、实验设计
通过NCBI以及BioCyc确认序列后,将BW25113菌株的ybhC基因中***T7 RNAP基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示),***位点见图1,N20:gctgacgattcgtttccaga。BW25113-T7构建示意图见图2,预计***后基因组变为图3所示。
引物列表见表1。
表1. 引物列表
2、BW25113-T7的构建过程
BW25113-T7的具体构建过程如下:
(1)获取重组质粒pACYCD-ybhC
以大肠杆菌BW25113为模板,以引物Primer ybhC-F和Primer ybhC-R,进行PCR扩增,获得一条带有目的基因sgRNA识别位点的937 bp的ybhC基因编码区的DNA片段(ybhC,核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示));以质粒pACYCD-Blank为模板,以引物Primer F1和PrimerR1,进行PCR扩增,获得一条带有CmR氯霉素抗性基因与p15a转录起始位点的2065bp的DNA片段(L-ACYCD,核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。
PCR扩增体系为:99 uL ddH2O,30 uL Q5 Reaction Buffer,引物各7.5 uL,1.25uL 25mM dNTP,1.5 uL Q5 DNA Polymerase, 30~100 ng 模板。
PCR扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
将上述两条DNA片段(ybhC和L-ACYCD)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收,之后进行In-Fusion连接。In-Fusion连接体系为:200 ng 片段ybhC,200 ng片段L-ACYCD,1 uL 5× In-Fusion HD Enzyme Premix,用ddH2O补齐至5 uL。连接反应程序为:50℃ 15 min。反应结束后,将连接产物转化DH5α,长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pACYCD-ybhC,该重组载体上含有氯霉素抗性标记。
所述重组载体pACYCD-ybhC是将pACYCD-Blank载体上的p15a ori与CmR之间***了ybhC片段后,载体的其他序列不变,得到的重组载体。
所述重组载体pACYCD-ybhC含有BW25113的ybhC基因的第318-1255位共计937 bp的DNA分子。
(2)获取重组质粒pACYCD-Donor
以大肠杆菌BL21为模板,以引物Primer RNAP-F和Primer RNAP-R,进行PCR扩增,获得一条带有所需***基因T7 RNA聚合酶的4488 bp的DNA片段(T7RNAP,核苷酸序列如SEQID NO.1所示);以质粒pACYCD-ybhC为模板,以引物Primer F2和Primer R2,进行PCR扩增,获得一条带有氯霉素抗性基因、p15a转录起始位点、ybhC的左半部分(HRL)和ybhC的右半部分(HRR)的2866 bp的HRL+ori+Cmr+HRR的DNA片段(L-ybhC,核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。
PCR扩增体系为:99 uL ddH2O,30 uL Q5 Reaction Buffer,引物各7.5 uL,1.25uL 25mM dNTP,1.5 uL Q5 DNA Polymerase,30-100 ng 模板。
PCR扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
将上述两条DNA片段(T7RNAP和L-yhbC)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收,之后进行In-Fusion连接。In-Fusion连接体系为:200 ng 片段ybhC,200 ng片段L-ACYCD,1 uL 5× In-Fusion HD Enzyme Premix,用ddH2O补齐至5 uL。连接反应程序为:50℃ 15 min。反应结束后,将连接产物转化DH5α,长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pACYCD-Donor-T7,该重组载体上含有氯霉素抗性标记。
所述重组载体pACYCD-Donor-T7是将pACYCD-ybhC载体上的HRL与HRR之间***了T7RNAP片段后并缺失了基因sgRNA识别位点N20附近100bp,载体的其他序列不变,得到的重组载体。
所述重组载体pACYCD-Donor-T7含有的BW25113的ybhC基因的HRL(417 bp)、BL21的T7RNAP基因(4488 bp)和BW25113的ybhC基因的HRR(401 bp)。
(3)获取Donor DNA-ybhC
以质粒pACYCD-Donor-T7为模板,以引物Primer Donor-F和Primer Donor-R,进行PCR扩增,获得一条含有BW25113的ybhC基因的HRL(417 bp)、BL21的T7RNAP基因(4488 bp)和BW25113的ybhC基因的HRR(401 bp)的5306 bp的DNA片段(Donor DNA-ybhC,核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)。
PCR扩增体系为:99 uL ddH2O,30 uL Q5 Reaction Buffer,引物各7.5 uL,1.25uL 25mM dNTP,1.5 uL Q5 DNA Polymerase, 30~100 ng 模板。
PCR扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
将该DNA片段(Donor DNA-ybhC)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收。
(4)获取重组质粒pTarget-N20-ybhC
以质粒pTarget-N20为模板,以引物Primer N20-F、Primer N20-R,进行PCR扩增,获得一条含有p15a ori、氯霉素抗性基因CmR、Cas9-sgRNA-N20-ybhC的2554 bp的DNA片段(N20-ybhC,核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示),其中引物Primer N20-F进行了5‘端磷酸化修饰。
PCR扩增体系为:99 uL ddH2O,30 uL Q5 Reaction Buffer,引物各7.5 uL,1.25uL 25mM dNTP,1.5 uL Q5 DNA Polymerase,30~100 ng 模板。
PCR扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
将该DNA片段(N20-ybhC)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收,之后进行T4 Ligase连接。连接体系为:200 ng 片段N20-ybhC,1 uL T4 Ligase, 1 ul 10×T4 Reaction Buffer,用ddH2O补齐至10 uL。连接反应程序为:16 ℃ 12h。反应结束后,将连接产物转化DH5α,长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pTarget-N20-ybhC,该重组载体上含有氯霉素抗性标记。
所述重组载体pTarget-N20-ybhC是将pTarget-N20载体上的N20片段替换为了目的基因sgRNA识别位点的片段(ybhC的N20片段:gctgacgattcgtttccaga)载体的其他序列不变,得到的重组载体。
所述重组载体pTarget-N20-ybhC含有的p15a ori、氯霉素抗性基因CmR、sgRNA,其中sgRNA包括PAM(NGG)+crRNA(含ybhC序列N20)+tracrRNA(与cas9蛋白结合)。
(5)基因打靶
制备含pCAS菌株的电转感受态细胞。将含有pCas的目标菌株30 ℃过夜活化(LB+Kan 25 ug/ml),次日取0.2 ml转接到100 ml LB(+kan 25 ug/ml,+10 mM Arabinose)中,30 ℃培养至OD600≈0.5左右离心收集菌体,制备电转感受态细胞。
转化pTarget-N20-ybhC质粒和Donor DNA-ybhC至含有pCas9的目标菌株中,每50ul感受态细胞中,加入N20-Target质粒约100 ng,同时加donor DNA 约400 ng(二者总体积不要超过15ul为宜),电转条件:2.5k v,5ms;向电转后的细胞中加入900 ul SOC或LB,30℃220rpm复苏培养1 h,然后涂布在加了两种抗性(kan 25 ug/ml, Chl 50 ug/ml)的LB平板上, 30℃过夜培养。
电转次日,挑取单克隆,以引物Primer Seq-F (gctcttacttcttcgcctctgc)和Primer Seq-R (tacccacgccgcggttattg),以挑取的单克隆作为模板,进行PCR扩增验证。Primer Seq-F 位于BW25113的ybhC基因的下游(1267–1288 bp),Primer Seq-R位于BW25113的ybhC基因的上游(261-282 bp)。若基因成功***,则扩增的片段为5kb左右。经过菌落PCR确定挑出阳性单克隆,将该菌作为后续代谢改造的底盘菌,并命名为BW25113-T7(D0)。
实施例2、BW25113-T7的性状以及利用该菌株进行5-ALA的生产
1、BW25113-T7菌株的生长性状测试
测定菌株BW25113-T7的生长性状,BW25113和BL21(DE3)菌株作为对照,结果见图4,其中,M9和LB为标准培养基,M9YE为在M9的基础上额外添加至10 g/L的葡萄糖和4 g/L的酵母提取物,结果显示BW25113-T7菌株与原始菌株相比几乎没有生长性状上的差异,较BL21(DE3)菌株相比,在丰富培养基中具有更大的生长速度优势。
2、利用BW25113-T7进行5-ALA生物合成
利用BW25113-T7进行5-ALA生物合成,生产路线示意图见图5,5-ALA产量结果见图6。图6结果显示,在将T7聚合酶导入BW25113后,其用T7表达***进行5-ALA代谢合成的效率与BL21(DE3)接近。并且,在额外过表达外排蛋白eamA后,其产量提升的幅度较BL21(DE3)更大。
实施例3、BW25113-T7菌株的代谢通路改造
为了提高5-ALA的产量,使BW25113-T7菌株更加特化、适合于5-ALA生产,对BW25113-T7菌株进行代谢通路改造。
1、实验设计
计划在BW25113-T7上抑制6个基因的表达,分别是hemF(核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示)、ybdk(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)、gadB(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)、gadA(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)、mppA(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)、dppA(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)。其中,对上述基因进行一定的排列组合,确定不同基因抑制效果的叠加带来的5-ALA产量提升效果。
根据该方案,进行了以上基因改造,获得的改造菌株见表2。
表2 改造菌株列表
菌株 | 基因型 | 来源 |
<i>D0</i> | <i>BW25113-T7</i> | BW25113基因编辑获得 |
<i>D1:F</i> | <i>BW25113-T7 ΔhemF</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
<i>D1:M</i> | <i>BW25113-T7 ΔmppA</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
D1:D | <i>BW25113-T7 ΔdppA</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
D2:FY | <i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
D2:FA | <i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔgdhA</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
D2:FB | <i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔgadB</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
D3:FYA | <i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK, ΔgdhA</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
D3:FYB | <i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK, ΔgadB</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
D3:FAB | <i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔgdhA, ΔgadB</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
D4:FYAB | <i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK, ΔgdhA, ΔgadB</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
D5:FYABM | <i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK, ΔgdhA, ΔgadB, ΔmppA</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
D5:FYABD | <i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK, ΔgdhA, ΔgadB, ΔdppA</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
D6:FYABMD | <i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK, ΔgdhA, ΔgadB, ΔmppA, ΔdppA</i> | BW25113-T7(D0)基因编辑获得 |
具体实验步骤见下(以hemF基因抑制为例),引物列表见表3,加粗部分代表为In-Fusion连接设计的同源片段,灰色阴影部分表示sgRNA识别位点的N20。
表3.引物列表
Primer名称 | 序列(5'to3') | 碱基数 |
ACYCD-hemF-F | gcgagcgcaatttccctgccattcatccgcttattatc | 38 |
ACYCD-hemF-R | tgcggctgtgcagttcctggcgttacccaacttaa | 35 |
HRL-hemF-F | aactgcacagccgcaacac | 19 |
HRR-hemF-R | ggaaattgcgctcgcgct | 18 |
HRL-hemF-R | cccgtatgttcccaccagc | 19 |
HRR-hemF-F | gcctgcctgttcgaaaacac | 20 |
N20argI-s | gttttagagctagaaatagcaagttaaaat | 30 |
N20-hemF | ctcatcgcccggaacttgccactagtattatacctaggactga | 43 |
Test-hemF-F | tgacgctcggctcgcatatt | 20 |
Test-hemF-R | ccgcgatcccagaccagatt | 20 |
2、BW25113-T7菌株的代谢通路改造(以hemF基因抑制为例)
(1)获取重组质粒pACYCD-hemF
以大肠杆菌BW25113为模板,以引物HRL-hemF-F和HRR-hemF-R,进行PCR扩增,获得一条带有目的基因sgRNA识别位点的921 bp的hemF基因编码区的DNA片段(hemF,核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示);以质粒pACYCD-Blank为模板,以引物ACYCD-hemF-F和ACYCD-hemF-R,进行PCR扩增,获得一条带有CmR氯霉素抗性基因与p15a转录起始位点的2173 bp的DNA片段(ACYCD,核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)。
PCR扩增体系为:99 uL ddH2O,30 uL Q5 Reaction Buffer,引物各7.5 uL,1.25uL 25mM dNTP,1.5 uL Q5 DNA Polymerase, 30-100 ng 模板。
PCR扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
将上述两条DNA片段(hemF和ACYCD)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收,之后进行In-Fusion连接。In-Fusion连接体系为:200 ng 片段hemF,200 ng片段L-ACYCD,1 uL 5× In-Fusion HD Enzyme Premix,用ddH2O补齐至5 uL。连接反应程序为:50℃ 15 min。反应结束后,将连接产物转化DH5α,长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pACYCD-hemF,该重组载体上含有氯霉素抗性标记。
所述重组载体pACYCD-hemF是将pACYCD-Blank载体上的p15a ori与CmR之间***了hemF片段后,载体的其他序列不变,得到的重组载体。
所述重组载体pACYCD-hemF含有的BW25113的hemF基因的第-244至697位共计921bp的DNA分子。
(2)获取重组质粒pACYCD-Donor
以质粒pACYCD-hemF为模板,以引物HRL-hemF-R和HRR-hemF-F,进行PCR扩增,获得一条带有氯霉素抗性基因、p15a转录起始位点、hemF的左半部分(HRL)和hemF的右半部分(HRR)的3042bp的DNA片段(L-hemF,核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示),其中HRL-hemF-R引物进行5‘端磷酸化修饰。
PCR扩增体系为:99 uL ddH2O,30 uL Q5 Reaction Buffer,引物各7.5 uL,1.25uL 25mM dNTP,1.5 uL Q5 DNA Polymerase, 30~100 ng 模板。
PCR扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
将该DNA片段(L-hemF)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收,之后进行T4 Ligase连接。连接体系为:200 ng 片段L-hemF,1 uL T4 Ligase, 1 ul 10× T4Reaction Buffer,用ddH2O补齐至10 uL。连接反应程序为:16℃ 12h。反应结束后,将连接产物转化DH5α,长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pACYCD-Donor-hemF,该重组载体上含有氯霉素抗性标记。所述重组载体pACYCD-Donor-hemF是将pACYCD-hemF载体上的HRL与HRR之间缺失了基因sgRNA识别位点N20附近100bp,载体的其他序列不变,得到的重组载体。
所述重组载体pACYCD-Donor-hemF含有的BW25113的hemF基因的HRL(401 bp)、HRR(401 bp)。
(3)获取Donor DNA-hemF
以质粒pACYCD-Donor-hemF为模板,以引物HRL-hem-F和HRR-hemF-R,进行PCR扩增,获得一条含有BW25113的hemF基因的HRL(401 bp)和HRR(401 bp)的802bp的DNA片段(Donor DNA-hemF,核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)。
PCR扩增体系为:99 uL ddH2O,30 uL Q5 Reaction Buffer,引物各7.5 uL,1.25uL 25mM dNTP,1.5 uL Q5 DNA Polymerase, 30-100 ng 模板。
PCR扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
将该DNA片段(Donor DNA-hemF)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收。
(4)获取重组质粒pTarget-N20-hemF
以质粒pTarget-N20为模板,以引物N20-argI-s、N20-hemF,进行PCR扩增,获得一条含有p15a ori、氯霉素抗性基因CmR、Cas9-sgRNA-N20-hemF的2554 bp的DNA片段(N20-hemF,核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示),其中N20-argI-s引物进行了5‘端磷酸化修饰。
PCR扩增体系为:99 uL ddH2O,30 uL Q5 Reaction Buffer,引物各7.5 uL,1.25uL 25mM dNTP,1.5 uL Q5 DNA Polymerase, 30~100 ng 模板。
PCR扩增反应程序为:98 ℃预变性1 min,(98 ℃变性15 s;68 ℃退火30 s;72 ℃延伸15 s/kb;30个循环),72 ℃过度延伸10 min。
将该DNA片段(N20-hemF)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,对目的条带进行回收,之后进行T4 Ligase连接。连接体系为:200 ng 片段N20-hemF,1 uL T4 Ligase, 1 ul 10×T4 Reaction Buffer,用ddH2O补齐至10 uL。连接反应程序为:16℃ 12h。反应结束后,将连接产物转化DH5α,长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pTarget-N20-hemF,该重组载体上含有氯霉素抗性标记。
所述重组载体pTarget-N20-hemF是将pTarget-N20载体上的N20片段替换为了目的基因sgRNA识别位点的片段(hemF的N20片段:GGCAAGTTCCGGGCGATGAG)载体的其他序列不变,得到的重组载体。
所述重组载体pTarget-N20-hemF含有的p15a ori、氯霉素抗性基因CmR、sgRNA,其中sgRNA包括PAM(NGG)+crRNA(含hemF序列N20)+tracrRNA(与cas9蛋白结合)。
(5)基因打靶
制备含pCAS菌株的电转感受态细胞。将含有pCas的目标菌株30℃过夜活化(LB+Kan 25 ug/ml),次日取0.2 ml转接到100 ml LB(+kan 25 ug/ml,+10 mM Arabinose)中,30℃培养至OD600≈0.5左右离心收集菌体,制备电转感受态细胞。
转化pTarget-N20-hemF质粒和Donor DNA-hemF至含有pCas9的目标菌株中,每50ul感受态细胞中,加入N20-Target质粒约100 ng,同时加donor DNA 约400 ng(二者总体积不要超过15 ul为宜),电转条件:2.5 kv,5 ms;向电转后的细胞中加入900 ul SOC或LB,30℃ 220 rpm复苏培养1 h,然后涂布在加了两种抗性(kan 25 ug/ml, Chl 50 ug/ml)的LB平板上, 30℃过夜培养。
电转次日,挑取单克隆,以引物Test-hemF-F和Test-hemF-R,以挑取的单克隆作为模板,进行PCR扩增验证。若基因成功被抑制,则扩增的片段为900 bp左右;而原始菌株的扩增片段为1 kb左右。经过菌落PCR确定挑出阳性单克隆,并命名为D1:F。
D2:FY的构建则是在D1:F的基础上进一步抑制基因ybdK;其余构建菌株同理,D6:FYABMD则是将hemF、ybdK、gdhA、gadB、mppA和dppA这六个基因叠加抑制获得。
将过表达hemA、hemL、eamA的质粒pET28b-ALA-LAA(核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示)分别转入这些改造菌株中,培养所述菌株,从该发酵培养体系中收获5-氨基乙酰丙酸,从而得到5-氨基乙酰丙酸并分别检测每个改造菌株的5-ALA产量。
改造菌株的5-ALA产量相对变化见图7与表4。
表4.不同基因抑制的改造菌株的ALA产量变化(以原始菌株作为对照)
菌株 | ALA产量相对变化 |
D0 | 1.00 |
D1:F | 2.06 |
D1:D | 1.28 |
D1:M | 0.91 |
D2:FY | 1.93 |
D2:FA | 1.68 |
D2:FB | 1.65 |
D3:FYA | 2.23 |
D3:FYB | 2.30 |
D3:FAB | 2.03 |
D4:FYAB | 2.17 |
D5:FYABD | 2.42 |
D5:FYABM | 1.93 |
D6:FYABMD | 1.53 |
由表4可以看到,基因hemF、ybdK 、gadB、gadA、mppA、dppA的抑制可以均能给5-ALA的产量带来较为明显的提升;dppA的单基因抑制可以提高5-ALA产量约1.28倍,hemF的单基因抑制可以提高5-ALA产量约2.06倍;在多个基因抑制中,多基因抑制株D5:FYABD有着更高的5-ALA产量,可以提高5-ALA产量约2.42倍。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株及生产方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4479
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacaccatcg aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc ggaagagagt 60
caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga gtatgccggt 120
gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc tgcgaaaacg 180
cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg cgtggcacaa 240
caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct ggccctgcac 300
gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg tgccagcgtg 360
gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt gcacaatctt 420
ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca ggatgccatt 480
gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca 540
cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt ggagcatctg 600
gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc tgtctcggcg 660
cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg 720
gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca aatgctgaat 780
gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg 840
cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata tctcggtagt gggatacgac 900
gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca ccatcaaaca ggattttcgc 960
ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct ctcagggcca ggcggtgaag 1020
ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg 1080
caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 1140
cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta agttagctca ctcattaggc 1200
accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata 1260
acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgga ttcactggcc gtcgttttac 1320
aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc 1380
ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 1440
gcagcctgaa tggcgaatgg cgctttgcct ggtttccggc accagaagcg gtgccggaaa 1500
gctggctgga gtgcgatctt cctgaggccg atactgtcgt cgtcccctca aactggcaga 1560
tgcacggtta cgatgcgccc atctacacca acgtgaccta tcccattacg gtcaatccgc 1620
cgtttgttcc cacggagaat ccgacgggtt gttactcgct cacatttaat gttgatgaaa 1680
gctggctaca ggaaggccag acgcgaatta tttttgatgg cgtcgggatc tgatccggat 1740
ttactaactg gaagaggcac taaatgaaca cgattaacat cgctaagaac gacttctctg 1800
acatcgaact ggctgctatc ccgttcaaca ctctggctga ccattacggt gagcgtttag 1860
ctcgcgaaca gttggccctt gagcatgagt cttacgagat gggtgaagca cgcttccgca 1920
agatgtttga gcgtcaactt aaagctggtg aggttgcgga taacgctgcc gccaagcctc 1980
tcatcactac cctactccct aagatgattg cacgcatcaa cgactggttt gaggaagtga 2040
aagctaagcg cggcaagcgc ccgacagcct tccagttcct gcaagaaatc aagccggaag 2100
ccgtagcgta catcaccatt aagaccactc tggcttgcct aaccagtgct gacaatacaa 2160
ccgttcaggc tgtagcaagc gcaatcggtc gggccattga ggacgaggct cgcttcggtc 2220
gtatccgtga ccttgaagct aagcacttca agaaaaacgt tgaggaacaa ctcaacaagc 2280
gcgtagggca cgtctacaag aaagcattta tgcaagttgt cgaggctgac atgctctcta 2340
agggtctact cggtggcgag gcgtggtctt cgtggcataa ggaagactct attcatgtag 2400
gagtacgctg catcgagatg ctcattgagt caaccggaat ggttagctta caccgccaaa 2460
atgctggcgt agtaggtcaa gactctgaga ctatcgaact cgcacctgaa tacgctgagg 2520
ctatcgcaac ccgtgcaggt gcgctggctg gcatctctcc gatgttccaa ccttgcgtag 2580
ttcctcctaa gccgtggact ggcattactg gtggtggcta ttgggctaac ggtcgtcgtc 2640
ctctggcgct ggtgcgtact cacagtaaga aagcactgat gcgctacgaa gacgtttaca 2700
tgcctgaggt gtacaaagcg attaacattg cgcaaaacac cgcatggaaa atcaacaaga 2760
aagtcctagc ggtcgccaac gtaatcacca agtggaagca ttgtccggtc gaggacatcc 2820
ctgcgattga gcgtgaagaa ctcccgatga aaccggaaga catcgacatg aatcctgagg 2880
ctctcaccgc gtggaaacgt gctgccgctg ctgtgtaccg caaggacaag gctcgcaagt 2940
ctcgccgtat cagccttgag ttcatgcttg agcaagccaa taagtttgct aaccataagg 3000
ccatctggtt cccttacaac atggactggc gcggtcgtgt ttacgctgtg tcaatgttca 3060
acccgcaagg taacgatatg accaaaggac tgcttacgct ggcgaaaggt aaaccaatcg 3120
gtaaggaagg ttactactgg ctgaaaatcc acggtgcaaa ctgtgcgggt gtcgataagg 3180
ttccgttccc tgagcgcatc aagttcattg aggaaaacca cgagaacatc atggcttgcg 3240
ctaagtctcc actggagaac acttggtggg ctgagcaaga ttctccgttc tgcttccttg 3300
cgttctgctt tgagtacgct ggggtacagc accacggcct gagctataac tgctcccttc 3360
cgctggcgtt tgacgggtct tgctctggca tccagcactt ctccgcgatg ctccgagatg 3420
aggtaggtgg tcgcgcggtt aacttgcttc ctagtgaaac cgttcaggac atctacggga 3480
ttgttgctaa gaaagtcaac gagattctac aagcagacgc aatcaatggg accgataacg 3540
aagtagttac cgtgaccgat gagaacactg gtgaaatctc tgagaaagtc aagctgggca 3600
ctaaggcact ggctggtcaa tggctggctt acggtgttac tcgcagtgtg actaagcgtt 3660
cagtcatgac gctggcttac gggtccaaag agttcggctt ccgtcaacaa gtgctggaag 3720
ataccattca gccagctatt gattccggca agggtctgat gttcactcag ccgaatcagg 3780
ctgctggata catggctaag ctgatttggg aatctgtgag cgtgacggtg gtagctgcgg 3840
ttgaagcaat gaactggctt aagtctgctg ctaagctgct ggctgctgag gtcaaagata 3900
agaagactgg agagattctt cgcaagcgtt gcgctgtgca ttgggtaact cctgatggtt 3960
tccctgtgtg gcaggaatac aagaagccta ttcagacgcg cttgaacctg atgttcctcg 4020
gtcagttccg cttacagcct accattaaca ccaacaaaga tagcgagatt gatgcacaca 4080
aacaggagtc tggtatcgct cctaactttg tacacagcca agacggtagc caccttcgta 4140
agactgtagt gtgggcacac gagaagtacg gaatcgaatc ttttgcactg attcacgact 4200
ccttcggtac cattccggct gacgctgcga acctgttcaa agcagtgcgc gaaactatgg 4260
ttgacacata tgagtcttgt gatgtactgg ctgatttcta cgaccagttc gctgaccagt 4320
tgcacgagtc tcaattggac aaaatgccag cacttccggc taaaggtaac ttgaacctcc 4380
gtgacatctt agagtcggac ttcgcgttcg cgtaacgcca aatcaatacg actccggatc 4440
cccttcgaag gaaagacctg atgcttttcg tgcgcgcat 4479
<210> 2
<211> 937
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacccacgcc gcggttattg tattcccaca tgcggttgta gttagtgtca ttcagattgc 60
gctgtatttc gtcgttatca tctacgctgc cggtattacc cgcaaacgga cgattagaga 120
tcaccgcatc ggcccacggt ttagccgtgt taaaaccttc gttgatggcg ctatcacgga 180
tcaccacctg accgttggta ttggcatcaa catccagcga gcggcccagt tgcgccacac 240
catcaccgaa agcattgaaa cggctgttta cggcgaggaa accgtagtaa atgttggaca 300
gcgtagccgg tgcaaacaca tacgcttctt gctgagtacg tgagttcacc acgcggaatt 360
cggtgttatc gaacaccact gcgccgcgac cagaaacgat atccacatcc ccttcaatgt 420
agctgttggt caccagcgta cgcggctgac gattcgtttc cagacggttc tgcacaccgc 480
tgttggtgac aaagaaggtg ttctgacgac cgagaatgtt aacgttgtta atctgtacct 540
ggtcaccatc agtacgcagt gccaccgccg gatggttacc tgcatctacg ctatcgccca 600
gcgtgttttc gatggtcaga ttttgcagtt gcaggccatt gttttgtgac cagaagaccg 660
cagagcagag aacaccgata ctgtcgctgc gtttgctctg gcagctatcg tacatatacc 720
acgctggttt acctggcata tatttgccgc gcgggttgac gtcgtgacgc cagtcggcag 780
ggctcatgcc accatcaagg gaaagcccaa tcttcacatc aatcggtttt tcacctgtac 840
cgtacagagt aattccaccc ggagcggcag ggacatatac cgttccctga tactcaccag 900
gcatcacggc aatatactgg cgcttgttgg tacgctt 937
<210> 3
<211> 2064
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttgttggta cgcttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc gtagcaccag 60
gcgtttaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc 120
agtactgttg taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacag acggcatgat 180
gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatag 240
tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac 300
tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg 360
ccaggttttc accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat 420
cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt 480
aacaagggtg aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaact 540
ccggatgagc attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct 600
tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg 660
tacattgagc aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat tgggatatat 720
caacggtggt atatccagtg atttttttct ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc 780
tcgataactc aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc attatggtga aagttggaac 840
ctcttacgtg ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt ggcccagggc ttcccggtat 900
caacagggac accaggattt atttattctg cgaagtgatc ttccgtcaca ggtatttatt 960
cggcgcaaag tgcgtcgggt gatgctgcca acttactgat ttagtgtatg atggtgtttt 1020
tgaggtgctc cagtggcttc tgtttctatc agctgtccct cctgttcagc tactgacggg 1080
gtggtgcgta acggcaaaag caccgccgga catcagcgct agcggagtgt atactggctt 1140
actatgttgg cactgatgag ggtgtcagtg aagtgcttca tgtggcagga gaaaaaaggc 1200
tgcaccggtg cgtcagcaga atatgtgata caggatatat tccgcttcct cgctcactga 1260
ctcgctacgc tcggtcgttc gactgcggcg agcggaaatg gcttacgaac ggggcggaga 1320
tttcctggaa gatgccagga agatacttaa cagggaagtg agagggccgc ggcaaagccg 1380
tttttccata ggctccgccc ccctgacaag catcacgaaa tctgacgctc aaatcagtgg 1440
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc ccctggcggc tccctcgtgc 1500
gctctcctgt tcctgccttt cggtttaccg gtgtcattcc gctgttatgg ccgcgtttgt 1560
ctcattccac gcctgacact cagttccggg taggcagttc gctccaagct ggactgtatg 1620
cacgaacccc ccgttcagtc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 1680
aacccggaaa gacatgcaaa agcaccactg gcagcagcca ctggtaattg atttagagga 1740
gttagtcttg aagtcatgcg ccggttaagg ctaaactgaa aggacaagtt ttggtgactg 1800
cgctcctcca agccagttac ctcggttcaa agagttggta gctcagagaa ccttcgaaaa 1860
accgccctgc aaggcggttt tttcgttttc agagcaagag attacgcgca gaccaaaacg 1920
atctcaagaa gatcatctta ttaatcagat aaaatatttc tagatttcag tgcaatttat 1980
ctcttcaaat gtagcacctg aagtcaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt 2040
aacgccaggt acccacgccg cggt 2064
<210> 4
<211> 2836
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccgtatgtt cccaccagcc acgcgaatgt gcggtttttt attgccgaaa aaccgggtgc 60
cgatcccgtc tggtggtttg gcggtggctt cgacttaacc ccattctatg gttttgaaga 120
agatgctatt cactggcatc gcaccgcccg tgacctgtgc ctgccatttg gcgaagacgt 180
ttatccccgt tacaaaaagt ggtgcgacga atacttctac ctcaaacatc gcaacgaaca 240
gcgcggtatt ggcgggctgt tctttgatga cctgaacacg ccagatttcg accgctgttt 300
tgcctttatg caggcggtag gcaaaggcta caccgacgct tatttaccaa ttgtcgagcg 360
acggaaagcg atggcctacg gcgagcgcga gcgcaatttc cctgccattc atccgcttat 420
tatcacttat tcaggcgtag caccaggcgt ttaagggcac caataactgc cttaaaaaaa 480
ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac 540
atggaagcca tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc 600
gccttgcgta taatatttgc ccatagtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc 660
cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt 720
ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga 780
atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt 840
ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc 900
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tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca 1260
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acgaaatctg acgctcaaat cagtggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1860
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cattccgctg ttatggccgc gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg 1980
cagttcgctc caagctggac tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct 2040
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<400> 13
cttgttggta cgcttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc gtagcaccag 60
gcgtttaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc 120
agtactgttg taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacag acggcatgat 180
gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatag 240
tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac 300
tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg 360
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cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt 480
aacaagggtg aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaact 540
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tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg 660
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caacggtggt atatccagtg atttttttct ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc 780
tcgataactc aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc attatggtga aagttggaac 840
ctcttacgtg ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt ggcccagggc ttcccggtat 900
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tttttccata ggctccgccc ccctgacaag catcacgaaa tctgacgctc aaatcagtgg 1440
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ctcattccac gcctgacact cagttccggg taggcagttc gctccaagct ggactgtatg 1620
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aacgccaggt acccacgccg cggt 2064
<210> 14
<211> 2836
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccgtatgtt cccaccagcc acgcgaatgt gcggtttttt attgccgaaa aaccgggtgc 60
cgatcccgtc tggtggtttg gcggtggctt cgacttaacc ccattctatg gttttgaaga 120
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tatcacttat tcaggcgtag caccaggcgt ttaagggcac caataactgc cttaaaaaaa 480
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atggaagcca tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc 600
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<210> 15
<211> 802
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aactgcacag ccgcaacacc gaacaagcgg catttgtggt gttgaaatca ccgtcggttc 60
cttcggtgct ggtggaaacc tcgtttatca ccaacccgga agaagaacgg ctgttaggca 120
cggcggcgtt tcgtcagaaa atcgccacag cgattgctga aggcgtgatc agttatttcc 180
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cacgcgaatg tgcggttttt tattgccgaa aaaccgggtg ccgatcccgt ctggtggttt 480
ggcggtggct tcgacttaac cccattctat ggttttgaag aagatgctat tcactggcat 540
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<210> 16
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagtggcaa gttccgggcg atgaggtttt 60
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<210> 17
<211> 8629
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
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tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
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gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
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cgtttgagca atacccgcaa gagattgcct gtattatcgt cgagccggtg gcaggcaata 5700
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gtccggtcta tcaggcgggt acgctttccg gtaacccaat tgcgatggca gcgggtttcg 6000
cctgtctgaa tgaagtcgcg cagccgggcg ttcacgaaac gttggatgag ctgacatcac 6060
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atgtgatggc ctgtgacgtg gaacgcttta agcgtttctt ccatatgatg ctggacgaag 6240
gtgtttacct ggcaccgtca gcgtttgaag cgggctttat gtccgtggcg cacagcatgg 6300
aagatatcaa taacaccatc gatgctgcac gtcgggtgtt tgcgaagttg tgacaggagg 6360
aattaacatg acccttttag cactcggtat caaccataaa acggcacctg tatcgctgcg 6420
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cggtgccagc gctgtgtctg tcgcttttgc ggcttgtacg ctggcgcggc agatctttga 6900
atcgctctct acggtcacag tgttgctggt aggcgcgggc gaaaccatcg agctggtagc 6960
gcgtcatctg cgcgaacata aagtacagaa gatgattatc gccaaccgca ctcgcgaacg 7020
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cagtttgctt ttcttttttg tgccattaac ttcggtatgc ctgctggact ggcttcgctg 7920
gtgttacagg cacaggcgtt ttttactatc gtgcttggcg cgtttacttt cggtgagcga 7980
ctgcatggca aacaattggc ggggatcgcc ttagcgattt ttggcgtact ggtgttaatc 8040
gaagatagtc tgaacggtca gcatgtggcg atgctcggct ttatgttgac cctggcggca 8100
gcatttagtt gggcgtgtgg caacatcttc aataaaaaga tcatgtcgca ctcaacgcgt 8160
ccggcggtga tatcgctggt aatctggagc gctttaatcc caatcattcc cttctttgtt 8220
gcctcgctga ttctcgatgg ttccgcatcc atgattcaca gtctggttac tattgatatg 8280
accaccatct tgtcgctgat gtatctggcg tttgtggcga caattgttgg ttatgggatc 8340
tgggggacgt tactgggacg ctatgaaacc tggcgggttg caccgttatc gttactggtg 8400
cccgtagtcg gactggcaag tgcggcacta ttgttggatg aacgcttaac gggtctgcaa 8460
tttttaggtg cggtgctcat tatgaccggg ctgtatatca atgtatttgg cttgcggtgg 8520
cgtaaagcgg taaaggtggg aagttaagag caataactag cataacccct tggggcctct 8580
aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 8629
Claims (10)
1.一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株,其特征在于,所述菌株进行基因表达抑制;所述抑制的基因为hemF、ybdK 、gadB、gadA、mppA或dppA的任一种或几种组合。
2.根据权利要求1所述的菌株,其特征在于,所述菌株进行基因表达抑制前,在大肠杆菌基因组中***T7 RNAP基因,获得含T7表达***的菌株;
所述T7 RNAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的菌株,其特征在于,所述大肠杆菌为BW25113菌株或MG1655菌株。
4.根据权利要求1所述的菌株,其特征在于,所述基因hemF的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示;所述ybdK的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;所述gadB的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示;所述gadA的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示;所述mppA的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示;所述dppA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的菌株,其特种在于,所述抑制目标基因为hemF与ybdK基因组合抑制,或hemF与gadB基因组合抑制,或hemF与gadA基因组合抑制。
6.根据权利要求1-4任一项所述的菌株,其特种在于,所述抑制目标基因为hemF、ybdK与gadA基因组合抑制,或hemF、ybdK与gadB基因组合抑制,或hemF、gadA与gadB基因组合抑制。
7.根据权利要求1-4任一项所述的菌株,其特种在于,所述抑制目标基因为hemF、ybdK、gadA与gadB基因组合抑制。
8.根据权利要求1-4任一项所述的菌株,其特种在于,所述抑制目标基因为hemF、ybdK、gadA、gadB与mppA基因组合抑制,或hemF、ybdK、gadA、gadB与dppA基因组合抑制。
9.根据权利要求1-4任一项所述的菌株,其特种在于,所述抑制目标基因为hemF、ybdK、gadA、gadB、mppA与dppA基因组合抑制。
10.一种生产5-氨基乙酰丙酸的方法,其特征在于,所述方法包括:
将过表达hemA、hemL、eamA的质粒pET28b-ALA-LAA分别转入权利要求1-9任一项所述的菌株,培养所述菌株,从该发酵培养体系中收获5-氨基乙酰丙酸,得到5-氨基乙酰丙酸。
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