CN104830748B - 一种弱化hemB基因表达提高大肠杆菌合成5‑氨基乙酰丙酸的方法 - Google Patents
一种弱化hemB基因表达提高大肠杆菌合成5‑氨基乙酰丙酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种弱化hemB基因表达提高大肠杆菌合成5‑氨基乙酰丙酸的方法,属于代谢工程和微生物发酵领域。本发明在使用载体pRSFDuet‑1过量表达谷氨酰‑tRNA还原酶,谷氨醛氨基转移酶和粪卟啉原III氧化酶以及使用载体pETDuet‑1过量表达尿卟啉原III合酶的基础上,通过在基因组水平改造hemB基因的启动子进而调控其表达,考察其对ALA积累的影响。通过摇瓶发酵验证,目的产物ALA产量有明显提高,30h时ALA产量为2680mg/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种弱化hemB基因表达提高大肠杆菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法,属于代谢工程和微生物发酵领域。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA),分子式为C5O3NH9,分子量为131.13,熔点为149-151℃,它是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B12等关键前体物质。ALA已广泛应用于医学和农业领域,作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物已成功应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断和光动力治疗中。另外,由于ALA在自然界中可降解,作为一种无公害的新型光活化农药、除草剂以及植物生长调节剂等在农药领域应用也非常广泛。
目前,ALA主要通过化学法合成,最早出现在上世纪50年代,到20世纪90年代,相关研究开始大量开展并取得一定的成绩。但化学合成存在许多缺点,如反应步骤繁琐,副产物多,分离提纯困难,ALA得率也较低,并且环境污染严重。近年来,微生物发酵生产ALA已成为研究的热点。自然界中,ALA的生物合成存在两条途径,一条是C4途径,琥珀酰-CoA和甘氨酸在5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS,hemA编码)作用下生成ALA的一步酶促反应,主要存在于一些光合细菌、真菌以及动物体内。另外一条是广泛存在于植物、藻类以及细菌(如大肠杆菌)中的C5途径,首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS,gltX编码)催化下,生成谷氨酰-tRNA,然后,谷氨酰-tRNA在谷氨酰-tRNA还原酶(GluTR,hemA编码)作用下生成谷氨酸-1-半醛(GSA),最后GSA由谷氨酸-1-半醛-2,1-氨基转移酶(GSA-AT,hemL编码)催化生成ALA。
早期,人们筛选到产ALA的光合细菌类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides),通过诱变育种筛选ALA的高产菌株,并通过发酵优化等方法使得ALA的产量达到7.2g/L。但由于光合细菌的特殊性,其成本较高,不适合大规模的工业化生产。随着基因工程技术的成熟,Mariet和Zeikus选用大肠杆菌作为宿主细胞,采用基因工程的技术表达来源于R.sphaeroides的ALA合酶基因(hemA),ALA产量为3.79g/L。Xie et al.等利用过量表达R.sphaeroides来源的hemA基因,经发酵优化,ALA产量最高达到5.2g/L。但目前以C4途径为基础的生物转化由于添加前体琥珀酸和甘氨酸生产ALA成本相对较高,Kang et al.等通过分析大肠杆菌中C5途径的调控机制,发现ALA合成C5途径的关键基因hemA和hemL,同时实现了以葡萄糖为唯一碳源发酵生产ALA。
由于ALA是血红素合成途径的关键前体物质(图1),而血红素是细胞生长所必需的,为了进一步促进ALA的积累,本发明在表达5-氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶基因hemL和hemA和表达来源于大肠杆菌血红素生物合成途径基因hemD及hemF的基础上,通过在基因组水平改造ALA下游5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因hemB的启动子,弱化hemB基因的表达水平,实现ALA产量的进一步提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高大肠杆菌工程菌株产5-氨基乙酰丙酸的方法,是在基因组水平削弱大肠杆菌工程菌株hemB基因的表达,实现ALA产量的进一步提高。
所述在基因组水平削弱hemB基因的表达,是在基因组水平将hemB基因的启动子替换为在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子,例如基因fliC、flgC、tnaA、tap或fliA的启动子。
在本发明的一种实施方式中,所述在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子是fliC基因的启动子,来源于大肠杆菌,序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中,所述大肠杆菌工程菌株,是以大肠杆菌为宿主,使用不同拷贝数的表达载体组合过量表达谷氨酰-tRNA还原酶(hemA编码)、谷氨醛氨基转移酶(hemL编码)、尿卟啉原III合酶(hemD编码)和粪卟啉原III氧化酶(hemF编码)。
在本发明的一种实施方式中,所述大肠杆菌是Escherichia coli BL21(DE3);所述不同拷贝数表达载体分别为pRSFDuet-1和pETDuet-1。
在本发明的一种实施方式中,所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中,所述hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中,所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中,所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中,所述大肠杆菌工程菌株以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemF,并以pETDuet-1表达hemD。
本发明还提供了一种5-氨基乙酰丙酸产量提高的重组大肠杆菌,是将大肠杆菌基因组中hemB基因的启动子替换为fliC基因的启动子,并转入质粒pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemF和pETDuet-1-hemD。
所述重组大肠杆菌的构建方法,是通过基因重组将大肠杆菌基因组上的hemB基因的启动子替换为fliC基因的启动子,然后将质粒pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemF和pETDuet-1-hemD转化改造的菌株E.coli BL21(DE3)PfliC中,构建重组工程菌株PfliC-LADF-6:E.coli BL21(DE3)PfliC/pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemFpETDuet-1-hemD。
应用所述重组大肠杆菌生产5-氨基乙酰丙酸时,可将菌株活化后,以2%接种量转接发酵培养基中发酵,0h时添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达以及氨苄青霉素(100μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL),30-37℃,200r/min培养,周期28-36h。
本发明以表达C5途径关键基因hemL和hemA以及ALA代谢途径的下游基因hemD和hemF的工程菌为出发菌株,通过在基因组水平改造hemB基因的启动子,所得大肠杆菌工程菌株在3L发酵罐中积累5-氨基乙酰丙酸4.08g/L,有效地利用C5途径促进5-氨基乙酰丙酸的合成,实现了ALA产量的进一步提高。
附图说明
图1:大肠杆菌中血红素合成途径。
图2:基因组改造hemB启动子菌落PCR电泳图。M:DL 5000Maker;A:对照;B:改造hemB启动子菌株;C:改造hemB启动子菌株。
图3:改造hemB启动子对重组大肠杆菌合成ALA的影响。(a)250mL摇瓶发酵结果;A:LADF-6;B:PfliC-LADF-6。(b)重组大肠杆菌在3L发酵罐发酵结果。
具体实施方式
ALA分析方法:
采用Mauzerall和Granick的分光光度法:将样品稀释至2mL,加入1mL的乙酸钠缓冲液,0.5mL的乙酰丙酮,然后煮沸15min。冷却至室温,取2mL的反应液至新管中,然后加入2mL的Modified Ehrlich’s试剂,反应20min,利用分光光度计554nm下检测。
培养基:
斜面培养基(g/L):蛋白胨10,氯化钠10,酵母粉5.0,琼脂20,pH 7.0;
种子培养基(g/L):蛋白胨10,氯化钠10,酵母粉5.0,pH 7.0,装液量20mL/250mL;
发酵培养基(g/L):(NH4)2SO415,KH2PO45.0,Na2HPO4·12H2O 15,MgSO4·7H2O 1.0,酵母提取物1.0,葡萄糖20,pH 7.0。
培养条件:
菌种培养:甘油管划线,然后挑取单菌落划线平板37℃培养,作为种子来源;
种子培养:平板挑取菌体,37℃,200r/min,根据要求添加氨苄青霉素100μg/mL,卡那霉素50μg/mL,培养约12h,转接发酵培养基;
发酵培养:以2%接种量转接,0h时添加0.1-0.5mM IPTG诱导基因表达,根据需要添加苄青霉素(100μg/mL)以及卡那霉素(50μg/mL),30-37℃,200r/min培养,周期28-36h。
大肠杆菌工程菌LADF-6:E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-hemLA-hemF pETDuet-1-hemD的构建方法,参见发明名称为“一种利用组合调控策略提高5-氨基乙酰丙酸产量的方法”,申请号为201410274656.2的专利申请。
实施例1同源重组片段P1-Kan-PfliC-P2的组装
以大肠杆菌基因组为模板分别扩增hemB基因的启动子上游同源臂P1(934bp)、下游同源臂P2(726bp)和fliC启动子PfliC(130bp),以质粒pKD13为模板扩增筛选标记抗性基因Kan(1330bp)。然后以融合PCR的方法将4个片段组装,即P1-Kan-PfliC-P2(3120bp)。
引物如下:
上游同源臂P1
F1:CACTTGTATCAAATGTCTCATTTGTGTG
R1:CGAAGCAGCTCCAGCCTACACTTATTTATAGCTGTTGGTTATTATTTTTTGG
抗性基因Kan
F2:TAACCAACAGCTATAAATAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
R2:TTTCAAAAACAGCCATTTTTTGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTAATT
启动子PfliC
F3:TCATGTTTGACAGCTTATCAAAAAATGGCTGTTTTTGAAAAAAATT
R3:CGTTGGATTAAGTCTGTCATGATTCGTTATCCTATATTGCAAGTC
下游同源臂P2
F4:GCAATATAGGATAACGAATCATGACAGACTTAATCCAACGCCC
R4:AGTCTGCGCCCTGGGCTT
实施例2 hemB基因启动子改造
启动子改造方法采用Red重组一步法敲除:
(1)将质粒pKD46转化E.coli BL21(DE3),该质粒为温度敏感型,菌体培养温度为30℃。挑取在斜面培养基中培养的单菌落接种于添加100mg/L氨苄青霉素的SOB培养基中,30℃过夜培养约12h后,以2%接种量转接于添加100mg/L氨苄青霉素的SOB培养基中继续培养至OD600nm约0.1-0.2时,添加终浓度10mM的L-***糖诱导重组酶的表达,继续培养至OD600nm约0.6时,冰浴菌液约10min。4℃,4000r/min离心10min收集菌体,然后用无菌10%的甘油水溶液洗涤菌体三次,浓缩100倍,制备感受态细胞。
(2)利用电穿孔仪,2500v,电击重组片段P1-Kan-PfliC-P2,迅速加入600μL冰浴的SOC培养基,然后转入无菌的EP管中,30℃下后培养2h,然后涂布Kan抗性平板,30℃培养。挑取单克隆,利用菌落PCR验证(图2),与对照(扩增片段大小为1830bp)相比,改造启动子后扩增片段大小约为3000bp,说明启动子改造正确,进一步测序验证。
(3)辅助质粒pKD46的消除,将改造正确的菌株在37℃下过夜培养,划线于LB平板上,待单菌落长出,分别在无氨苄抗性和含氨苄抗性的平板上点板,在无氨苄抗性的平板上生长而在含氨苄抗性的平板上不生长的菌,说明质粒已消除成功。
(4)抗性基因的去除采用辅助质粒pCP20,将已成功消除质粒pKD46的菌株转化温度敏感型的质粒pCP20,挑取单菌落过夜培养后,按照1%(v/v)的接种量转入装有20mL LB培养基的250mL的三角瓶中,30℃培养至OD600nm为0.1时,转入42℃条件下培养12h以上,然后将菌液划线无抗性的LB平板,挑取单克隆,分别在无抗性、含氨苄抗性和含卡纳抗性的LB平板上点板,以验证抗性基因和pCP20质粒是否成功去除。
实施例3重组菌发酵验证
菌株:
LADF-6:E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-hemLA-hemFpETDuet-1-hemD。
PfliC-LADF-6:E.coli BL21(DE3)PfliC/pRSFDuet-1-hemLA-hemF pETDuet-1-hemD。
重组大肠杆菌PfliC-LADF-6与对照菌LADF-6分别在250mL三角瓶中发酵,接种量1%,初始葡萄糖浓度为20g/L,0h添加0.1-0.5mM IPTG诱导以及氨苄青霉素(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L),10h后ALA开始大量积累,在30h左右产量最高,为2680mg/L,相比对照产量提高25%以上(图3a)。
将重组大肠杆菌PfliC-LADF-6在3L发酵罐中放大培养,接种量2%,初始葡萄糖浓度约为35g/L,0h添加0.1-0.5mM IPTG诱导以及氨苄青霉素(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L),在30h左右产量最高,为4.08g/L(图3b)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种提高大肠杆菌工程菌株产5-氨基乙酰丙酸的方法,其特征在于,是在基因组水平削弱大肠杆菌工程菌株hemB基因的表达;所述在基因组水平削弱hemB基因的表达,是在基因组水平将hemB基因的启动子替换为在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子;所述在大肠杆菌生长稳定期强度减弱的启动子是fliC基因的启动子,来源于大肠杆菌,序列如SEQID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述大肠杆菌工程菌株,是以大肠杆菌为宿主,过量表达hemA编码的谷氨酰-tRNA还原酶、hemL编码的谷氨醛氨基转移酶、hemD编码编码的尿卟啉原III合酶和hemF编码的粪卟啉原III氧化酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述大肠杆菌工程菌株以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemF,并以pETDuet-1表达hemD。
4.一种5-氨基乙酰丙酸产量提高的重组大肠杆菌,其特征在于,是将大肠杆菌基因组中hemB基因的启动子替换为fliC基因的启动子,并以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemF,并以pETDuet-1表达hemD;所述fliC基因的启动子来源于大肠杆菌,序列如SEQ IDNO.5所示。
5.一种构建权利要求4所述重组大肠杆菌的方法,其特征在于,是通过基因重组将大肠杆菌基因组上的hemB基因的启动子替换为fliC基因的启动子,然后以pRSFDuet-1串联表达hemA、hemL、hemF,并以pETDuet-1表达hemD。
6.权利要求4所述重组大肠杆菌在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用。
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