CN104163684B

CN104163684B - 一种添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基

Info

Publication number: CN104163684B
Application number: CN201410311197.0A
Authority: CN
Inventors: 王运凤
Original assignee: Luxuriant Source Guilin Agrotechnique Development Corp Ltd
Current assignee: Chongqing Dazu Bianzhe Ecological Agriculture Co Ltd
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2034-06-30
Also published as: CN104163684A

Abstract

本发明公开了一种添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液43～53份，主料38～48份，蚕蛹粉6～13份，柚子皮8～17份。采用本发明的蛹虫草子实体培养基培养蛹虫草，在蛹虫草子实体生长过程中，可以有效抑制杂菌生长，保护菌种，同时培养出的蛹虫草抗氧化能力增强。

Description

一种添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基

技术领域

本发明涉及食用菌培养基领域，特别涉及一种添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基。

背景技术

蛹虫草亦称北虫草或北冬虫夏草，属于真菌门、子囊菌亚门、肉座菌目、麦角菌科、虫草属，寄生于夜蛾科等蛹体上，分布于世界各地，是一种国内外公认的既可食用又可药用的真菌。蛹虫草与冬虫夏草同属异种，是我国分布最广的具有药用价值的两种虫草菌。研究表明蛹虫草与冬虫夏草具有相同属性，相似的药理功能及详尽的临床效果，可替代冬虫夏草入药。蛹虫草中含有虫草素、虫草多糖、虫草酸、腺苷等成分，具有增强免疫、抗氧化、抗病毒、抗菌、明显抑制肿瘤生长、预防治疗脑血栓、脑溢血、肾功能衰竭，利尿、抑制血小板积聚防止血栓形成，消除面斑，抗衰防皱、保护心脏、肝脏，抗痉等多种功能。

野生虫草资源有限，因此人们开始转而研究用虫草的人工栽培。蛹虫草对于生长环境的要求相对较低，人工培养相比之下较容易，目前主要以液体发酵形成菌丝体，通过人工大规模固体培养获得子实体，另外通过活体培养进行规模化蛹虫草生产成为现实。蛹虫草在培养过程中，如果杀菌不好或者消毒不严，易发生细菌、酵母菌和霉菌等污染。若出现细菌、酵母菌和霉菌污染，将对母钟进一步纯化，严重的将被淘汰。由此可见细菌、酵母菌和霉菌对蛹虫草的污染，将造成培养财力、物力损失，增加不必要的麻烦。寻找一种有抑菌功能的培养基成为蛹虫草培养基领域的新需求。

柚子是芸香科植物柚的成熟果实，主要产于我国福建、江西、广东、广西等南方地区，现在我国的湖南、浙江、四川等地均有栽培。柚子清香、酸甜、凉润，营养丰富，药用价值很高，是人们喜食的名贵水果之一，也是医学界公认的最具食疗价值的水果。柚子皮是柚子的表皮又名橘红，性温，味苦、辛，有理气化痰、健脾消食、散寒燥湿的作用。而人们在食用了柚子后，柚子皮往往被当成垃圾丢弃，不仅为环境保护带来负担，同时也降低了柚子整体的功效价值。柚子皮中含有大量的柚皮苷，是属于黄酮类化合物又称黄碱素，是一类低分子天然植物成分，是植物在长期自然选择过程中产生的一些次生代谢产物。许多研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗过敏、抗菌消炎、抗突变、降压、降血糖、抗肿瘤、延缓衰老和保肝护胃等功效。还有研究表明，柚子皮中含有非常丰富的蛋白质、有机酸、维生素以及钙、磷、镁、钠等人体必需的元素。将柚子皮应用在蛹虫草子实体培养基中具有广阔的市场前景和经济价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抑菌功能，能够增强蛹虫草抗氧化功效的添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液43～53份，主料38～48份，蚕蛹粉6～13份，柚子皮8～17份。

本发明所述的添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基，其特征在于，由以下重量份的原料制成：营养液46～51份，主料40～44份，蚕蛹粉9～11份，柚子皮11～14份。

本发明所述的主料为大米、小麦、玉米、黄豆中的一种或多种,当多种混合时，可以是任意比例。在培养基中适当添加碳源，如大米、小麦、玉米、黄豆，有利于蛹虫草合成碳水化合物和氨基酸。

本发明所述的营养液由以下重量份原料制成：糖0.7～1.7份，酵母膏0.7～1.4份，磷酸二氢钾0.02～0.04份，硫酸镁0.02～0.04份，柠檬酸铵0.02～0.04份，维生素B10.002～0.004份，水96～99份。一般通过添加无机盐类来满足蛹虫草对矿物质元素的需求，本发明优选硫酸镁、磷酸二氢钾，其中磷酸二氢钾还有调节培养基的pH值作用，将培养基调节为偏酸性，满足蛹虫草偏酸性需求。由于蛹虫草不能合成必要维生素，适当添加维生素B1有利于蛹虫草的生长发育。在培养基中适当添加氮元素无机盐，如柠檬酸铵，促进蛹虫草自身合成的蛋白质、核酸等有机氮以及铵盐等无机氮。

本发明所述的糖为葡萄糖或蔗糖。葡萄糖和蔗糖等为小分子糖类，也作为蛹虫草碳源，促进蛹虫草合成碳水化合物和氨基酸的效果最好。

本发明添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基的制备，步骤如下：

(1)原料前处理：将柚子皮晒干经粉碎成粉末后，过50～100目筛，再将主料粉碎成细粉，过100～200目筛；称取糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、柠檬酸铵，加入水，边搅拌边加热至90℃～100℃，持续搅拌至原料全部溶解，冷却至常温，加入维生素B1，得营养液；

(2)原料混合：将主料细粉、柚子皮粉末、蚕蛹粉混合均匀，将混合物边搅拌边加入营养液中，搅拌均匀，得混合液；

(3)装瓶：将混合液分装至培养容器中，装入量为培养容器实际容量的2/3；

(4)杀菌：将装有混合液容器在119℃～124℃高温下杀菌30～45min，冷却至25℃～27℃，得到添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基。

相比现有技术，本发明的优点在于：

1、柚子皮中的黄酮及黄酮类物质对革兰氏阳性球菌，如葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌等，和革兰氏阴性杆菌，如大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌等都有抑制作用。在蛹虫草子实体培养基中添加柚子皮，有效抑制杂菌生长，保护蛹虫草菌种。

2、柚子皮中的黄酮类物质成分具有抗氧化作用，本发明通过在蛹虫草子实体培养基加入柚子皮，可以增强蛹虫草抗氧化功效。

3、柚子皮富含丰富的蛋白质、有机酸、维生素以及钙、磷、镁、钠等人体必需的元素，作为废料处理，浪费资源，将柚子皮添加到蛹虫草子实体培养基中，变废为宝，充分利用资源，提高柚子皮的利用价值。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1

一种添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液43份，大米28份，黄豆10份，蚕蛹粉6份，柚子皮8份。

营养液，由以下重量份的原料制成：蔗糖0.7份，酵母膏0.7份，磷酸二氢钾0.02份，硫酸镁0.02份，柠檬酸铵0.02份，维生素B10.002份，水96份。

营养液的制备：称取蔗糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、柠檬酸铵，加入水，边搅拌边加热至90℃，持续搅拌至原料全部溶解，冷却至常温，加入维生素B1，得营养液。

添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基的制备，步骤如下：

(1)原料前处理：将柚子皮晒干经粉碎成粉末后，过50目筛，再将大米、黄豆粉碎成细粉，过100目筛；

(2)原料混合：将大米细粉、黄豆细粉、柚子皮粉末、蚕蛹粉混合均匀，将混合物边搅拌边加入营养液中，搅拌均匀，得混合液；

(4)杀菌：将装有混合液容器在119℃高温下杀菌45min，冷却至25℃，得到添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基。

实施例2

一种添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液46份，大米15份，玉米15，黄豆10，蚕蛹粉9份，柚子皮11份。

营养液，由以下重量份的原料制成：葡萄糖0.9份，酵母膏0.9份，磷酸二氢钾0.03份，硫酸镁0.03份，柠檬酸铵0.03份，维生素B10.003份，水97份。

营养液的制备：称取葡萄糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、柠檬酸铵，加入水，边搅拌边加热至95℃，持续搅拌至原料全部溶解，冷却至常温，加入维生素B1，得营养液。

添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基的制备，步骤如下：

(1)原料前处理：将柚子皮晒干经粉碎成粉末后，过80目筛，再将大米、玉米、黄豆粉碎成细粉，过150目筛；

(2)原料混合：将大米细粉、玉米细粉、黄豆细粉、柚子皮粉末、蚕蛹粉混合均匀，将混合物边搅拌边加入营养液中，搅拌均匀，得混合液；

(4)杀菌：将装有混合液容器在121℃高温下杀菌35min，冷却至25℃，得到添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基。

实施例3

一种添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液51份，小麦30份，玉米14份，蚕蛹粉11份，柚子皮14份。

营养液，由以下重量份的原料制成：葡萄糖1.3份，酵母膏1.1份，磷酸二氢钾0.03份，硫酸镁0.03份，柠檬酸铵0.03份，维生素B10.003份，水98份。

添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基的制备，步骤如下：

(1)原料前处理：将柚子皮晒干经粉碎成粉末后，过100目筛，再将小麦、玉米粉碎成细粉，过200目筛；

(2)原料混合：将小麦细粉、玉米细粉、柚子皮粉末、蚕蛹粉混合均匀，将混合物边搅拌边加入营养液中，搅拌均匀，得混合液；

(4)杀菌：将装有混合液容器在122℃高温下杀菌35min，冷却至26℃，得到添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基。

实施例4

一种添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液53份，小麦28份，黄豆主20份，蚕蛹粉13份，柚子皮17份。

营养液，由以下重量份的原料制成：蔗糖1.7份，酵母膏1.4份，磷酸二氢钾0.04份，硫酸镁0.04份，柠檬酸铵0.04份，维生素B10.004份，水99份。

营养液的制备：称取蔗糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、柠檬酸铵，加入水，边搅拌边加热至100℃，持续搅拌至原料全部溶解，冷却至常温，加入维生素B1，得营养液。

添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基的制备，步骤如下：

(1)原料前处理：将柚子皮晒干经粉碎成粉末后，过80目筛，再将小麦、黄豆粉碎成细粉，过150目筛；

(2)原料混合：将小麦细粉、黄豆细粉、柚子皮粉末、蚕蛹粉混合均匀，将混合物边搅拌边加入营养液中，搅拌均匀，得混合液；

(4)杀菌：将装有混合液容器在124℃高温下杀菌30min，冷却至27℃，得到添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基。

对比例

一种蛹虫草子实体培养基，由以下重量份的原料制成：营养液46份，大米15份，玉米15，黄豆10，小麦11份，蚕蛹粉9份。

蛹虫草子实体培养基的制备，步骤如下：

(1)原料前处理：将大米、玉米、黄豆、小麦粉碎成细粉，过150目筛；

(2)原料混合：将大米细粉、玉米细粉、黄豆细粉、小麦细粉、蚕蛹粉混合均匀，将混合物边搅拌边加入营养液中，搅拌均匀，得混合液；

(4)杀菌：将装有混合液容器在121℃高温下杀菌35min，冷却至25℃，得到蛹虫草子实体培养基。

试验例1:本发明添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基对杂菌的抑制作用

1、培养基液体制备：将本发明实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例分别按料液比1:30加水提取，提取三次，合并提取液，浓缩至一定体积，加3倍95％的乙醇沉淀，取上清液浓缩、干燥，得实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例培养基粗提物备用。

2、供试菌种及其纯化培养与鉴定：

葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌、大肠杆菌、变形杆菌，由广西大学动物科技学院提供。

菌种采用连续划线法进行纯化，培养后的菌落采用革兰氏染色法进行鉴别，鉴别后的菌种斜面培养、备用。

革兰氏染色法：细菌先经碱性染料结晶紫染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌，后者为革兰氏阴性菌。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。

3、细菌培养基的配制：

采用牛肉膏蛋白胨培养基，为了增加细菌的生长速度，每lkg水中加入10g葡萄糖以对培养基进行改良，O.1Mpa灭菌20min，制成平板。

4、供试菌液的制备：

挑取经纯化和鉴定的菌落，接种于普通肉汤培养基中，36℃恒温振荡培养至浑浊。然后吸取一定量菌液接种于数支大试管中，重复上述条件培养。菌液10倍稀释，分别取0.1ml涂于平板，36℃恒温培养，菌落形成后计数，制成5×1O⁸CFU/ml菌液。

5、打孔器法测定本发明添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基对杂菌的抑制作用：

用R＝0.6cm的打孔器在平板上打孔，涂布己经准备好的菌液，然后在孔中加入浓度为100g/L的不同培养基备用粗提物的溶液，37℃恒温培养2～3天后观察，测其抑菌圈的大小。

6、试验结果：

表1不同蛹虫草子实体培养基溶液抑菌圈半径的大小统计单位：cm

	变形杆菌	葡萄球菌	链球菌	大肠杆菌	炭疽杆菌
						实施例1	1.62	1.64	1.62	1.75	1.64
实施例2	1.64	1.65	1.67	1.76	1.66
						实施例3	1.65	1.59	1.63	1.71	1.56
实施例4	1.57	1.57	1.60	1.69	1.59
						对比例	0.33	0.23	0.34	0.36	0.31

从表1可以看出，本发明实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基对葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌、大肠杆菌、变形杆菌有较强的抑制作用，对比例的未添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基对杂菌抑制作用极其微弱。

试验例2：本发明培养的蛹虫草抗氧化作用

1、材料：本发明实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草。

2、试验方法：

(1)蛹虫草粗体物制备提取方法：将本发明实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草分别粉碎，按料液比1：35加水提取，提取三次，合并提取液，浓缩至一定体积，加3倍95％的乙醇沉淀，取上清液浓缩、干燥，得蛹虫草粗提物备用。

(2)还原力的测定：样品将铁***(K₃Fe(CN)₆)还原成亚铁***(K₄Fe(CN)₆),亚铁***再与Fe³⁺作用，生成亚铁氰化铁(普鲁士蓝)，以在700nm波长处检测普鲁士蓝的吸光度表示还原力的大小，吸光度越高，样品的还原力就越强，抗氧化性越强。在700nm波长处，分别测定浓度为5mg/ml的本发明实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草粗提取物的吸光值。

(3)清除超氧阴离子实验：在产生超氧阴离子自由基(O^2-·)的反应体系中，分别加入浓度为5mg/ml的本发明实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草粗提取物，测定它们清除率。

(4)清除羟基自由基的实验：FeSO₄与H₂O₂反应产生·OH，在体系内加入水杨酸，可捕捉羟基自由基并产生有色物质，该物质在510nm处有最大吸收，当反应体系中存在·OH自由基清除剂时，此氧化过程受到抑制，吸光度值则降低。在FeSO₄与H₂O₂反应体系中，分别加入浓度为30mg/ml的本发明实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草粗提取物，测定清除率。

(5)模拟胃液pH条件下的NO^2-清除反应作用：清除亚硝酸盐是有效防止N-亚硝基化合物致癌的途径之一。在模拟体系中加入分别加入浓度为14mg/ml的本发明实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草粗提取物，测定清除率。

(6)DPPH法测定蛹虫草抗氧化活性：DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，广泛用于抗氧化评价体系中。在体系中，分别加入浓度为30mg/ml的本发明实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草粗提取物，测定清除率。

3、试验结果：

表2不同培养基培养的蛹虫草粗提取物的还原能力

	实施例2	实施例3	对比例
				吸光值	1.522	1.563	0.962

表2结果表明，实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草粗提取物具有抗氧化性，实施例2、实施例4抗氧化性优于对比例。

表3不同培养基培养的蛹虫草粗提取物清除超氧阴离子的能力

	实施例2	实施例3	对比例
				清除率	30％	33％	24％

表3表明，实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草粗提取物都具有清除超氧阴离子的能力，实施例2、实施例3清除能力优于对比例。

表4不同培养基培养的蛹虫草粗提取物清除羟基自由基的能力

	实施例2	实施例3	对比例
				清除率	76％	78％	58％

表4表明，实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草粗提取物都具有清除羟基自由基的能力，实施例2、实施例3清除能力优于对比例。

表5不同培养基培养的蛹虫草粗提取物对NO2-清除作用

	实施例2	实施例3	对比例
				清除率	61％	63％	40％

表5表明，实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草粗提取物对NO2-都有清除作用，实施例2、实施例3清除能力优于对比例。

表6不同培养基培养的蛹虫草粗提取物对DPPH清除效果

	实施例2	实施例3	对比例
				清除率	67％	71％	42％

表6表明，实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草粗提取物对DPPH都有清除效果，实施例2、实施例3清除效果优于对比例，表明添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基培养的蛹虫草具有很好的抗氧化性。

综合上述氧化反应体系试验结果，可知实施例2、实施例3、对比例培养的蛹虫草具有抗氧化性，而实施例2、实施例3优于对比例，说明添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基能够增强蛹虫草的抗氧化功效。

Claims

1.一种添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基，其特征在于，由以下重量份的原料制成：营养液43～53份，主料38～48份，蚕蛹粉6～13份，柚子皮8～17份。

2.根据权利要求1所述的添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基，其特征在于，由以下重量份的原料制成：营养液46～51份，主料40～44份，蚕蛹粉9～11份，柚子皮11～14份。

3.根据权利要求1或2所述的添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基，其特征在于：所述的主料为大米、小麦、玉米、黄豆中的一种或多种。

4.根据权利要求1或2所述的添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基，其特征在于，所述的营养液由以下重量份的原料制成：糖0.7～1.7份，酵母膏0.7～1.4份，磷酸二氢钾0.02～0.04份，硫酸镁0.02～0.04份，柠檬酸铵0.02～0.04份，维生素B10.002～0.004份，水96～99份。

5.根据权利要求1或2所述的添加柚子皮的蛹虫草子实体培养基，其特征在于：所述的糖为葡萄糖或蔗糖。