CN104147047B - 一种小牛血去蛋白提取物组合物及其注射剂和制法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小牛血去蛋白提取物的制法，包括如下步骤：a)缓化；b)酸沉；c)低温冷冻、升温溶解、离心，取上清液；d)碱沉；e)重复c)步骤；f)将步骤e)的上清液醇沉、离心，取上清液；g)将步骤f)的上清液超滤、真空浓缩，得浓缩超滤液；h)将步骤g)的浓缩超滤液超滤，收集超滤液，即得。本发明所提供的制法，既不破坏生物活性、又不引入外源离子、能有效去除其中杂蛋白；由该小牛血去蛋白提取物制得的注射剂，不会引发过敏反应，安全度高，能有效治疗脑中风、脑外伤、脑功能不全及脑痴呆等脑细胞代谢障碍性疾病，改善细胞氧含量和微循环；注射剂的制备方法，能充分保证最终产品的质量稳定性和安全度，保证制剂的药用效果，消除现有制剂的副作用。

Description

一种小牛血去蛋白提取物组合物及其注射剂和制法

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及一种小牛血去蛋白提取物及其注射剂和制法。

技术背景

小牛血去蛋白提取物水针剂，曾用名：血活素注射液，系由新鲜小牛血或血清经去蛋白、浓缩、超滤或透析等工艺制得的含有无机物及小分子有机物的灭菌水溶液。可增强组织细胞对氧及葡萄糖摄取与利用，改善细胞乏氧状态和机体内环境，增加心、脑、肝等脏器的血流量，改善微循环。用于脑缺血、脑痴呆、脑外伤及大脑功能不全等脑细胞代谢障碍性疾病的治疗。目前，已公开了一些有关小牛血去蛋白提取物的制备工艺，多数工艺采用乙醇沉淀、酶解、高温、酸碱等方法去除杂蛋白，也有用柱层析除杂的方法。这些方法都存在去除蛋白不完全的问题，临床使用时会由于杂蛋白未有效去除而发生不良反应，其中的有机物类物质如氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等发生聚合为大分子物质而易引起过敏反应；而且酶解、高温、酸碱等方法去除杂蛋白时，还存在破坏其中原有的生物活性、降低其药用价值的缺点；另外，酸碱法去除杂蛋白还会引入外源离子，这都会降低其药用价值；另外，由于工艺重现性不好，而难以大规模生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种既不破坏生物活性、又不引入外源离子、能有效去除其中杂蛋白的的小牛血去蛋白提取物的制法，及由该小牛血去蛋白提取物制得的注射剂及制法。

本发明的小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：

a)将小牛血在30-40℃缓化20min，得缓化后的小牛血；

b)向步骤a)得到的缓化后的小牛血中加入盐酸溶液进行酸沉，调整pH至3.5～4.0，得酸化后的小牛血；所述盐酸溶液是纯化水与质量分数为36％～38％的盐酸按照1:1的体积比配制的；

c)将步骤b)得到的酸化后的小牛血在-25℃下低温冷冻24h，然后再以1℃/min的升温速度升温至60℃，并60℃恒温1h，待冷冻后的小牛血融化后，在离心机转速为15000转/分钟的情况下进行离心分离12min，收集上清液，备用；

d)向步骤c)得到的上清液中加入质量分数为20％的NaOH溶液，调节pH值至8.0～8.5，得碱化后的上清液；

e)将步骤d)得到的碱化后的上清液在-20℃下低温冷冻24h，然后再以1℃/min的升温速度升温至40℃，并40℃恒温1h，待冷冻后的小牛血融化后，在离心机转速为13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；

f)将步骤e)得到的上清液置于配液罐内，在70r/min的搅拌速度下，按照上清液与乙醇溶液的体积比为1:2的比例，缓慢加入质量分数为80％的乙醇溶液，在离心机转速为13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；

g)将步骤f)得到的上清液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤，所得超滤液在真空度为-0.1MPa、60℃恒温下进行真空浓缩，浓缩至体积为原超滤液体积的1/15，得浓缩超滤液；

h)将步骤g)得到的浓缩超滤液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤，收集超滤后的液体，然后置于配液罐中在70r/min的搅拌速度下混合30min，即得小牛血去蛋白提取物。

步骤c)、e)对小牛血进行冷冻、融化的循坏，可以促使细胞内外的有效物质充分释放，不破坏有效成分的生物活性、保证有效成分的充分提取；步骤c)以1℃/min的升温速度升温至60℃，并60℃恒温1h，对冷冻的小牛血进行融化，不仅可以有效地、完全地去除其中的杂蛋白，而且不会破坏有效成分的生物活性，同时具有杀菌作用，能对牛源性病毒充分灭活，保证了小牛血去蛋白提取物的安全性；步骤e)以1℃/min的升温速度升温至40℃，并40℃恒温1h，可以进一步去除杂蛋白，灭活牛源性病毒；步骤f)中进一步用乙醇以一定的比例对步骤b)得到的上清液进行混合，进一步去除杂蛋白，充分保证了杂蛋白去除的完全性；超滤柱的使用，进一步保证了杂蛋白去除的完全性。

本发明的小牛血去蛋白提取物的制备方法，不仅能有效地、完全地去除其中的杂蛋白，而且不会破坏有效成分的生物活性，同时具有杀菌作用，能对牛源性病毒充分灭活，保证了小牛血去蛋白提取物的安全性；另外工艺重现性好，利于大规模生产。

由本发明的的制备方法制得的小牛血去蛋白提取物制得的注射剂，包括粉针剂和水针剂。

为了方便存放和运输，将由本发明的的制备方法制得的小牛血去蛋白提取物制成粉针剂和水针剂，存放和携带方便，便于运输。

本发明的注射剂为粉针剂，粉针剂包括下列重量份的原料：

小牛血去蛋白提取物 4000

冻干保护剂 200

注射用水 4000，

所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3:1的重量份数比组成。

冻干保护剂的加入，可有效保证最终的冻干剂中活性成分的生物活性，特别是海藻糖与PEG以3:1的重量份数比作为冻干保护剂，在保证有效保证最终的冻干剂中活性成分的生物活性的同时，也具有稳定作用，使最终制得的冻干剂生物活性高、性质稳定。

本发明的注射剂为水针剂，水针剂包括下列重量份的原料：

小牛血去蛋白提取物 600

注射用水 400。

本发明的注射剂的制备方法，包括如下步骤：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度大于等于1.0560补加注射用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对小牛血去蛋白提取物进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对小牛血去蛋白提取物进行超滤至稀配罐中，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0260～1.0560补加注射用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加10％的氢氧化钠溶液调节pH值至6.8～7.3，搅拌10min至均匀，取样检测，得澄明度合格的稀配液；

e)向步骤d)得到的澄明度合格的稀配液中，边搅拌边加入海藻糖与PEG，混合均匀，然后经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；

f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3μm的紫外线照射1min，得处理后的除菌稀配液；

g)灌装：将清洗灭菌后的缓冲罐与硅胶管、陶瓷泵、灌装针头、分药器、胶塞震荡器用无菌操作法连接安装到灌装机上，对步骤f)得到的处理后的除菌稀配液进行灌装，得灌装稀配液；

h)冻干：将步骤g)得到的灌装稀配液置于冻干机内进行冻干，得注射剂，即粉针剂。

对小牛血去蛋白提取物先浓配后稀配，得到的最终产品中，小牛血去蛋白提取物分散均匀，最终产品质量稳定；灭菌处理可以保证最终产品的安全性；制备方法工艺简单，工艺可重复性好，利于大规模生产。

现有的小牛血去蛋白提取物药物，患者使用后易出现兴奋、睡眠质量差等副作用，本发明在制备小牛血去蛋白提取物的粉针剂过程中，通过对制备工艺的改进，解决了该技术问题，防止了患者使用后易出现兴奋、睡眠质量差等副作用。其对制备工艺的改进是：在步骤f)中，将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3μm的紫外线照射1min。

优选地，本发明的注射剂的制备方法，步骤e)中，除菌过滤器上、下游压力的压差不超过0.08Mpa。

在这个参数设置范围内，可以有效保证除菌效果，保证最终产品的安全性。

优选地，本发明的注射剂的制备方法，步骤g)中，灌装过程每30分钟抽检装量一次，每个针头抽检2支，罐装量为3.95～4.05ml/支。

可以有效地保证最终产品的质量，保证其安全性和稳定性。

优选地，本发明的注射剂的制备方法，步骤h)中，冻干过程的干燥设置如下：

冷冻控制：设定导热油温度-45℃～-50℃，持续时间90分钟；设定导热油温度-10℃持续时间15分钟；设定导热油温度-45℃～-50℃，持续时间180分钟；

后箱预冷：设定后箱温度为-45℃～-50℃；

预抽真空：设定干燥箱预抽真空度为0.15mPa；

升华干燥：

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为-15℃，持续时间840分钟；

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为-10℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为-5℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为0℃，持续时间180分钟；

解析干燥：

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为5℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为15℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.05mPa，导热油温度为36℃，持续时间360分钟。

冻干过程中各个阶段的温度设置对冻干的效果影响很大，如上的设置可保证小牛血去蛋白提取物的生物活性和制剂的冻干效果，保证最终产品的质量。

本发明的注射剂的制备方法，包括如下步骤：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度大于等于1.0260补加注射用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对补加注射水后的小牛血去蛋白提取物溶液进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对其进行超滤至稀配罐中，搅拌10min至均匀，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0242～1.0260补加注射用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加5％的氢氧化钠溶液调节pH值至6.7～7.1，搅拌10min至均匀，取样检测，得合格的稀配液；

e)将步骤d)得到的合格的稀配液，经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；

f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3μm的紫外线照射1min，得处理后的除菌稀配液；

g)灌装：将清洗灭菌后的硅胶管、陶瓷泵、灌封针头、分液器在A级保护下用无菌操作法连接安装到灌封机上，对步骤f)得到的处理后的除菌稀配液进行灌装，得灌装稀配液；

h)灭菌：用推板将步骤g)得到的灌装稀配液，足够紧凑的装入周转盘中，把周转盘整齐装满灭菌车，进行灭菌，得注射剂，即水针剂。

对小牛血去蛋白提取物先浓配后稀配，得到的最终产品中，小牛血去蛋白提取物分散均匀，最终产品质量稳定；灭菌处理可以保证最终产品的安全性；制备方法工艺简单，工艺可重复性好，利于大规模生产。

现有的小牛血去蛋白提取物药物，患者使用后易出现兴奋、睡眠质量差等副作用，本发明在制备小牛血去蛋白提取物的粉针剂过程中，通过对制备工艺的改进，解决了该技术问题，防止了患者使用后易出现兴奋、睡眠质量差等副作用。其对制备工艺的改进是：在步骤f)中，将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3μm的紫外线照射1min。

优选地，本发明的注射剂的制备方法，步骤gh)中，灭菌条件为115℃、30分钟。

在这种灭菌条件设置下，对水针剂的灭菌效果最好，产品的稳定性和安全度高。

本发明的有益效果为：

本发明所提供的小牛血去蛋白提取物的制法，既不破坏生物活性、又不引入外源离子、能有效去除其中杂蛋白；由该小牛血去蛋白提取物制得的注射剂，不会引发过敏反应，安全度高，能有效治疗脑中风、脑外伤、脑功能不全及脑痴呆等脑细胞代谢障碍性疾病，改善细胞氧含量和微循环；注射剂的制备方法，能充分保证最终产品的质量稳定性和安全度，保证制剂的药用效果，防止患者使用后出现兴奋、睡眠质量差等副作用。

附图说明

图1为对照组耳缘静脉组织照片(×200倍)；

图2为给药组耳缘静脉组织照片(×200倍)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1 小牛血去蛋白提取物的制法

一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：

a)将小牛血在35℃缓化20min，得缓化后的小牛血；

b)向步骤a)得到的缓化后的小牛血中加入盐酸溶液进行酸沉，调整pH至4.0，得酸化后的小牛血；所述盐酸溶液是纯化水与质量分数为37％的盐酸按照1:1的体积比配制的；

c)将步骤b)得到的酸化后的小牛血在-25℃下低温冷冻24h，然后再以1℃/min的升温速度升温至60℃，并60℃恒温1h，待冷冻后的小牛血融化后，在离心机转速为15000转/分钟的情况下进行离心分离12min，收集上清液，备用；

d)向步骤c)得到的上清液中加入质量分数为20％的NaOH溶液，调节pH值至8.0～8.5，得碱化后的上清液；

e)将步骤d)得到的碱化后的上清液在-20℃下低温冷冻24h，然后再以1℃/min的升温速度升温至40℃，并40℃恒温1h，待冷冻后的小牛血融化后，在离心机转速为13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；

f)将步骤e)得到的上清液置于配液罐内，在70r/min的搅拌速度下，按照上清液与乙醇溶液的体积比为1:2的比例，缓慢加入质量分数为80％的乙醇溶液，在离心机转速为13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；

g)将步骤f)得到的上清液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤，所得超滤液在真空度为-0.1MPa、60℃恒温下进行真空浓缩，浓缩至体积为原超滤液体积的1/15，得浓缩超滤液；

h)将步骤g)得到的浓缩超滤液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤，收集超滤后的液体，然后置于配液罐中在70r/min的搅拌速度下混合30min，即得小牛血去蛋白提取物。

实施例2 粉针剂

处方：

小牛血去蛋白提取物 4000g

冻干保护剂 200g

注射用水 4000g

所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3:1的重量份数比组成；

制法：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度1.0560补加注射用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对小牛血去蛋白提取物进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对小牛血去蛋白提取物进行超滤至稀配罐中，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0260补加注射用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加10％的氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，搅拌10min至均匀，取样检测，得澄明度合格的稀配液；

e)向步骤d)得到的澄明度合格的稀配液中，边搅拌边加入海藻糖与PEG，混合均匀，然后经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；所述除菌过滤器上、下游压力的压差为0.08Mpa；

f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3μm的紫外线照射1min，得处理后的除菌稀配液；

g)灌装：将清洗灭菌后的缓冲罐与硅胶管、陶瓷泵、灌装针头、分药器、胶塞震荡器用无菌操作法连接安装到灌装机上，对步骤e)得到的处理后的除菌稀配液进行灌装，得灌装稀配液；灌装过程每30分钟抽检装量一次，每个针头抽检2支，罐装量为4.00ml/支；

h)冻干：将步骤f)得到的灌装稀配液置于冻干机内进行冻干，得冻干剂；冻干过程中干燥设置如下：

冷冻控制：设定导热油温度-45℃，持续时间90分钟；设定导热油温度-10℃持续时间15分钟；设定导热油温度-45℃，持续时间180分钟；

后箱预冷：设定后箱温度为-45℃；

预抽真空：设定干燥箱预抽真空度为0.15mPa；

升华干燥：

设定干燥箱真空度为0.10mPa，导热油温度为-15℃，持续时间840分钟；

设定干燥箱真空度为0.10mPa，导热油温度为-10℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.10mPa，导热油温度为-5℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.10mPa，导热油温度为0℃，持续时间180分钟；

解析干燥：

设定干燥箱真空度为0.10mPa，导热油温度为5℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.10mPa，导热油温度为15℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.05mPa，导热油温度为36℃，持续时间360分钟。

实施例3 粉针剂

处方：

小牛血去蛋白提取物 4000g

冻干保护剂 200g

注射用水 4000g

所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3:1的重量份数比组成；

制法：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度1.0580补加注射用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对小牛血去蛋白提取物进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对小牛血去蛋白提取物进行超滤至稀配罐中，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0560补加注射用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加10％的氢氧化钠溶液调节pH值至7.3，搅拌10min至均匀，取样检测，得澄明度合格的稀配液；

e)向步骤d)得到的澄明度合格的稀配液中，边搅拌边加入海藻糖与PEG，混合均匀，然后经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；所述除菌过滤器上、下游压力的压差为0.06Mpa；

f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3μm的紫外线照射1min，得处理后的除菌稀配液；

g)灌装：将清洗灭菌后的缓冲罐与硅胶管、陶瓷泵、灌装针头、分药器、胶塞震荡器用无菌操作法连接安装到灌装机上，对步骤e)得到的处理后的除菌稀配液进行灌装，得灌装稀配液；灌装过程每30分钟抽检装量一次，每个针头抽检2支，罐装量为4.00ml/支；

h)冻干：将步骤f)得到的灌装稀配液置于冻干机内进行冻干，得冻干剂；冻干过程中干燥设置如下：

冷冻控制：设定导热油温度-50℃，持续时间90分钟；设定导热油温度-10℃持续时间15分钟；设定导热油温度-50℃，持续时间180分钟；

后箱预冷：设定后箱温度为-50℃；

预抽真空：设定干燥箱预抽真空度为0.15mPa；

升华干燥：

设定干燥箱真空度为0.30mPa，导热油温度为-15℃，持续时间840分钟；

设定干燥箱真空度为0.30mPa，导热油温度为-10℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.30mPa，导热油温度为-5℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.30mPa，导热油温度为0℃，持续时间180分钟；

解析干燥：

设定干燥箱真空度为0.30mPa，导热油温度为5℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.30mPa，导热油温度为15℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.05mPa，导热油温度为36℃，持续时间360分钟。

对照实施例1 粉针剂

处方：

小牛血去蛋白提取物 4000g

注射用水 4000g

制法：

除步骤e)为“将步骤d)得到的澄明度合格的稀配液，经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液”不同于实施例2中的步骤e)，其余步骤均与实施例2相同。

对照实施例2 粉针剂

处方：

小牛血去蛋白提取物 4000g

冻干保护剂 200g

注射用水 4000g

所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3:1的重量份数比组成；

制法：

除不含有实施例2中的步骤f)，即“将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3μm的紫外线照射1min，得处理后的除菌稀配液”，其余步骤均于实施例2相同。

实施例4 水针剂的制法

粉针剂的制法，包括如下步骤：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度1.0260补加注射用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对补加注射水后的小牛血去蛋白提取物溶液进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对其进行超滤至稀配罐中，搅拌10min至均匀，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0242补加注射用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加5％的氢氧化钠溶液调节pH值至6.7，搅拌10min至均匀，取样检测，得合格的稀配液；

e)将步骤d)得到的合格的稀配液，经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；

f)灌装：将清洗灭菌后的硅胶管、陶瓷泵、灌封针头、分液器在A级保护下用无菌操作法连接安装到灌封机上，对步骤e)得到的除菌稀配液进行灌装，得灌装稀配液；

g)灭菌：用推板将步骤f)得到的灌装稀配液，足够紧凑的装入周转盘中，把周转盘整齐装满灭菌车，进行灭菌，即得水针剂；灭菌条件为115℃、30分钟。

实施例5 水针剂的制法

粉针剂的制法，包括如下步骤：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度1.0280补加注射用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对补加注射水后的小牛血去蛋白提取物溶液进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对其进行超滤至稀配罐中，搅拌10min至均匀，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0260补加注射用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加5％的氢氧化钠溶液调节pH值至7.1，搅拌10min至均匀，取样检测，得合格的稀配液；

e)将步骤d)得到的合格的稀配液，经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；

f)灌装：将清洗灭菌后的硅胶管、陶瓷泵、灌封针头、分液器在A级保护下用无菌操作法连接安装到灌封机上，对步骤e)得到的除菌稀配液进行灌装，得灌装稀配液；

g)灭菌：用推板将步骤f)得到的灌装稀配液，足够紧凑的装入周转盘中，把周转盘整齐装满灭菌车，进行灭菌，即得水针剂；灭菌条件为115℃、30分钟。

为说明这一情况，现通过试验例进一步说明本发明的效果如下：

试验例1 过敏试验

1.试验对象：

豚鼠，雄性18只，体重250-350g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

随机平均分成三组，分别为给药组6只、生理盐水组6只、阳性对照组6只，按无菌操作。

2.试验方法：

给药组：隔日腹腔注射本发明的小牛血去蛋白提取物0.5ml/只；首次注射后的第14天，随机选取其中的3只，静脉注射本发明的小牛血去蛋白提取物1ml/只；首次注射后的第21天，取剩余的3只，静脉注射本发明的小牛血去蛋白提取物1ml/只；

生理盐水组：隔日腹腔注射生理盐水0.5ml/只；首次注射后的第14天，随机选取其中的3只，静脉注射生理盐水1ml/只；首次注射后的第21天，取剩余的3只，静脉注射生理盐水1ml/只；

阳性对照组：隔日腹腔注射1％新鲜鸡蛋清溶液各0.5ml/只；首次注射后的第14天，随机选取其中的3只，静脉注射1％新鲜鸡蛋清溶液；首次注射后的第21天，取剩余的3只，静脉注射1％新鲜鸡蛋清溶液1ml/只；

观察过敏反应现象，按表1进行过敏反应分级。

表1 豚鼠过敏反应级数

反应级数2级以上(包括2级)时，可认为过敏试验不合格。

3.试验结果：

实验结果如表2所示。

表2 小牛血去蛋白提取物过敏试验结果

如表2所示，重复使用本发明的小牛血去蛋白提取物，未引起豚鼠出现过敏反应。

4.结论：本发明的小牛血去蛋白提取物，安全度高，对豚鼠无致敏反应。

试验例2 体外溶血试验

1.试验对象：长耳白家兔1只。

2.试验药物：

本发明的小牛血去蛋白提取物，规格：400mg(总固体)；用注射用水溶解，制成每1ml含40ng(总固体)的溶液，备用。

3.试验方法：

取家兔1只，心脏采血10毫升，用竹签搅拌去除纤维蛋白，将血转移到离心管中，2000转/分，离心5分钟，除去上清液，加生理盐水至10ml，混匀后2000转/分离心5分钟，弃去上清液，反复四次，将所得的红细胞按体积用生理盐水稀释成2％混悬液备用。按表3加样，其中第6、7管分别为生理盐水对照管和溶血的阳性对照管。将各管摇匀后，37摄氏度水浴内温育4小时，按表4标准判断各管在4小时内是否出现溶血或凝聚。

表3 体外溶血试验加样表

表4 体外溶血结果判定

4.试验结果：

实验结果如表5所示。

表5 小牛血去蛋白提取物体外溶血试验结果

如表5所示，本发明的小牛血去蛋白提取物各浓度4小时内对家兔红细胞均无溶血或凝聚反应；生理盐水对照组各浓度4小时内对家兔红细胞均无溶血或凝聚反应；阳性对照组在各个时间点均全溶血。

5.结论：本发明的小牛血去蛋白提取物在各浓度4小时内对家兔红细胞均无溶血或凝聚反应。

试验例3 静脉注射血管刺激性试验

1.试验对象：

长耳白家兔，雌雄兼用(雌未孕)8只，体重2.0-2.5kg，黑龙江黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

随机均分成两组，分别为给药组4只、对照组4只，按无菌操作。

2.试验药物：

本发明的小牛血去蛋白提取物，规格：400mg(总固体)；用注射用水溶解，制成每1ml含40ng(总固体)的溶液，备用。

3.试验方法：

给药组：用一次性无菌输液器将本发明的小牛血去蛋白提取物经耳缘静脉以5.0ml/Kg，、0.5ml/min静滴给药，每日一次，连续三天；

对照组：用一次性无菌输液器将生理盐水经耳缘静脉以5.0ml/Kg、0.5ml/min静滴给药，每日一次，连续三天。

4.统计方法：

给药期间每日观察血管注射部位及整个外耳廓有无变化，在第三次给药后24小时将动物处死，取给药处血管及周边组织，以5％甲醛溶液固定，切片，染色，切片部位为进针部位向心端1cm及2cm处。

5.试验结果：

肉眼观察结果：给药组未见血管充血、出血、组织坏死；生理盐水对照组血管也未见异常病理改变。

病理检查结果：如图1、2所示，给药组、生理盐水对照组动物耳缘静脉内无血栓形成，血管内皮细胞及周围组织未见水肿、炎性浸润或坏死等异常改变。表明本发明的小牛血去蛋白提取物对家兔静脉血管无刺激作用。

6.结论：本发明的小牛血去蛋白提取物对家兔静脉血管无刺激作用。

试验例4 兴奋性试验

1.试验对象：

长耳白家兔，雌雄兼用(雌未孕)12只，体重2.0-2.5kg，黑龙江黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

随机平均分成三组，分别为试验组、对照组，按无菌操作。

2.试验方法：

试验组：将实施例2的粉针剂用注射用水配制成70％浓度的溶液；长耳白家兔腹腔注射所得溶液40ml/只然后停药，停药后继续观察7天；分别在停药后第4天和第7天记录其兴奋反应情况；

对照组：将对照实施例2的粉针剂用注射用水配制成70％浓度的溶液；长耳白家兔腹腔注射所得溶液40ml/只然后停药，停药后继续观察7天；分别在停药后第4天和第7天记录其兴奋反应情况；

观察兴奋反应现象，按表6进行兴奋性反应分级。

表6 兴奋反应级数

反应级数2级以上(包括2级)时，可认为兴奋性试验不合格。

3.试验结果：

实验结果如表7所示。

表7 兴奋性试验结果

如表7所示，试验组的粉针剂，未引起长耳白家兔出现兴奋性反应等副作用；

这表明，在制备本发明的小牛血去蛋白提取物的制剂时，对得到的除菌稀配液用波长为0.3μm的紫外线照射1min处理，对制备的制剂效果影响很大，消除了现有方法制得的小牛血去蛋白提取物药物在使用过程中，易出现兴奋、睡眠质量差等副作用。

4.结论：本发明的小牛血去蛋白提取物制剂的制备方法，可以很好地消除现有方法制得的小牛血去蛋白提取物制剂，在使用过程中，易出现兴奋、睡眠质量差等副作用。

试验例5 稳定性试验

1.加速试验

取实施例2的粉针剂，分成3批，分别编号为样品1、样品2和样品3，在温度40℃±2℃下，相对湿度为75％±5％的条件下放置6个月，在试验期间1个月、2个月、3个月、6个月末分别取样一次，按中国药典中的规定，检测粉针剂的性状、小牛血去蛋白提取物的含量(标示量％)，结果发现，各项指标均无明显变化；

对照实施例1的粉针剂，做同样处理；结果发现，在第3个月，各项指标开始有所变化，粉针剂颜色稍微加深、小牛血去蛋白提取物含量下降；在第6个月，各项指标出现明显变化，粉针剂颜色加深、小牛血去蛋白提取物含量显著下降；

由实施例2与对照实施例1的加速试验可知，实施例2的粉针剂较对照实施例1具有加速稳定性。

2.长期试验

取实施例2的粉针剂，分成3批，分别编号为样品1、样品2和样品3，在温度25℃±2℃下，相对湿度为60％±10％的条件下放置24个月，在试验期间0个月、3个月、6个月、9个月、12个月末分别取样一次，按中国药典中的规定，检测粉针剂的性状、小牛血去蛋白提取物的含量(标示量％)，结果发现，各项指标均无明显变化；

对照实施例1的粉针剂，做同样处理；结果发现，在第6个月，各项指标开始有所变化，粉针剂颜色稍微加深、小牛血去蛋白提取物含量下降；各项指标出现明显变化，粉针剂颜色加深、小牛血去蛋白提取物含量显著下降；

由实施例2与对照实施例1的长期试验可知，实施例2的粉针剂较对照实施例1具有长期稳定性。

3.结论

由加速试验和长期试验可知，实施例2的粉针剂稳定性好，这说明冻干保护剂的加入，明显地提高了粉针剂的稳定性。

试验例6 临床试验 急性缺血性脑血管病

1.病例选择：

共30例，其中男性18例，女性12例，年龄58-76岁，平均为70.2岁。所有病例均详细询问病史，神经***检查及颅脑CT扫描确诊，并作治疗前后血液流变学检查。梗塞部位为单侧基底节区15例，单侧皮层或皮层下梗塞6例，双侧病变或多发梗塞7例，大面积梗塞2例；

以上病例随机分为治疗组和对照组，各15例。

2.给药方式：

治疗组：5％葡萄糖250ml和本发明的小牛血去蛋白提取物30ml，静脉滴注，26天；

对照组：低分子右旋糖酐500ml，静脉滴注，26天。

3.典型症状：功能缺损、病残。

4.诊断标准：

痊愈：临床症状完全消失，功能缺损减少率91-100％，病残程度为0-1级；

显效：临床症状基本消失，功能缺损减少率46-90％，病残程度为1-3级；

有效：临床症状减轻，功能缺损减少率18-45％；

无效：基本无变化或恶化，功能缺损减少率0-17％，或功能缺损增加。

5.试验结果：

治疗组和对照组的疗效比较结果见表8；

表8 治疗组和对照组的疗效比较

治疗组和对照组比较具有显著差异(P＜0.01)。

6.效果判定：本发明的小牛血去蛋白提取物，有效率93.3％、痊愈率33.3％，能有效治疗急性缺血性脑血管病，有效率和治愈率均较对照组高，疗效好，治愈效果显著优于对照组。

试验例7 临床试验 提高长跑运动员运动能力

1.病例选择：

18名业余中长跑运动员均为男性，平均年龄16.2岁(15-19)，身高172.9±5.3cm，体重58.9±6.3kg，平均训练年限为3.3年，其中4人达到国家田径二级运动员的水平，14人达到国家田三级径运动员的水平。所有测试对象均身体健康，无特殊病史，血压和心脏听诊均在正常范围。

2.给药方式：

采用随机平均分组、单盲交叉，重复进行2次相同的运动试验(一次使用本发明的小牛血去蛋白提取物，另一次使用生理盐水)，两次试验间隔为2周。

3.测试指标：

在膝关节等速肌力测试中，测定120°/秒和240°/秒的膝关节伸、屈肌力的最大力矩、总作功和耐力指数；

在跑台测试运动中，测定运动员的最大通气量、最大摄氧量和心率，各级负荷后测血乳酸。

4.试验结果：

试验组和对照组的伸膝肌力试验结果见表9；

表9 试验组和对照组的伸膝肌力试验结果(X±SD)

试验组和对照组比较具有差异(P＜0.05)。

6.效果判定：本发明的小牛血去蛋白提取物，相对于对照组，能提升运动员的运动能力和耐力。

试验例8 临床试验 老年人脑血管性痴呆

1.病例选择：

老年人脑血管性痴呆20例。男性16例，女性4例。最小60岁，最大者86岁，平均68.1岁；随机平均分为两组，治疗组1和治疗组2，每组10例。

2.给药方式：

治疗组1：使用本发明的小牛血去蛋白提取物，第1周中的第1天用400mg，第2天用800mg，第3-6天用1200mg/天；第2、3周每周第1-5天用1200mg/天，3周为一疗程；皆用生理盐水200ml稀释静点。

治疗组2：在第1、2、3周每周第1-5天用1200mg/天，应用生理盐水200ml稀释静点。

3.典型症状：近记忆力减退、表情淡漠、反应迟钝、计算困难、定向力障碍、强哭强笑、假性球麻痹、运动及感觉障碍、病理征等中枢神经损害。

4.诊断标准：

判定主要根据精神认识能力量表的检查结果，并参考其它量表检查的结果而判定，评价方法采用打分方式。

明显显效：上升11分以上；

显效：上升6-10分；

有效：上升3-5分；

无效：上升0-2分。

5.试验结果：

老年人脑血管性痴呆治疗结果见表10，每例30分；*表示有差异，P<0.05；**表示有显著性差异，P<0.01。

表10 老年人脑血管性痴呆治疗结果

疗前与疗后比较具有显著差异(P＜0.01)。

6.效果判定：本发明的小牛血去蛋白提取物，能有效治疗老年人脑血管性痴呆，治愈效果显著。

试验例9 临床试验 糖尿病性周围神经病

1.病例选择：

选择符合WHO(1985年)糖尿病诊断标准的NIDDM性周围神经病的住院病为60例力临床观察对象；随机按2:l分为治疗组40例，对照组20例。

治疗组40例，男性26例，女性14例，年龄23～78岁(平均54.9±13.5岁)，病程0.5～26年(平均9.1±7.1年)，BMI＞25有8例(20％)；

对照组20例，男性10例，女性10例，年龄33～73岁(平均58.5±9.4岁)，病程0.5～20年(平均11.1±9.4岁)，BMI＞25有4例(20％)。

2.给药方式：

治疗组：使用本发明的小牛血去蛋白提取物水针剂50ml加入250ml氯化钠注射液中静脉滴注，每日一次，15天为一疗程。

对照组：用VitB1 100mg和VitB12 250μg肌肉注射，每日一次，15天为一疗程。

3.典型症状：四肢疼痛、麻木、发凉，伴或不伴肌肉萎缩并经检查四肢神经传导速度呈延迟、潜伏期延长，电压降低；同时除外由于大血管病变，免疫性，外伤性及其它神经性疾病所致周围神经病变。

4.诊断标准：

痊愈：临床症状完全消失。

显效：临床症状基本消失。

有效：临床症状减轻。

无效：基本无变化。

5.统计方法：

临床结果的数据用微机的Systat软件处理，治疗前后数据进行t检验或X检验，对疗效加以判断，两组结果数据进行t检验比较疗效。

6.试验结果：

治疗组和对照组的疗效比较结果见表11；

表11 治疗组和对照组的疗效比较

治疗组和对照组比较具有显著差异(P＜0.01)。

6.效果判定：本发明的小牛血去蛋白提取物水针剂，好转率97％，能有效治疗糖尿病性周围神经病，有效率较高，疗效好，治疗效果显著优于对照组。

试验例10 临床试验 脑梗塞

1.病例选择：

本组30例患者均为经CT或MRI证实为首次发病的项内动脉脑梗塞患者，发病距开始治疗时间28小时至4天。患者随机分为爱治疗组15例，对照组15例；两组患者平均年龄无明显差异；

治疗组15例，男8例，女7例，年龄46～80岁，平均52.43±12.13岁；

对照组15例，男9例，女6例，年龄43～74岁，平均51.35±10.65岁。

2.给药方式：

治疗组：使用本发明的小牛血去蛋白提取物水针剂1200mg+5％葡萄糖250ml静脉滴注，每日1次，共26天。

对照组：低分子右旋糖酐500ml静脉滴注，每日1次，共26天，低分子右旋糖酐用前做皮试。

3.典型症状：肢体发麻，运动不灵、言语不清、眩晕、视物模糊等征象。

4.诊断标准：

痊愈：功能缺损评分减少90-100％，病残程度0级。

显效：功能缺损评分减少46-89％，病残程度1-3级。

有效：功能缺损评分减少18-45％。

无效：功能缺损评分减少18％之内或增加。

5.试验结果：

治疗组和对照组治疗前后神经功能缺损变化结果见表12；

表12 治疗组和对照组治疗前后神经功能缺损变化结果

治疗组和对照组比较具有显著差异(P＜0.01)；

由表12可知，用药前治疗组与对照组临床神经功能缺损评分比较无显著差异。用药后两组评分均有下降，但治疗组下降更明显，前后相比差异有显著性(P<0.001)。两组间神经功能缺损积分减少值相比差异极为显著(P<0.001)，

治疗组和对照组治疗前后血液流变学变化结果见表13；

表13 治疗组和对照组治疗前后血液流变学变化结果

由表13可知，治疗组治疗后红细胞聚集指数、血浆粘度、全血粘度均显著降低(P<0.05)，而纤维蛋白原及红细胞压积治疗前后无显著差异。

治疗组和对照组的整体疗效比较见表14；

表14 治疗组和对照组的整体疗效比较

由表14可知，治疗组的整体疗效显著优于对照组。

6.效果判定：本发明的小牛血去蛋白提取物水针剂，有效率86.7％，能有效治疗脑梗塞，有效率和痊愈率高，疗效好，治疗效果显著优于对照组。

典型应用1：

李某，女，46岁，功能缺损、病残。多方治疗，效果均不理想。经详细询问病史、神经***检查及颅脑CT扫描确诊为急性缺血性脑血管病。治疗：5％葡萄糖250ml和本发明的小牛血去蛋白提取物30ml，静脉滴注，26天，患者症状完全消失，功能缺损减少率达91-100％，病残程度恢复为0-1级。跟踪调查发现一年后无复发。

典型应用2：

曾某，男，70岁，记忆力减退、表情淡漠、反应迟钝、计算困难、定向力障碍、强哭强笑、假性球麻痹、运动及感觉障碍、病理征等中枢神经损害。确诊为老年人脑血管性痴呆。多方治疗，效果均不理想。治疗：使用本发明的小牛血去蛋白提取物，第1周中的第1天用400mg，第2天用800mg，第3-6天用1200mg/天；第2、3周每周第1-5天用1200mg/天，3周为一疗程；皆用生理盐水200ml稀释静点；一个疗程后，症状几乎消失。继续使用1个疗程，加以巩固。跟踪调查发现一年后无复发。

典型应用3：

刘某，男，45岁，四肢疼痛、麻木、发凉，伴或不伴肌肉萎缩并经检查四肢神经传导速度呈延迟、潜伏期延长，电压降低；同时除外由于大血管病变，免疫性，外伤性及其它神经性疾病所致周围神经病变。经诊断为糖尿病性周围神经病。多方治疗，效果均不理想。治疗：使用本发明的小牛血去蛋白提取物水针剂50ml加入250ml氯化钠注射液中静脉滴注，每日一次，15天为一疗程；使用一个疗程后，症状几乎消失。继续使用1个疗程，加以巩固。跟踪调查发现一年后无复发。

典型应用4：

曾某，女，79岁，肢体发麻，运动不灵、言语不清、眩晕、视物模糊。经诊断为脑梗塞。多方治疗，效果均不理想。治疗：使用本发明的小牛血去蛋白提取物水针剂1200mg+5％葡萄糖250ml静脉滴注，每日1次，共26天，症状几乎消失。跟踪调查发现一年后无复发。

Claims (10)

1.一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

a)将小牛血在30-40℃缓化20min，得缓化后的小牛血；

b)向步骤a)得到的缓化后的小牛血中加入盐酸溶液进行酸沉，调整pH至3.5～4.0，得酸化后的小牛血；所述盐酸溶液是纯化水与质量分数为36％～38％的盐酸按照1∶1的体积比配制的；

c)将步骤b)得到的酸化后的小牛血在-25℃下低温冷冻24h，然后再以1℃/min的升温速度升温至60℃，并60℃恒温1h，待冷冻后的小牛血融化后，在离心机转速为15000转/分钟的情况下进行离心分离12min，收集上清液，备用；

d)向步骤c)得到的上清液中加入质量分数为20％的NaOH溶液，调节pH值至8.0～8.5，得碱化后的上清液；

e)将步骤d)得到的碱化后的上清液在-20℃下低温冷冻24h，然后再以1℃/min的升温速度升温至40℃，并40℃恒温1h，待冷冻后的小牛血融化后，在离心机转速为13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；

f)将步骤e)得到的上清液置于配液罐内，在70r/min的搅拌速度下，按照上清液与乙醇溶液的体积比为1∶2的比例，缓慢加入质量分数为80％的乙醇溶液，在离心机转速为13000转/分钟的情况下进行离心分离，收集上清液，备用；

g)将步骤f)得到的上清液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤，所得超滤液在真空度为-0.1MPa、60℃恒温下进行真空浓缩，浓缩至体积为原超滤液体积的1/15，得浓缩超滤液；

h)将步骤g)得到的浓缩超滤液用截流分子量为5000道尔顿的超滤柱进行超滤，收集超滤后的液体，然后置于配液罐中在70r/min的搅拌速度下混合30min，即得小牛血去蛋白提取物。

2.由权利要求1所述的制备方法制得的小牛血去蛋白提取物制得的注射剂，其特征在于，所述注射剂包括粉针剂和水针剂。

3.根据权利要求2所述的注射剂，其特征在于，所述注射剂为粉针剂，所述粉针剂由下列重量份的原料制成：

小牛血去蛋白提取物 4000

冻干保护剂 200

注射用水 4000，

所述冻干保护剂是由海藻糖与PEG以3∶1的重量份数比组成。

4.根据权利要求2所述的注射剂，其特征在于，所述注射剂为水针剂，所述水针剂由下列重量份的原料制成：

小牛血去蛋白提取物 600

注射用水 400。

5.根据权利要求3所述的注射剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度大于等于1.0560补加注射用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对小牛血去蛋白提取物进行预滤,然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对小牛血去蛋白提取物进行超滤至稀配罐中，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0260～1.0560补加注射用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加10％的氢氧化钠溶液调节pH值至6.8～7.3，搅拌10min至均匀，取样检测，得澄明度合格的稀配液；

e)向步骤d)得到的澄明度合格的稀配液中，边搅拌边加入海藻糖与PEG，混合均匀，然后经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；

f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3μm的紫外线照射1min，得处理后的除菌稀配液；

g)灌装：将清洗灭菌后的缓冲罐与硅胶管、陶瓷泵、灌装针头、分药器、胶塞震荡器用无菌操作法连接安装到灌装机上，对步骤f)得到的处理后的除菌稀配液进行灌装，得灌装稀配液；

h)冻干：将步骤g)得到的灌装稀配液置于冻干机内进行冻干，得注射剂，即粉针剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤e)中，所述除菌过滤器上、下游压力的压差不超过0.08Mpa。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤g)中，灌装过程每30分钟抽检装量一次，每个针头抽检2支，罐装量为3.95～4.05ml/支。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤h)中，所述冻干过程的干燥设置如下：

冷冻控制：设定导热油温度-45℃～-50℃，持续时间90分钟；设定导热油温度-10℃持续时间15分钟；设定导热油温度-45℃～-50℃，持续时间180分钟；

后箱预冷：设定后箱温度为-45℃～-50℃；

预抽真空：设定干燥箱预抽真空度为0.15mPa；

升华干燥：

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为-15℃，持续时间840分钟；

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为-10℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为-5℃，持续时间180分钟；

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为0℃，持续时间180分钟；

解析干燥：

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为5℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.10～0.30mPa，导热油温度为15℃，持续时间120分钟；

设定干燥箱真空度为0.05mPa，导热油温度为36℃，持续时间360分钟。

9.根据权利要求4所述的注射剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

a)准备配液容器：用注射用水将配液容器冲洗干净，备用；

b)浓配：称取处方量的小牛血去蛋白提取物，按相对密度大于等于1.0260补加注射用水进行浓配，用截流分子量为5000道尔顿的中空纤维柱对补加注射水后的小牛血去蛋白提取物溶液进行预滤，然后再用截流分子量为5000道尔顿的膜片对其进行超滤至稀配罐中，搅拌10min至均匀，得浓配液，备用；

c)稀配：向步骤b)中含有浓配液的稀配罐中，按相对密度1.0242～1.0260补加注射用水进行稀配，得稀配液，备用；

d)向步骤c)得到的稀配液中添加5％的氢氧化钠溶液调节pH值至6.7～7.1，搅拌10min至均匀，取样检测，得合格的稀配液；

e)将步骤d)得到的合格的稀配液，经0.22μm筒式除菌过滤器过滤至缓冲罐，得除菌稀配液；

f)将步骤e)得到的除菌稀配液用波长为0.3μm的紫外线照射1min，得处理后的除菌稀配液；

g)灌装：将清洗灭菌后的硅胶管、陶瓷泵、灌封针头、分液器在A级保护下用无菌操作法连接安装到灌封机上，对步骤f)得到的处理后的除菌稀配液进行灌装，得灌装稀配液；

h)灭菌：用推板将步骤g)得到的灌装稀配液，足够紧凑的装入周转盘中，把周转盘整齐装满灭菌车，进行灭菌，得注射剂，即水针剂。

10.一种权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤h)中，灭菌条件为115℃、30分钟。