CN101366727B - 一种小牛血去蛋白提取物的制备方法及其产品 - Google Patents

一种小牛血去蛋白提取物的制备方法及其产品 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小牛血去蛋白提取物的制备方法及其产品，包括以下步骤：(1)取小牛血全血依次经过酸沉、冷冻、融化、离心；收集离心后的上清液，备用；(2)将收集的上清液依次经过碱沉、冷冻、融化、离心；再次收集上清液，备用；(3)将步骤(2)所收集的上清液酸沉后，离心；取上清液进行超滤，超滤液进行反渗透浓缩，得浓缩液备用；(4)将步骤(3)所制备的浓缩液超滤，收集超滤液，即得。本发明采用低温提取，所制备的提取物生物活性高，杂质少，临床应用安全、有效。

Description

一种小牛血去蛋白提取物的制备方法及其产品
技术领域
本发明涉及一种小牛血去蛋白提取物的制备方法以及由该方法制备得到的产品，属于生物医药领域。
背景技术
目前，总体来说，小牛血去蛋白提取物主要有如下两种提取方法：
(1)将小牛血或血清经酸碱处理后，加热(30℃～90℃)，浓缩(60℃以上)，超滤等步骤制备而成。例如以下中国专利CN100352450C、CN1251689C、CN101084922A均公开了采用酸碱处理、减压浓缩(高温)、超滤等处理方法制备小牛血去蛋白提取物。该方法在提取过程中多处采用了热处理方式，尤其浓缩过程受热时间较长，大大降低了产品的生物活性，并且加热过程中产生大量的杂质，从而影响产品临床使用的安全性及有效性。
(2)将小牛血或血清经乙醇去蛋白，酶解，壳聚糖层析等制备而成。例如以下中国专利：CN1062135C、CN100374123C、CN100396291C、CN1899307A均公开了小牛血或血清去蛋白后，采用酶解及层析的方法制备小牛血去蛋白提取物。
该方法采用这一酶解步骤的同时，容易产生杂质，且层析工艺复杂，对设备要求高，影响因素较多，工艺重现性不好控制，目前这种工艺实现产业化比较困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种制备工艺相对简捷、产品生物活性高的小牛血去蛋白提取物的制备方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取小牛血全血依次经过酸沉、冷冻、融化、离心；收集离心后的上清液，备用；
(2)将步骤(1)所收集的上清液依次经过碱沉、冷冻、融化、离心；收集离心后的上清液，备用；
(3)将步骤(2)所收集的上清液酸沉后离心，取上清液进行超滤，超滤液进行反渗透浓缩，得浓缩液备用；
(4)将步骤(3)所制备的浓缩液超滤，收集超滤液，即得。
为了达到更好的技术效果，上述制备方法的步骤(1)中，优选的：所述的酸沉是向小牛血全血中加入稀盐酸至pH值为3.5-4.0；所述的稀盐酸进一步优选是用纯水与浓盐酸按照1:1的体积比配制而成；所述的冷冻是在-20℃以下的温度下将酸沉后的混合物冻结；所述的融化为将冻结后的混合物在不超过40℃的温度条件下缓缓融化；所述的离心的转速为15000转/分；
步骤(2)中，优选的：所述的碱沉是向上清液中加入碱溶液调pH值至8.0-8.5；进一步优选的，所述的碱溶液是20％NaOH溶液；所述的冷冻是在-20℃以下的温度下将碱沉后的混合物冻结；所述的融化为将冻结后的混合物在不超过40℃的温度条件下缓缓融化；所述的离心的转速为15000转/分；
步骤(3)中，优选的：所述的酸沉是向上清液中加入稀盐酸至pH值为6.0-7.0；所述的稀盐酸进一步优选是用纯水与浓盐酸按照1:1的体积比配制而成；所述的离心的转速为15000转/分；
步骤(3)和步骤(4)中所述的超滤优选是在工作压力不高于0.1Mpa，截流分子量为6KDa的中空纤维柱进行超滤。
本发明小牛血去蛋白提取物在制备过程中避免了生物活性成分受热破坏，尤其在浓缩过程中采用常温的反渗透浓缩技术，能很好的保留产品的生物活性，避免不良杂质的产生，从而保证了产品的临床用药的安全性及疗效。
本发明方法所制备得到的小牛血去蛋白提取物可用于制备小牛血去蛋白提取物注射液或注射用小牛血去蛋白提取物。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、取小牛血全血，不断搅拌下加入1:1盐酸(按纯水与浓盐酸体积比配制)，调节pH值至3.5；
2、-20℃以下冻结，在不超过40℃的温度下缓缓融化；
3、离心(转速为15000转/分)，收集上清液；
4、向上清液中加20％NaOH溶液，调pH值至8.0；
5、-20℃冻结，在不超过40℃的温度下缓缓融化；
6、离心(转速为15000转/分)，收集上清液；
7、向上清液中加1：1盐酸溶液(按纯化水与浓盐酸体积比配制)调节pH值至6.0，离心(15000转/分)，收集上清液；
8、将所收集的上清液超滤：中空纤维柱的截流分子量为6KDa，工作压力不高于0.1Mpa；收集超滤液；
9、将所收集的超滤液进行反渗透浓缩；
10、将浓缩液超滤：中空纤维柱的截流分子量为6KDa，工作压力不高于0.1Mpa；收集超滤液，即小牛血去蛋白提取物溶液。
实施例2
1、取小牛血全血，不断搅拌下加入1:1盐酸(按纯化水与浓盐酸体积比配制)，调节pH值至4.0；
2、-20℃以下冻结，在不超过40℃的温度下缓缓融化；
3、离心(转速为15000转/分)，收集上清液；
4、向上清液中加20％NaOH溶液，调pH值至8.5；
5、-20℃冻结，在不超过40℃的温度下缓缓融化；
6、离心(转速为15000转/分)，收集上清液；
7、向上清液中加1：1盐酸溶液(按纯化水与浓盐酸体积比配制)调节pH值至7.0，离心(15000转/分)，收集上清液；
8、将所收集的上清液超滤：中空纤维柱的截流分子量为6KDa，工作压力不高于0.1Mpa；收集超滤液；
9、将所收集的超滤液进行反渗透浓缩；
10、将浓缩液超滤：中空纤维柱的截流分子量为6KDa，工作压力不高于0.1Mpa；收集超滤液，即小牛血去蛋白提取物溶液。
实施例3
1、取小牛血全血，不断搅拌下，加入1:1盐酸(按纯化水与浓盐酸体积比配制)，调节pH值至3.5；
2、-20℃以下冻结，在不超过40℃的温度下缓缓融化；
3、离心(转速为15000转/分)，收集上清液；
4、向上清液中加20％NaOH溶液，调pH值至8.5；
5、-20℃冻结，在不超过40℃的温度下缓缓融化；
6、离心(转速为15000转/分)，收集上清液；
7、向上清液中加1：1盐酸溶液(按纯化水与浓盐酸体积比配制)调节pH值至6.5，离心(15000转/分)，收集上清液；
8、将所收集的上清液超滤：中空纤维柱的截流分子量为6KDa，工作压力不高于0.1Mpa；收集超滤液；
9、将所收集的超滤液进行反渗透浓缩；
10、将浓缩液超滤：中空纤维柱的截流分子量为6KDa，工作压力不高于0.1Mpa；收集超滤液，即小牛血去蛋白提取物溶液。

Claims (12)

1.一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取小牛血全血依次经过酸沉、冷冻、融化、离心；收集离心后的上清液，备用；
(2)将步骤(1)所收集的上清液依次经过碱沉、冷冻、融化、离心；收集离心后的上清液，备用；
(3)将步骤(2)所收集的上清液酸沉后离心，取上清液进行超滤，超滤液进行反渗透浓缩，得浓缩液备用；
(4)将步骤(3)所制备的浓缩液超滤，收集超滤液，即得；
其中，步骤(3)或步骤(4)中所述的超滤是在工作压力不高于0.1Mpa，采用截流分子量为6KDa的中空纤维柱进行超滤。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的酸沉是向小牛血全血中加入稀盐酸至pH值为3.5-4.0。
3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的稀盐酸是用纯水与浓盐酸按照1∶1的体积比配制而成。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的冷冻是在-20℃以下的温度下将酸沉后的混合物冻结。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的碱沉是向上清液中加入碱溶液调pH值至8.0-8.5。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的碱溶液是20％的NaOH溶液。
7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的冷冻是在-20℃以下的温度下将碱沉后的混合物冻结。
8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的融化为将冻结后的混合物在不超过40℃的温度条件下缓缓融化。
9.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的酸沉是向上清液中加入稀盐酸至pH值为6.0-7.0。
10.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述的稀盐酸是用纯水与浓盐酸按照1∶1的体积比配制而成。
11.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的离心的转速为15000转/分。
12.由权利要求1所述制备方法得到的产品。
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