CN1965865A - 雷氏大疣蛛毒素的药物应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的抗癌药物应用。通过生物物理手段，从异纺蛛科Hexathelidae的雷氏大疣蛛Macrothele raveniZhu，Li & Song，2000的毒腺中采集并冷冻干燥得到固体晶体：雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)，以牛血清清蛋白为标准，按Lowry法测定雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)含量，结果是每毫克含0.836毫克蛋白质，即蛋白含量是83.6％。实验证明雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)在体外和体内能高效地直接杀灭肝肿瘤细胞从而抑制肿瘤生长。雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)不但可用于制备癌症患者的治疗药物，并有望开发成一种治疗中枢神经***以外其它***肿瘤的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种雷氏大疣蛛毒素的药物应用，特别是其用于制备抗癌药物的应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
近些年来，关于动物毒素的抗肿瘤作用研究报道比较多的是蝎毒、蛇毒和蜂毒。同样，很多蜘蛛在防卫和捕食时能从螯牙尖端排放毒素，蜘蛛毒腺组织分泌用于捕食和防卫的毒液中含有丰富的蛋白质与多肽组分，有许多生物活性成分具有较高的学术研究价值和医药应用前景，这使得蜘蛛毒素的研究应用成为可能。目前，以化学模式为主体的药学科学已迅速转向以生物学和化学相结合的新模式，在此形式下，多肽类药物的市场应用研究更具有广阔的发展前景。众所周知，化疗药物以细胞毒作用为主，对肿瘤细胞发挥直接杀伤作用。与化学抗癌药物相比，中药抗肿瘤有其自身特点和一定优势，综合现有的中药抗肿瘤研究结果，更广阔的研究方向有：活性组分的分离提取，毒素活性蛋白多肽的结构与功能研究，并在此基础上研制临床及研究试剂，为蛋白酶、血小板受体、抗癌多肽结构与功能研究提供良好的基础知识，同时，为临床抗癌药物、镇痛等的治疗开辟了新的途径。动物毒液自古就有药用的记载，但是文献中研究蜘蛛毒素离子通道的比较多，对于蜘蛛抗癌蛋白抗肿瘤的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种雷氏大疣蛛毒素的药物应用，特别是其在制备抗癌药物中的应用。
本发明的构思是这样的。研究发现：存在于生物体的多肽已有数万种，所有的细胞都能合成多肽。同时，几乎所有细胞也都受多肽调节，它涉及激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域。蜘蛛毒素是一种复杂混合物，其化学成分较多，但其主要成分是多肽和蛋白质，包括多肽神经毒素、细胞毒素、酶、激素类似物、凝集活性肽和抗菌肽等。蜘蛛毒素对肿瘤细胞多靶点效应的主要机制包括直接抑制或杀灭肿瘤细胞、影响肿瘤细胞DNA和蛋白质合成及细胞生长周期、诱导肿瘤细胞凋亡、调节肿瘤细胞信号通路、影响肿瘤细胞化学成分及代谢、增强荷瘤机体的抗肿瘤免疫功能等。此外，蜘蛛毒液中还含有多胺类以及ATP、核苷酸、氨基酸、单胺类等低分子量物质和无机盐等。这正是蜘蛛毒素在抗癌药物中应用的理论基础。
本发明包括以下内容：
一、雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的制备方法
用一个固定在铁架台上，内径3cm、高5cm的塑料杯作为毒液接受器，持大镊子从侧面夹住成年雌性蜘蛛胸部，让蜘蛛张开鳌肢并伸入杯内，然后用脉冲电流刺激鳌肢基部3-5秒，诱使其将螯牙刺入软管内排毒。它即用触肢紧紧抱住杯壁，将鳌爪有力刺向杯内壁并射出毒液。经反复诱使其排毒后，毒液用一次性微量注射器抽取，经离心去除沉淀，收集到1.5ml离心管中，冰冻3～4h后，立即放入冷冻干燥机中经真空冷冻干燥得到略带黄色的干粉，即为粗毒，于-20℃保存。
真空冷冻干燥后，使用时用不加牛清的RPMI 1640培养基溶剂溶解，一次性小滤器过滤除菌。制备雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的用具使用一次性医用微量注射器，保证了蜘蛛毒素不被污染。
以牛血清清蛋白为标准，按Lowry法测定雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的蛋白质含量，结果是每毫克毒素含0.836毫克蛋白质，即蛋白含量是83.6％。
二、雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)溶剂的选择
经过多次实验表明使用“不加牛清的RPMI 1640培养基”效果好于“D-Hank’s缓冲液”和“医用五蒸水”。因此，本发明中使用的溶剂是“不加牛清的RPMI 1640培养基”。
三、雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)抗肿瘤实验及药用机理分析
1、雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)体外抑瘤实验
取对数生长期的人肿瘤细胞，用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)按1∶1稀释消化，用细胞计数板计数，将终密度1×104个/mL的肿瘤细胞悬液接种于96孔培养板，每孔180μL，培养12h。分别加入阴性对照D-Hank’s缓冲液、阳性对照顺珀DDP及不同浓度雷氏大疣蛛抗癌蛋白(10，20，40μg/mL)各20μL，每组均设3个复孔。空白对照只加培养液，不加细胞。置于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中分别培养48h，各培养孔加入1mg/mLMTT 10μL，4h后弃去培养上清，D-Hank’s缓冲液充分洗涤细胞，每孔加入150μL DMSO，振荡器上振荡10min，充分溶解甲膜(Formazan)结晶，酶标仪检测各孔吸光度A值，测定波长λ＝570nm，参考波长λ＝630nm，计算相对于阴性对照的生长抑制率，计算公式为：抑制率(CI)＝(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100％。同时判断IC50。
通过MTT法作出的生长曲线可以得出雷氏大疣蛛蛛毒素抑制肿瘤细胞生长50％时的浓度约为20μg/mL(48h)。
2、雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的动物实验
第一代移植瘤：BALB/C裸小鼠，常规碘酊和酒精消毒每只裸鼠接种部位的皮肤，用带用1mL注射器抽取癌5×107个/mL细胞悬液200μL，在无菌条件下，接种于裸鼠的前左侧腿上部皮下，拔出针头，用酒精棉球压住针眼处片刻，防止液体流出。接种瘤细胞后，将裸小鼠送回无特殊病原体实验动物饲养室饲养。第一代移植瘤共接种20只裸鼠。
第二代移植瘤：自接种至出现肉眼可见的瘤结节的时间为潜伏期。隔日观察与测量肿瘤的体积大小，当第一代移植瘤成瘤并生长至10-15mm3时，将荷瘤裸鼠用1％硫喷妥钠腹腔注射麻醉，无菌条件下切取肿瘤组织。清洗液清洗，立即放入含无血清培养液的培养皿中，修剪肿瘤组织，用无血清培养液洗涤两次，将一部分移植瘤组织切成解剖显微镜下约1×1×2mm大的组织块，供种植；一部分放入固定液中固定；其余放液氮罐中冻存。整个工作均在超净工作台上完成。移植时仍然采取皮下注射的方法，用改制的12号针头套管针(针尖角度为75度)将肿瘤组织块接种于裸鼠的后左侧腿上部皮下，整个过程在30min内完成。接种瘤组织块后，将裸小鼠送回无特殊病原体饲养室饲养。第二代移植瘤共接种50只裸鼠。建立了人肿瘤细胞BALB/C裸鼠移植瘤模型，在裸鼠尾部皮下静脉分别注射1.0，2.0，4.0μg/g雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)。注射雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)实验组比只注射不加牛清的RPMI 1640培养基的对照组荷瘤裸鼠肿瘤的增长均受到明显抑制，在给药第21d与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；1.0μg/g雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)对肿瘤增长的抑制作用明显，与对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05)。2.0μg/g，4.0μg/g雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)与对肿瘤增长的抑瘤强度明显，与对照组相比，瘤重量、瘤体积、抑瘤率明显减少，具有显著性差异(P＜0.01)。
3、急性毒理试验
预备实验 取小鼠30只，按简化机率单位法随机等分为5组，造原始记录表，项目包括剂量组、编号、体重、性别、注射量、注射时间、反应、死亡时间。随机取样，蛛毒用生理盐水溶解，按上述剂量进行腹腔注射，注射体积为每只小鼠0.2mL左右，对照组注射生理盐水，连续观察7d。
正式实验 按寇氏krber法。每组10只，称取小鼠体重，按0.2mL/10g腹腔注射雷氏大疣蛛蛛毒。各组注射液浓度根据小鼠25g平均体重水平来计算确定，高低剂间距为1∶0.85。观察2周并记录大鼠中毒表现和死亡情况。
实验结果为：用雷氏大疣蛛抗癌蛋白注射小鼠腹腔后，小鼠反应与预备试验基本相同。小鼠中毒表现为：四肢抽搐频率先慢后快，双眼变得呆滞，呼吸频率加快后减慢，随后胸部和腹部剧烈抽搐，最后心脏搏动停止，死亡的小鼠集中在注射后1h之内。雷氏大疣蛛抗癌蛋白对昆明种雌、雄小鼠经腹腔注射半致死量LD50为1.15mg/kg，LD50的95％可信度为：1.09-1.29mg/kg，对照组无异常反应。
4、药用机理分析
对雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)进行体外实验、体内实验及急性毒理试验，发现雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)对癌细胞的增殖具有抑制的作用。化疗药物以细胞毒作用为主，对肿瘤细胞发挥直接杀伤作用。雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的抑制肿瘤细胞作用正是具备了化疗药物这一特点。蜘蛛做为常见的生物资源，雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)有待进一步研发成多肽类生化抗肿瘤药物，本发明无疑将有崭新的生物医学应用价值。近年来用生物技术开发的多肽类、蛋白质生物大分子药物不断涌现，这为雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)用于多肽类生化抗肿瘤药物走向市场提供了广阔的空间。
本发明取得的积极效果是：实验证明雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)在体外和体内都可以高效地直接杀灭肝肿瘤细胞从而抑制肿瘤生长。雷氏大疣蛛毒素的体内抑瘤特性，发现较高剂量(4.0μg/g)和低剂量(1.0μg/g)组裸鼠未发现中枢神经***中毒症状。1.0，2.0，4.0μg/g三个剂量对荷瘤裸鼠体重及肝肾脾脑等重要脏器的重量及形态学方面均未见显著的影响。提示1.0-4.0μg/g浓度实验组雷氏大疣蛛毒素不能够迅速通过血脑屏障进入中枢神经，有望开发成一种治疗中枢神经***以外其他***肿瘤的药物。而如果大于4.0μg/g浓度实验组雷氏大疣蛛毒素也许有可能迅速通过血脑屏障进入中枢神经，则有可能将该生化药物开发成一种治疗中枢神经***以内肿瘤的药物，则不需要考虑如何阻断其迅速通过血脑屏障而直接进入中枢神经***治疗中枢神经***肿瘤。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。
实施例
雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)的制备
用一个固定在铁架台上，内径3cm、高5cm的塑料杯作为毒液接受器，持大镊子从侧面夹住成年雌性蜘蛛胸部，让蜘蛛张开鳌肢并伸入杯内，然后用脉冲电流刺激鳌肢基部3-5秒，诱使其将螯牙刺入软管内排毒。它即用触肢紧紧抱住杯壁，将鳌爪有力刺向杯内壁并射出毒液。经反复诱使其排毒后，毒液用一次性微量注射器抽取，经离心去除沉淀，收集到1.5ml离心管中，不加牛清的RPMI 1640培养基溶解经真空冷冻干燥得到略带黄色的干粉，冰冻3～4h后，立即放入冷冻干燥机中经真空冷冻干燥得到略带黄色的干粉，即为粗毒，于-20℃保存。一次性小滤器过滤除菌、除去不溶物，制成静脉注射液针剂。
药物应用：将雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)用于抑制人肝癌BEL-7402细胞、人肝癌SMMC-7721细胞、人肝癌HepG2细胞、人***HeLa细胞、人胃癌BGC-823细胞的增殖。以治疗肝癌为例：建立了人肿瘤细胞BALB/C裸鼠肝癌移植瘤模型，在裸鼠尾部皮下静脉分别注射1.0，2.0，4.0μg/g雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)。以静脉注射液用量每体重1.0μg/g，2.0μg/g，4.0μg/g雷氏大疣蛛毒素(抗癌蛋白)对肿瘤增长的抑瘤强度明显，与对照组相比，瘤重量、瘤体积、抑瘤率明显减少，具有显著性差异。
Claims (2)
1、一种雷氏大疣蛛毒素的药物应用，其特征是作为抗癌药物应用。
2、按权利要求1所述的雷氏大疣蛛毒素的药物应用，其特征是制成静脉注射液针剂作为抗肝癌药物应用。
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| CN105504039A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-04-20 | 湖南师范大学 | 一种抗癌活性蛋白及其应用 |
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