CN110804561A - 一种高产c6-c10乙基酯的酿酒酵母及其构建方法与用途 - Google Patents

一种高产c6-c10乙基酯的酿酒酵母及其构建方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产C6‑C10乙基酯的酿酒酵母及其构建方法与用途，属于生物工程技术领域。本发明通过在出发菌株中过表达乙醛脱氢酶ALD6和乙酰辅酶A合成酶ASC1强化乙酰辅酶A的合成、过表达乙酰辅酶A羧化酶ACC1**强化丙二酸单酰辅酶A、过表达脂肪酸合成酶FAS1和FAS2强化中链酰基辅酶A，使代谢流更多的流向中链酰基CoA，进一步外源引入草莓中的醇酰基转移酶基因SAAT，得到改造菌株C‑ald6acs1A*F1F2S，在发酵的条件下其己酸乙酯的产量为7.53mg/L，是出发菌株C‑ald6acs1A*F1F2的2.72倍，是原始出发株CA己酸乙酯产量的26.89倍(仅0.27mg/L)，而辛酸乙酯和癸酸乙酯的产量分别是13.65mg/L和13.89mg/L，较原始出发菌CA提高了9.11倍和7.27倍，对改善酒的风味和提高酒的品质具有潜在的应用前景。

Description

一种高产C6-C10乙基酯的酿酒酵母及其构建方法与用途
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种产 C6-C10乙基酯酿酒酵母及其构建方法与应用。
背景技术：
酯香物质是酒中主要的风味物质，较高的酯含量不仅赋予其重要的酯香，同 时能有效地扩张、松弛神经，可减少喝酒引起的副作用。C6-C10乙基酯是指己 酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯。C6-C10乙基酯则是所有香型中国白酒的重要呈 香物质，尤其是浓香型白酒和葡萄酒的特征芳香性物质。己酸乙酯、辛酸乙酯和 癸酸乙酯分别具有波萝香气味、苹果香气味和脂肪酸气味。因为酿酒酵母自身缺 乏相应的酰基CoA，以及缺乏特异性强的醇酰基转移酶，使中链乙基酯的合成 量很低。与乙酸酯相比较，乙基酯很不容易分泌到发酵液中，容易挥发，各种因 素导致乙基酯被检测到的含量一般都及其微量。一般在优质浓香型白酒中，己酸 乙酯的含量为0.4-2.2g/L；在优质白兰地中C6-C10乙基酯的含量均为0.300mg/L左右。所以提升这些典型的特征香气物质，是提高各类酒的品质，改善其风味的 关键。
大多数以纯种培养的酿酒酵母为主体微生物进行的发酵，其特点是发酵周期 短、原料出酒率高，但由于酿酒酵母产酯香物质的能力极低，致使成品酒品质较 差。高档饮料酒中酯香物质含量较高的主要原因是采用微生物制曲发酵，其中汉 逊酵母和假丝酵母等产乙酸乙酯能力较强，而产C6-C10乙基酯是根据酯化反应 原理，利用梭菌、乳酸菌、己酸菌和霉菌等生香微生物来提高酒中酸，与乙醇缓 慢反应生成C6-C10乙基酯。一方面，这些天然的产酯酵母和提供酯前体的微生 物都不具备产C6-C10乙基酯的能力。另一方面，野生菌群的存在严重影响了原 料出酒率，使酒精发酵效率不到酿酒酵母的三分之一，因而导致了高档酒耗粮高、 生产周期长、效率低、成本高。
近年来关于非酿酒酵母产酯的报导非常多，这些研究或者基于存在的己酸、 辛酸和癸酸，或者以酿酒酵母为主体的混菌发酵，并没有纯种酵母菌株发酵酿酒 原料产C6-C10乙基酯的研究报道，也没有在酿酒酵母产C6-C10乙基酯的代谢 途径上进行改造的研究。作为中国白酒和葡萄酒等酒中的基础风味物质，微生物 产酯尤其是对C6-C10乙基酯的研究更需走在前面。构建高产C6-C10乙基酯酿 酒酵母菌株，使其在发酵过程中保持优良酒精发酵特性的同时生产基础酯香物质 C6-C10乙基酯，对于白酒和葡萄酒产品风味特征维持与强化，对于质量提高与 稳定，乃至发酵工艺改革，都具有重要意义。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明提供一种产C6-C10乙基酯酿酒酵母基因工 程菌株，所述菌株是以酿酒酵母为出发菌株，通过同时过表达乙醛脱氢酶基因 ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1*、脂肪酸 合成酶基因FAS1和FAS2，并同时异源过表达醇酰基转移酶基因SAAT构建而成 的菌株。
优选地，所述乙醛脱氢酶基因ALD6来源于酿酒酵母，其Gene ID为：856044， 核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述乙酰辅酶A合成酶基因ACS1来源于酿酒酵母，其Gene ID为： 851245，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1*，其Gene ID为：855750，核 苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:3所示。
所述乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1*来源于酿酒酵母，并经过密码子优化， 突变547和1157两个碱基位点。
优选地，所述脂肪酸合成酶基因FAS1和FAS2来源于酿酒酵母，脂肪酸合 成酶基因FAS1的Gene ID为：853653，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:4所示；脂肪酸合成酶基因FAS2的Gene ID为855845，核苷酸序列如核苷 酸序列表中SEQ ID NO:5所示。
优选地，所述醇酰基转移酶基因SAAT来源于草莓。
优选地，所述醇酰基转移酶基因SAAT，其蛋白ID为AAG13130.1。
优选地，所述醇酰基转移酶基因的核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:6所示。
优选地，所述C6-C10乙基酯为己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯。
优选地，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)出发菌株为酿酒酵母CA， 菌种保藏编号为CGMCC No.18670。
将所述酿酒酵母出发菌株用YEPD培养基进行活化培养，然后用珠磨法提取 基因组，进行16S rDNA测序，得知该菌株的序列与已公布的酿酒酵母 Saccharomycescerevisiae、S288C等16Sr DNA序列血缘关系最近，同源性达到 100％，我们将酿酒酵母菌株确定为酿酒酵母，命名为酿酒酵母CA，参照附图1 的CA菌株的***发育树。
所述酿酒酵母CA的分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于 2019年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏编号为CGMCCNo.18670，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明的另一目的是提供一种高产C6-C10乙基酯酿酒酵母基因工程菌株的 构建方法：所述乙醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1通过串联 共同替换半乳糖的转录调节因子的编码基因Gal80，并用强启动子PGK1P和 TEF1P分别过表达基因ALD6和基因ACS1；
同时所述乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1*替换磷脂酸磷酸酯酶的编码基因 LPP1，并用强启动子TEF1P过表达基因ACC1*；
同时所述脂肪酸合成酶基因FAS1和FAS2通过串联共同替换己糖载运蛋白 酶基因HXT16，并用强启动子PGK1P和TEF1P分别过表达基因FAS1和FAS2；
同时所述异源醇酰基转移酶基因SAAT替换乙酸异戊酯氢化酶基因IAH1， 并用强启动子PGK1P过表达基因SAAT。
所述Gal80基因Gene ID为：854954。
所述LPP1基因Gene ID为：852114。
所述HXT16基因Gene ID为：853623。
所述IAH1基因Gene ID为：854293。
优选地，所述产C6-C10乙基酯酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，包括如 下步骤：
(1)以酿酒酵母为出发菌株，以基因Gal80为整合位点，将基因Gal80的 上游同源臂片段GA、启动子TEF1P、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、终止子MFA2T、 乙醛脱氢酶基因ALD6、KanMX以及基因Gal80的下游同源臂片段GB按顺序依 次连接并***到整合位点上，同源重组后再用pGAPza质粒去除KanMX基因， 传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株；
(2)以基因LPP1为整合位点，将基因LPP1的上游同源臂LA、ACC1*基 因片段、KanMX和基因LPP1的下游同源臂LB按顺序依次连接并***到整合位 点上，同源重组后再用pGAPza质粒去除KanMX基因，传代得到不含pGAPza 质粒的重组菌株；
(3)以基因HXT16为整合位点，将基因HXT16的上游同源臂HA、启动子 PGK1P、基因FAS1、终止子PGK1T、启动子TEF1P、基因FAS2、终止子MFA2T、 Kan、基因HXT16的下游同源臂HB按顺序依次连接并***到整合位点上，同源 重组后再用pGAPza质粒去除KanMX基因，传代得到不含pGAPza质粒的重组 菌株；
(4)以基因IAH1为整合位点，将基因IAH1上游同源臂IA、基因SAAT、 KanMX、基因IAH1下游同源臂IB按顺序依次连接并***到整合位点上，同源 重组后再用pGAPza质粒去除KanMX基因，传代得到不含pGAPza质粒的重组 菌株。
更优选地，所述产C6-C10乙基酯酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，包括 如下步骤：
(1)强化乙酰辅酶A产C6-C10乙基酯酿酒酵母菌株的构建
1)以出发酵母菌株基因组作为模板，以转录调节因子基因Gal80为整合位 点通过PCR方法分别获得含有前后基因同源序列的片段：基因Gal80的上游同 源臂片段GA、基因Gal80的下游同源臂片段GB、启动子TEF1P、乙酰辅酶A 合成酶基因ACS1以及终止子MFA2T；
2)使用融合PCR方法将片段GA和TEF1P融合，片段ACS1和MFA2T融合， 得到两个融合片段GA-TEF1P和ACS1-MFA2T；
3)使用融合PCR方法将融合片段GA-TEF1P和ACS1-MFA2T进行进一步的 融合得到融合片段GA-TEF1P-ACS1-MFA2T；
4)以质粒Yep352-PAK6为模板，设计引物(GA)PGK1P-U/PGK1T-D(Kan)， 通过PCR方法扩增得到PGK1P-ALD6-PGK1T片段；
5)以质粒pUG6为模板，PCR扩增得到KanMX基因；
6)使用融合PCR方法将片段KanMX和GB进行融合，得到融合片段 KanMX-GB；
7)将PCR得到带相邻片段同源区的上述片段：GA-TEF1P-ACS1-MFA2T、PGK1P-ALD6-PGK1T和KanMX-GB，经过醋酸锂化学转化，以基因Gal80为整合 位点，导入出发酿酒酵母菌株中，片段按照顺序依次连接***到整合位点上，同 源重组后得到产C6-C10乙基酯的酿酒酵母重组菌株1；
8)用pGAPza质粒去除步骤7)获得菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX 基因的重组菌株C-ald6acs1，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株C-ald6acs1。
(2)强化丙二酸单酰辅酶A产C6-C10乙基酯酿酒酵母菌株的构建
1)以出发酵母菌株基因组作为模板，以基因LPP1为整合位点通过PCR方 法分别获得作为基因LPP1的上游同源臂LA片段和下游同源臂LB片段；
2)以含密码子优化的ACC1*表达盒的质粒pAD为模板，设计引物(LA) PGK1P-U/ADH1T-D(Kan)扩增得到PGK1P-ACC1*-ADH1T片段；
3)以质粒pUG6为模板，PCR扩增得到KanMX基因；
4)将PCR得到带相邻片段同源区的上述片段：LA、PGK1P-ACC1*-ADH1T、 KanMX和LB，经过醋酸锂化学转化，以基因LPP1为整合位点，导入步骤(1) -8)得到的重组菌株C-ald6acs1中，片段按照顺序依次连接***到整合位点上， 同源重组后得到产C6-C10乙基酯的酿酒酵母重组菌株2；
5)用pGAPza质粒去除步骤4)获得菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX 基因的重组菌株C-ald6acs1A*，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株 C-ald6acs1A*。
(3)强化中链酰基辅酶A产C6-C10乙基酯酿酒酵母菌株的构建
1)以出发酵母菌株基因组作为模板，以基因HXT16为整合位点通过PCR 方法分别获得含有前后基因同源序列的片段：基因HXT16的上游同源臂的HA 片段以及基因HXT16的下游同源臂的HB片段、启动子PGK1P、基因FAS1、 终止子PGK1T、启动子TEF1P、基因FAS2、终止子MFA2T；
2)以质粒pUG6为模板，PCR扩增得到KanMX基因；
3)使用融合PCR方法将片段HA和PGK1P融合，得到融合片段HA-PGK1P， 将片段FAS1和PGK1T融合，得到融合片段FAS1-PGK1T，将片段TEF1P和FAS2 以及MFA2T融合，得到融合片段TEF1P-FAS2-MFA2T，将片段KanMX和HB融 合，得到融合片段Kan-HB；
4)将PCR得到带相邻片段同源区的上述片段：HA-PGK1P、FAS1-PGK1T、 TEF1P-FAS2-MFA2T和Kan-HB，经过醋酸锂化学转化，以基因HXT16为整合位 点，导入步骤(2)-5)得到的重组菌株C-ald6acs1A*中，片段按照顺序依次连 接***到整合位点上，同源重组后得到产C6-C10乙基酯的酿酒酵母重组菌株3；
5)用pGAPza质粒去除步骤4)获得菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX 基因的重组菌株C-ald6acs1A*F1F2，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株 C-ald6acs1A*F1F2。
(4)引入醇酰基转移酶SAAT产C6-C10乙基酯酿酒酵母菌株的构建
1)以出发酵母菌株基因组作为模板，IAH1为整合位点通过PCR方法分别 获得作为基因IAH1上游同源臂的IA片段和基因IAH1下游同源臂的IB片段；
2)以质粒Yep352-PGK(SAAT)为模板，扩增得到PGK1P-SAAT-PGK1T片段；
3)以质粒pUG6为模板，PCR扩增得到KanMX基因；
4)将PCR得到带相邻片段同源区的上述片段：IA、PGK1P-SAAT-PGK1T、 KanMX和IB经过醋酸锂化学转化，以基因IAH1为整合位点，导入步骤(3)-5) 得到的重组菌株C-ald6acs1A*F1F2中，片段按照顺序依次连接***到整合位点 上，同源重组后得到产C6-C10乙基酯的酿酒酵母重组菌株4；
5)用pGAPza质粒去除步骤4)获得菌株中的KanMX基因，获得不含KanMX 基因的重组菌株4，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株C-ald6acs1A*F1F2S。
所述启动子PGK1P其Gene ID为：850370，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；
所述启动子TEF1P其Gene ID为：856195，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。
所述重组菌株可通过上述方法构建，所涉及具体操作方法已有很多文献报 道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。
所述启动子PGK1P、TEF1P来源于专利：CN108642095B《一种酿酒酵母菌 株高产乳酸乙酯的新途径及其应用》。
所述步骤(1)中，质粒Yep352-PAK6来源于文献郑楠.低产高级醇酿酒酵 母菌株的构建及应用研究[D].2018。
所述步骤(2)-2)中，含密码子优化的ACC1*表达盒的质粒pAD的构建过 程来源于文章Shi S,Chen Y,Siewers V,et al.Improving Production of Malonyl Coenzyme A-Derived Metabolites by Abolishing Snf1-Dependent Regulation of Acc1[J].mBio,2014,5(3):e01130-14-e01130-14.文章第3页。
所述步骤(4)中，Yep352-PGK质粒的构建过程来源于文章：刘港.产乳酸 乙酯酿酒酵母菌株的选育[D].2018.
本发明的另一目的是提供所述高产C6-C10乙基酯的酿酒酵母基因工程菌株 的用途。
优选地，所述用途为所述酿酒酵母基因工程菌株在发酵酿造、制备发酵食品、 制备香精香料过程中高产己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的用途。
更优选地，所述发酵酿造过程为发酵酿酒、发酵酿造醋、发酵酿造酱油的过 程。
有益效果：
1、本发明中通过过表达乙醛脱氢酶的编码基因ALD6和乙酰辅酶A合成酶 的编码基因ACS1强化乙酰辅酶A的合成；其次过表达乙酰辅酶A羧化酶的编 码基因ACC1*强化丙二酸单酰辅酶A的合成；然后过表达脂肪酸合成酶的编码 基因FAS1和FAS2强化中链酰基辅酶A的合成，实现C6-C10乙基酯生成量的有 效提高；最后再过表达外源的醇酰基转移酶的编码基因SAAT，进一步提高酿酒 酵母菌株的C6-C10乙基酯的生成量。
本发明主要是在酵母中对C6-C10乙基酯的合成进行了强化，有目的的首先 通过强化C6-C10乙基酯合成的底物乙酰CoA，进一步将底物乙酰CoA催化生 成C6-C10酰基CoA，最终在特异性较强的醇酰基转移酶基因SAAT的催化下催 化C6-C10酰基CoA与乙醇发生反应生成C6-C10乙基酯，目前尚无在酵母菌株 中构建强化特异的催化C6-C10乙基酯的报道且合成途径中这些基因并不是简单 的叠加，是经过复杂的实验筛选得到产量较优的组合。
对细胞原本高度进化的代谢途径进行改造，如对途径中及个别基因进行表 达，往往会引起代谢流不平衡，易导致中间产物的积累和途径中酶的过度合成。 而本发明基于代谢途径中各酶促步骤的相互依赖性，需要从全局考虑进行代谢途 径优化，寻找到了最适的途径平衡状态。对途径中所有酶类进行多表达水平下的 全组合优化应该是最全面的途径优化策略。
本发明提供的高产C6-C10乙基酯酿酒酵母在保持良好发酵性能的前提下， 通过强化乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、中链酰基辅酶A的合成，生产的C6-C10 乙基酯的产量提高40％以上，将外源醇酰基转移酶基因引入后，实现己酸乙酯含 量较出发菌提高了26.89倍、辛酸乙酯提高了9.11倍、癸酸乙酯提高了7.27倍， 为酿造出风味优良且更有利于健康的白酒及葡萄酒等奠定了理论基础，具有广阔 的市场前景。
2、玉米浓醪发酵4天后，亲本菌株产C6-C10乙基酯能力较低，同时整合 过表达乙醛脱氢酶基因ALD6和乙酰辅酶A合成酶基因ACS1后，己酸乙酯、辛 酸乙酯和癸酸乙酯产量分别为0.78mg/L、8.45mg/L和7.87mg/L；整合过表达乙 酰辅酶A羧化酶基因ACC1*后，己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯产量分别为 1.48mg/L、9.32mg/L和9.48mg/L；整合过表达乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1* 后，己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯产量分别为1.48mg/L、9.32mg/L和9.48mg/L； 继续整合过表达脂肪酸合成酶基因FAS1和FAS2，己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙 酯产量分别为2.97mg/L、11.19mg/L和11.32mg/L；最后引入醇酰基转移酶基因 SAAT，己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯产量分别为7.53mg/L、13.65mg/L和13.89 mg/L。
此外，本发明中，重组菌株的酒精含量和残糖含量与出发菌株相比没有明显 差别，本发明中的涉及转录调节因子的编码基因Gal80、磷脂酸磷酸酯酶的编码 基因LPP1、HXT16基因、IAH1基因的敲除和过表达乙醛脱氢酶基因ALD6、乙 酰辅酶A合成酶基因ACS1、乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1*、脂肪酸合成酶基 因FAS1和FAS2，以及异源过表达醇酰基转移酶基因SAAT的操作不会对菌株基 本发酵性能有不利影响。
3、本发明选育得到的酵母菌株通过Cre/LoxP***完全剔除了KanMX抗性 基因，不含外源抗性基因，可以安全的用于工业生产，有广泛的应用前景。
附图说明
图1为CA菌株的***发育树；
图2为胞内整合乙醛脱氢酶ALD6及乙酰辅酶A合成酶ACS1的同源重组过 程；
图3为胞内整合ALD6和ACS1重组子的PCR验证：
其中：(a)中M为DL5000bp DNA Marker，1为以重组菌株C-ald6acs1基 因组作为模板，引物对D1–U/D1-D的PCR扩增结果；2为以出发菌株基因组作 为模板，引物对D1–U/D1-D的PCR扩增结果；
(b)中M为DL5000bp DNA Marker，1为以重组菌株C-ald6acs1基因组作为模 板，引物对D2-U/D2-D的PCR扩增结果；2为以出发菌株基因组作为模板，引 物对D2-U/D2-D的PCR扩增结果；
(c)中M为DL5000bp DNA Marker，1为以重组菌株C-ald6acs1基因组作为模 板，引物对D3-U/D3-D的PCR扩增结果；2为以出发菌株基因组作为模板，引 物对D3-U/D3-D的PCR扩增结果。
图4为KanMX抗性基因的丢除及pGAPza质粒的丢失验证电泳图：
其中：(a)中M为marker；1为以菌株丢KanMX前的基因组为模板，2 为以丢KanMX后的基因组为模板，以Kr-U/Kr-D为引物，PCR扩增验证片段； (b)中M为marker；1、2为以传代前的重组菌株的基因组为模板，3为以传代 后的重组菌株的基因组为模板，以Zeocin-U/Zeocin-D为引物，PCR扩增验证片 段。
图5为胞内整合乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1*的同源重组过程；
图6为胞内整合ACC1*重组子的PCR验证：
其中：(a)中M为DL5000bp DNA Marker，1为以重组菌株C-ald6acs1A* 基因组作为模板，引物对D4-U/D4-D的PCR扩增结果；2为以出发菌株C-ald6acs1 基因组作为模板，引物对D4-U/D4-D的PCR扩增结果；
(b)中M为DL5000bp DNA Marker，1为以重组菌株C-ald6acs1A*基因组作为 模板，引物对D5-U/D5-D的PCR扩增结果；2为以出发菌株C-ald6acs1基因组 作为模板，引物对D5-U/D5-D的PCR扩增结果；
(c)中M为DL5000bp DNA Marker，1为以重组菌株C-ald6acs1A*基因组作为 模板，引物对D6-U/D6-D的PCR扩增结果；2为以出发菌株C-ald6acs1基因组 作为模板，引物对D6-U/D6-D的PCR扩增结果。
图7为胞内整合脂肪酸合成酶FAS1和FAS2的同源重组过程；
图8为胞内整合FAS1和FAS2重组子的PCR验证：
其中：(a)中M为DL5000bp DNA Marker，1为以重组菌株C-ald6acs1A*F1F2 基因组作为模板，引物对D7-U/D7-D的PCR扩增结果；2为以出发菌株 C-ald6acs1A*基因组作为模板，引物对D7-U/D7-D的PCR扩增结果；
(b)中M为DL5000bp DNA Marker，1为以重组菌株C-ald6acs1A*F1F2基因 组作为模板，引物对D8-U/D8-D的PCR扩增结果；2为以出发菌株C-ald6acs1A* 基因组作为模板，引物对D8-U/D8-D的PCR扩增结果；
(c)中M为DL5000bp DNA Marker，1为以重组菌株C-ald6acs1A*F1F2基因组 作为模板，引物对D9-U/D9-D的PCR扩增结果；2为以出发菌株C-ald6acs1A* 基因组作为模板，引物对D9-U/D9-D的PCR扩增结果。
图9为胞内整合醇酰基转移酶SAAT的同源重组过程；
图10为胞内整合SAAT重组子的PCR验证：
其中：(a)中M为DL10000bp DNA Marker，1为以重组菌株 C-ald6acs1A*F1F2S基因组作为模板，引物对D10-U/D10-D的PCR扩增结果；2 为以出发菌株C-ald6acs1A*F1F2基因组作为模板，引物对D10-U/D10-D的PCR 扩增结果；
(b)中M为DL10000bp DNA Marker，1为以重组菌株C-ald6acs1A*F1F2S基 因组作为模板，引物对D11-U/D11-D的PCR扩增结果；2为以出发菌株 C-ald6acs1A*F1F2基因组作为模板，引物对D11-U/D11-D的PCR扩增结果；
(c)中M为DL10000bp DNA Marker，1为以重组菌株C-ald6acs1A*F1F2S基 因组作为模板，引物对D12-U/D12-D的PCR扩增结果；2为以出发菌株 C-ald6acs1A*F1F2基因组作为模板，引物对D12-U/D12-D的PCR扩增结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术 手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而 非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域 技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料 成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所使用的酿酒酵母是可以采用任何来源的酿酒酵母菌株，以下实施例 所使用的酵母菌株均为酿酒酵母CA，菌种保藏编号为CGMCC No.18670。
实施例1：高产C6-C10乙基酯酿酒酵母菌株的构建
本实例所用的出发菌株为安琪酵母中的酿酒酵母CA，菌种保藏编号为 CGMCCNo.18670。所述大肠杆菌DH5a购自Takara公司。所述YPD培养基为 通用的完全培养基，固体培养基含2％进口琼脂粉。
菌株主要构建过程如下：
(1)强化乙酰辅酶A合成以产C6-C10乙基酯酿酒酵母菌株的构建
以酵母菌株CA的基因组为模板，Gal80作为整合位点，用引物对GA-U(SEQ ID NO:9)和GA-D(SEQ ID NO:10)PCR扩增得到大小为549bp带启动子TEF1P同源区的上同源臂GA片段；用引物对GB-U(SEQ ID NO:11)和GB-D(SEQ ID NO:12)PCR扩增得到大小为502bp带筛选标记Kan同源区的下同源臂GB片段； 用引物对TEF1P-U(SEQ ID NO:13)和TEF1P-D(SEQ IDNO:14)PCR扩增得 到大小为1000bp的带GA和ACS1同源区的启动子TEF1p片段；用引物对MFA2T-U(SEQ ID NO:15)和MFA2T-D(SEQ ID NO:16)PCR扩增得到大小为 466bp的带ACS1和PGK1P同源区的终止子MFA2T片段；用引物对ACS1-U(SEQ ID NO:17)和ACS1-D(SEQ ID NO:18)PCR扩增得到大小为2142bp的带TEF1P和MFA2T同源区的乙酰CoA合成酶基因ACS1；以质粒Yep352-PAK6为模板， 用引物对PGK1P-U(SEQ ID NO:19)和PGK1T-D(SEQ ID NO:20)PCR扩增得 到大小为3240bp的带MFA2T和Kan同源区的PGK1P-ALD6-PGK1T片段；以pUG6 质粒为模板，用引物对Kan-U(SEQ ID NO:21)和Kan-D(SEQ ID NO:22)PCR 扩增得到大小为1613bp带PGK1T和GB同源区的Kan片段。使用融合PCR方 法，将片段GA与TEF1P进行融合PCR得到GA-TEF1P片段，ACS1与MFA2T融合得到ACS1-MFA2T片段，进一步融合片段GA-TEF1P和ACS1-MFA2T得到 4157bp的GA-TEF1P-ACS1-MFA2T片段。将Kan和GB进行融合PCR得到2115bp 的Kan-GB片段。将GA-TEF1P-ACS1-MFA2T、PGK1P-ALD6-PGK1T和KanMX-GB 经过醋酸锂化学转化分别导入出发酵母菌株中，同源重组后得到产C6-C10乙基 酯的酿酒酵母重组菌株1，同源重组过程如图2所示。
重组酿酒酵母菌株的验证：
根据酿酒酵母重组位点两端的基因序列和***的同源重组序列，分别设计三 组上、中、下游引物，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证 重组子。引物序列如表1：
表1引物序列
Figure BDA0002257152850000111
Figure BDA0002257152850000121
分别以引物D1-U/D1-D、D2-U/D2-D和D3-U/D3-D进行上中下游定点PCR 验证，其中上游引物D1-U/D1-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到 一条1000bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；中游引物D2-U/D2-D的 PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条1900bp左右的特异性条带，其 大小与预期一致；下游引物D3-U/D3-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳， 可看到一条2300bp左右的特异性条带，其大小与预期一致，出发菌的阴性对照 无条带，说明GA-TEF1P-ACS1-MFA2T-PGK1P-ALD6-PGK1T-KanMX-GB片段已成功重组到酿酒酵母基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图3所示，为重 组酿酒酵母验证结果。
图3中M为5000bp DNA Ladder Marker，其中(a)中，泳道1为出发菌的 上游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株1上游定点验证PCR产物；(b)中 泳道1为出发菌的中游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌株1中游定点验证 PCR产物；(c)中泳道1为出发菌的下游定点验证阴性对照；泳道2为重组菌 株1下游定点验证PCR产物。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株1 中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落 于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在 G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以基因组为模板扩 增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株1则能扩增得到该片 段，PCR验证结果如图4(a)所示。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体 培养基中进行传代培养，每12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失， 得到不含pGAPza质粒的重组菌株C-ald6acs1，提取酵母质粒，以 Zeocin-F/Zeocin-R(SEQ IDNO:23/24)为引物进行PCR验证如图4(b)所示。
(2)强化丙二酸单酰辅酶A合成以产C6-C10乙基酯酿酒酵母菌株的构建
以酵母菌株CA的基因组为模板，LPP1作为整合位点，用引物对LA-U(SEQ ID NO:25)和LA-D(SEQ ID NO:26)PCR扩增得到大小为468bp带PGK1P同 源区的上游同源臂LA；用引物对LB-U(SEQ ID NO:27)和LB-D(SEQ ID NO:28) PCR扩增得到大小为428bp带KanMX同源区的下游同源臂LB；以购买的含 ACC1**表达盒的质粒pAD为模板，设计引物对LPGK1P-U(SEQ ID NO:29)和 ADH1T-D(SEQ ID NO:30)PCR扩增得到大小为7849bp带LA和KanMX同源区的PGK1P-ACC1*-ADH1T片段，以pUG6质粒为模板，用引物对LKan-U(SEQ ID NO:31)和LKan-D(SEQ ID NO:32)PCR扩增得到大小为1613bp带ADH1T和LB同源区的KanMX片段。
以上PCR得到的四个片段LA、PGK1P-ACC1*-ADH1T、KanMX和LB用醋 酸锂转化法同时转化入(1)步骤得到的菌株C-ald6acs1中，经过胞内整合后获 得同源重组后的酿酒酵母单倍体重组菌株2。同源重组过程如图5所示。
重组酿酒酵母的验证：
根据酿酒酵母重组位点两端的基因序列和***的同源重组序列，分别设计上 中下游验证引物，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证重组 菌株。引物序列如表2：
表2引物序列
Figure BDA0002257152850000131
分别以引物D4-U/D4-D、D5-U/D5-D和D6-U/D6-D进行上中下游定点PCR 验证，其中上游引物D4-U/D4-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到 一条1000bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；中游引物D5-U/D5-D的 PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条1800bp左右的特异性条带，其 大小与预期一致；下游引物D6-U/D6-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳， 可看到一条2200bp左右的特异性条带，其大小与预期一致，其大小与预期一致， 改造菌C-ald6acs1的阴性对照无条带，说明重组盒 LA-PGK1P-ACC1*-ADH1T-KanMX-LB片段已成功重组到酿酒酵母C-ald6acs1基 因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图6所示，为重组酿酒酵母验证结果。
图6中(a)中M为5000bpDNA Ladder Marker，其中泳道1为重组菌株2 上游定点验证PCR产物；泳道2为菌株C-ald6acs1的上游定点验证阴性对照； (b)中M为5000bp DNALadder Marker，其中泳道1为重组菌株2中游定点验 证PCR产物；泳道2为菌株C-ald6acs1的中游定点验证阴性对照；(c)中M 为5000bp DNA Ladder Marker，其中泳道1为重组菌株2下游定点验证PCR产 物；泳道2为菌株C-ald6acs1的下游定点验证阴性对照。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株2 中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落 于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在 G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以其基因组作为模 板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株2则能扩增得到 该片段。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每 12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株C-ald6acs1A*，提取酵母质粒进行PCR验证。
(3)强化中链酰基辅酶A合成以产C6-C10乙基酯酿酒酵母菌株的构建
以酵母菌株CA的基因组为模板，实验以HXT16为整合位点，用启动子PGK1P和PGK1T终止子对FAS1基因进行过表达，用启动子TEF1P和MFA2T终止子对 FAS2基因进行过表达。实验对原始菌株CA进行基因组精提以作为PCR模板， 设计引物对HA-U(SEQ ID NO:33)和HA-D(SEQ ID NO:34)PCR扩增得到大 小为531bp带PGK1P同源区的上游同源臂HA片段；设计引物对HPGK1P-U(SEQ ID NO:35)和HPGK1P-D(SEQ ID NO:36)PCR扩增得到大小为1479bp的带 HA和FAS1同源区的PGK1P片段；设计引物对FAS1-U(SEQ ID NO:37)和FAS1-D (SEQ ID NO:38)PCR扩增得到大小为6156bp的带PGK1P和PGK1T同源区的 FAS1片段；设计引物对HPGK1T-U(SEQ ID NO:39)和HPGK1T-D(SEQ ID NO:40)PCR扩增得到大小为258bp的带FAS1和TEF1P同源区的PGK1T片段； 设计引物对HTEF1P-U(SEQ ID NO:41)和HTEF1P-D(SEQ ID NO:42)PCR扩增得到大小为1000bp的带PGK1T和FAS2同源区的TEF1P片段；设计引物对 FAS2-U(SEQ IDNO:43)和FAS2-D(SEQ ID NO:44)PCR扩增得到大小为6554bp 的带TEF1P和MFA2T同源区的FAS2片段；设计引物对HMFA2T-U(SEQ ID NO:45)和HMFA2T-D(SEQ ID NO:46)PCR扩增得到大小为470bp的带FAS2 和KanMX同源区的MFA2T片段；设计引物对HKan-U(SEQ ID NO:47)和HKan-D (SEQ ID NO:48)PCR扩增得到大小为1613bp的带MFA2T和HB同源区的Kan 片段；设计引物对HB-U(SEQ ID NO:49)和HB-D(SEQ ID NO:50)PCR扩增 得到大小为686bp的带KanMX同源区的HB片段。为了提高同源重组的效率， 利用融合PCR方法，将片段HA与PGK1P、PGK1T与TEF1P、MFA2T与Kan以 及HB分别进行融合得到2010bp的HA-PGK1P片段、1258bp的PGK1T-TEF1P片段、2769bp的MFA2T-KanMX-HB片段。将片段HA-TEF1P、FAS1、 PGK1T-TEF1P、FAS2和MFA2T-KanMX-HB经过醋酸锂化学转化法同时转化入(2) 步骤得到的菌株C-ald6acs1A*中，经过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母单 倍体重组菌株3。同源重组过程如图7所示。
重组酿酒酵母菌株的验证：
根据酿酒酵母重组位点两端的基因序列和***的同源重组序列，分别设计三 组上、中、下游引物，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证 重组子。引物序列如表3：
表3引物序列
Figure BDA0002257152850000151
分别以引物D7-U/D7-D、D8-U/D8-D和D9-U/D9-D进行上中下游定点PCR 验证，其中上游引物D7-U/D7-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到 一条1500bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；中游引物D8-U/D8-D的 PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条700bp左右的特异性条带，其 大小与预期一致；下游引物D9-U/D9-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳， 可看到一条2500bp左右的特异性条带，其大小与预期一致，出发菌的阴性对照 无条带，说明HA-TEF1P-FAS1-PGK1T-TEF1P-FAS2-MFA2T-Kan-HB片段已成功重组到酿酒酵母C-ald6acs1A*基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果如图8 所示，为重组酿酒酵母验证结果。
图8中(a)中M为5000bpDNA Ladder Marker，其中泳道1为重组菌株3 上游定点验证PCR产物；泳道2为菌株C-ald6acs1A*的上游定点验证阴性对照； (b)中M为5000bp DNALadder Marker，其中泳道1为重组菌株3中游定点验 证PCR产物；泳道2为菌株C-ald6acs1A*的中游定点验证阴性对照；(c)中M 为5000bp DNA Ladder Marker，其中泳道1为重组菌株3下游定点验证PCR产 物；泳道2为菌株C-ald6acs1A*的下游定点验证阴性对照。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株3 中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落 于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在 G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以其基因组作为模 板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株3则能扩增得到 该片段。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每 12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株C-ald6acs1A*F1F2，提取酵母质粒进行PCR验证。
(4)引入醇酰基转移酶SAAT以产C6-C10乙基酯酿酒酵母菌株的构建
以酵母菌株CA的基因组为模板，实验以IAH1为整合位点，通过用强启动 子PGK1P和PGK1T终止子对SAAT基因进行过表达。设计引物对IA-U(SEQ ID NO:51)和IA-D(SEQ IDNO:52)PCR扩增得到大小为626bp的带PGK1P同源 区的上同源臂IA片段；设计引物对IB-U(SEQ ID NO:53)和IB-D(SEQ ID NO:54) PCR扩增得到大小为552bp的带KanMX同源区的下同源臂IB片段；以质粒 Yep352-PGK(SAAT)为模板，设计引物对IPGK1P-U(SEQ ID NO:55)和IPGK1T-D (SEQ ID NO:56)PCR扩增得到大小为3096bp的带IA和KanMX同源区的 PGK1P-SAAT-PGK1T片段；以质粒pUG6为模板，设计引物对IKan-U(SEQ ID NO:57)和Kan-D(IB)(SEQID NO:58)PCR扩增得到大小为1613bp的带PGK1T和IB同源区的KanMX片段。将片段IA、PGK1P-SAAT-PGK1T、KanMX和IB经 过醋酸锂化学转化法同时转化入(3)步骤得到的菌株C-ald6acs1A*F1F2中，经 过胞内整合后获得同源重组后的酿酒酵母单倍体重组菌株4。同源重组过程如图 9所示。
重组酿酒酵母菌株的验证：
根据酿酒酵母重组位点两端的基因序列和***的同源重组序列，分别设计三 组上、中、下游引物，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证 重组子。引物序列如表4：
表4引物序列
Figure BDA0002257152850000171
分别以引物D10-U/D10-D、D11-U/D11-D和D12-U/D12-D进行上中下游定 点PCR验证，其中上游引物D10-U/D10-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电 泳，可看到一条1500bp左右的特异性条带，其大小与预期一致；中游引物 D11-U/D11-D的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条1800bp左右 的特异性条带，其大小与预期一致；下游引物D12-U/D12-D的PCR产物经0.8％ 的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条2200bp左右的特异性条带，其大小与预期一致， 出发菌的阴性对照无条带，说明IA-PGK1P-SAAT-PGK1T-KanMX-IB片段已成功 重组到酿酒酵母C-ald6acs1A*F1F2基因组中，并且重组位置也正确。电泳结果 如图10所示，为重组酿酒酵母验证结果。
图10中(a)中M为10000bpDNA Ladder Marker，其中泳道1为重组菌株 4上游定点验证PCR产物；泳道2为菌株C-ald6acs1A*F1F2的上游定点验证阴 性对照；(b)中M为10000bp DNA Ladder Marker，其中泳道1为重组菌株4 中游定点验证PCR产物；泳道2为菌株C-ald6acs1A*F1F2的中游定点验证阴性 对照；(c)中M为10000bp DNA Ladder Marker，其中泳道1为重组菌株4下 游定点验证PCR产物；泳道2为菌株C-ald6acs1A*F1F2的下游定点验证阴性对 照。
通过醋酸锂转化的方法将带有Cre重组酶的pGAPza质粒化转于重组菌株4 中获得转化子；挑取单克隆在半乳糖培养基中诱导4-5h，稀释涂布，挑出单菌落 于YEPD平板上，再影印到G418抗性平板上；挑出在YEPD平板上生长而在 G418抗性平板上不生长的菌株，提取基因组进行PCR验证，以其基因组作为模 板扩增KanMX片段，无法得到1600bp左右的条带，而重组菌株4则能扩增得到 该片段。将验证正确的酵母单菌落接到YEPD液体培养基中进行传代培养，每 12h转接一次，传数代之后pGAPza质粒即可丢失，得到不含pGAPza质粒的重组菌株C-ald6acs1A*F1F2S，提取酵母质粒进行PCR验证。
整个过程所用引物的序列如表5。
表5
Figure BDA0002257152850000181
Figure BDA0002257152850000191
实施例2：产C6-C10乙基酯酿酒酵母菌株的玉米浓醪发酵实验
1)发酵工艺过程具体为：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷却→接菌→发酵 →蒸酒→测定指标；
2)工艺条件
浸泡条件：60～70℃，浸渍20min；液化条件：85～90℃，加入耐高温α-淀 粉酶，液化90min；糖化条件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20h；
3)配料：玉米粉1500g，水4500mL，静置放置20min，耐高温α-淀粉酶 2×104U/mL,0.9ml，糖化酶1×105U/mL,3mL。
4)培养基配置
一级种子培养基：8°Brix玉米水解液，加入0.5％的酵母浸粉，分装5mL于 试管，煮沸10min以灭菌。
二级种子培养基：12°Brix玉米水解液，加入0.5％的酵母浸粉，分装45mL 于150mL三角瓶，105℃灭菌15min。
发酵用的玉米浓醪培养基：首先量取130mL65℃的水至锥形瓶中，按照1:2.5 的体积比加入60g玉米渣，计时20min；其次将锥形瓶转移至90℃的水浴锅中， 加入60μL α-淀粉酶的同时开始搅拌1.5h；然后再将水浴锅调至60℃，向玉米 渣里面加入100μL糖化酶和酵母生长所需的营养盐1mL(MgSO4 150g/L、 KH2PO4 75g/L、尿素81g/L，过滤，4℃保存)。待糖度为25°Brix左右需要糖 化30min；最后将水浴锅调至40℃，加入现配的1.2mL酸性蛋白酶，计时20 min即得到浓醪培养基。
5)玉米浓醪白酒发酵：分别挑取出发酵母菌株CA和重组菌株C-ald6acs1、 C-ald6acs1A*、C-ald6acs1A*F1F2和C-ald6acs1A*F1F2S各1环，接入5mL一 级种子玉米水解液培养基中，30℃静置培养24h。将一级培养物全部转入装有 45mL二级种子玉米水解液培养基中，30℃静置培养约16h，测定菌液的吸光值， 取相应的体积换算成相同的菌体数量接种到配制好的130mL发酵培养基中。 30℃培养箱静置发酵，每隔12h称重一次，发酵结束后分别测定CO2总失重、 酒精度、还原糖及酯类含量。
如表6所示，发酵5天后，重组菌株的酒精含量和残糖含量与出发菌株相比 没有明显差别，可见本例中的基因敲除和过表达的操作不会对菌株基本发酵性能 有不利影响。
表6亲本菌株和重组菌株的发酵性能测定
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
6)C6-C10乙基酯生成量的气质联用仪的测定方法
顶空固相微萃取预处理酒样：首先将3g NaCl加入到20mL顶空萃取瓶中， 然后向酒样里面加入内标物质定容后取8mL酒样加入。将磁力搅拌器调至60℃， 500r/min,平衡30min后，手动***50/30μm PDMS/DVB萃取头进行20min的 目的产物的吸附，最后将萃取头***色谱进样口解析15min。
GC-MS检测条件：设定气相色谱仪的条件：色谱柱HP-5MS，60m×0.32 mm×0.25μm石英毛细管柱；柱温起始为40℃，保持3min，以9℃/min升至116℃， 保持4min，再以9℃/min升至260℃，保持5min；进样口温度为250℃；载气 为高纯氦气，流速1mL/min；不分流进样。质谱仪条件：离子源为EI源，离子 源温度230℃，电子能量70eV，四极杆温度150℃，接口温度280℃，电子倍增 器电压1280V，扫描范围m/z为40-450u。
如表7所示，对酵母菌株进行乙酰辅酶A的强化，过表达酿酒酵母ACS1、 ALD6基因，重组菌株C-ald6acs1的己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯产量分别为 0.78mg/L、8.45mg/L和7.87mg/L；在此基础上，过表达密码子优化的酿酒酵 母ACC1*基因，重组菌株C-ald6acs1A*的己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯产量 分别为1.48mg/L、9.32mg/L和9.48mg/L；在此基础上，过表达酿酒酵母FAS1、 FAS2基因，重组菌株C-ald6acs1A*F1F2的己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯产量 分别为2.97mg/L、11.19mg/L和11.32mg/L；在此基础上，进一步引入草莓的SAAT基因，重组菌株C-ald6acs1A*F1F2S的己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯产 量分别为7.53mg/L、13.65mg/L和13.89mg/L，其己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙 酯产量较出发菌株CA分别提高了近26.89倍、9.11倍和7.27倍。
表7亲本菌株和重组菌株的气质联用检测
Figure BDA0002257152850000221
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种高产C6-C10乙基酯的酿酒酵母及其构建方法与用途
<130> 1
<160> 82
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1503
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<400> 1
atgactaagc tacactttga cactgctgaa ccagtcaaga tcacacttcc aaatggtttg 60
acatacgagc aaccaaccgg tctattcatt aacaacaagt ttatgaaagc tcaagacggt 120
aagacctatc ccgtcgaaga tccttccact gaaaacaccg tttgtgaggt ctcttctgcc 180
accactgaag atgttgaata tgctatcgaa tgtgccgacc gtgctttcca cgacactgaa 240
tgggctaccc aagacccaag agaaagaggc cgtctactaa gtaagttggc tgacgaattg 300
gaaagccaaa ttgacttggt ttcttccatt gaagctttgg acaatggtaa aactttggcc 360
ttagcccgtg gggatgttac cattgcaatc aactgtctaa gagatgctgc tgcctatgcc 420
gacaaagtca acggtagaac aatcaacacc ggtgacggct acatgaactt caccacctta 480
gagccaatcg gtgtctgtgg tcaaattatt ccatggaact ttccaataat gatgttggct 540
tggaagatcg ccccagcatt ggccatgggt aacgtctgta tcttgaaacc cgctgctgtc 600
acacctttaa atgccctata ctttgcttct ttatgtaaga aggttggtat tccagctggt 660
gtcgtcaaca tcgttccagg tcctggtaga actgttggtg ctgctttgac caacgaccca 720
agaatcagaa agctggcttt taccggttct acagaagtcg gtaagagtgt tgctgtcgac 780
tcttctgaat ctaacttgaa gaaaatcact ttggaactag gtggtaagtc cgcccatttg 840
gtctttgacg atgctaacat taagaagact ttaccaaatc tagtaaacgg tattttcaag 900
aacgctggtc aaatttgttc ctctggttct agaatttacg ttcaagaagg tatttacgac 960
gaactattgg ctgctttcaa ggcttacttg gaaaccgaaa tcaaagttgg taatccattt 1020
gacaaggcta acttccaagg tgctatcact aaccgtcaac aattcgacac aattatgaac 1080
tacatcgata tcggtaagaa agaaggcgcc aagatcttaa ctggtggcga aaaagttggt 1140
gacaagggtt acttcatcag accaaccgtt ttctacgatg ttaatgaaga catgagaatt 1200
gttaaggaag aaatttttgg accagttgtc actgtcgcaa agttcaagac tttagaagaa 1260
ggtgtcgaaa tggctaacag ctctgaattc ggtctaggtt ctggtatcga aacagaatct 1320
ttgagcacag gtttgaaggt ggccaagatg ttgaaggccg gtaccgtctg gatcaacaca 1380
tacaacgatt ttgactccag agttccattc ggtggtgtta agcaatctgg ttacggtaga 1440
gaaatgggtg aagaagtcta ccatgcatac actgaagtaa aagctgtcag aattaagttg 1500
taa 1503
<210> 2
<211> 2142
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<400> 2
atgtcgccct ctgccgtaca atcatcaaaa ctagaagaac agtcaagtga aattgacaag 60
ttgaaagcaa aaatgtccca gtctgccgcc actgcgcagc agaagaagga acatgagtat 120
gaacatttga cttcggtcaa gatcgtgcca caacggccca tctcagatag actgcagccc 180
gcaattgcta cccactattc tccacacttg gacgggttgc aggactatca gcgcttgcac 240
aaggagtcta ttgaagaccc tgctaagttc ttcggttcta aagctaccca atttttaaac 300
tggtctaagc cattcgataa ggtgttcatc ccagacccta aaacgggcag gccctccttc 360
cagaacaatg catggttcct caacggccaa ttaaacgcct gttacaactg tgttgacaga 420
catgccttga agactcctaa caagaaagcc attattttcg aaggtgacga gcctggccaa 480
ggctattcca ttacctacaa ggaactactt gaagaagttt gtcaagtggc acaagtgctg 540
acttactcta tgggcgttcg caagggcgat actgttgccg tgtacatgcc tatggtccca 600
gaagcaatca taaccttgtt ggccatttcc cgtatcggtg ccattcactc cgtagtcttt 660
gccgggtttt cttccaactc cttgagagat cgtatcaacg atggggactc taaagttgtc 720
atcactacag atgaatccaa cagaggtggt aaagtcattg agactaaaag aattgttgat 780
gacgcgctaa gagagacccc aggcgtgaga cacgtcttgg tttatagaaa gaccaacaat 840
ccatctgttg ctttccatgc ccccagagat ttggattggg caacagaaaa gaagaaatac 900
aagacctact atccatgcac acccgttgat tctgaggatc cattattctt gttgtatacg 960
tctggttcta ctggtgcccc caagggtgtt caacattcta ccgcaggtta cttgctggga 1020
gctttgttga ccatgcgcta cacttttgac actcaccaag aagacgtttt cttcacagct 1080
ggagacattg gctggattac aggccacact tatgtggttt atggtccctt actatatggt 1140
tgtgccactt tggtctttga agggactcct gcgtacccaa attactcccg ttattgggat 1200
attattgatg aacacaaagt cacccaattt tatgttgcgc caactgcttt gcgtttgttg 1260
aaaagagctg gtgattccta catcgaaaat cattccttaa aatctttgcg ttgcttgggt 1320
tcggtcggtg agccaattgc tgctgaagtt tgggagtggt actctgaaaa aataggtaaa 1380
aatgaaatcc ccattgtaga cacctactgg caaacagaat ctggttcgca tctggtcacc 1440
ccgctggctg gtggtgttac accaatgaaa ccgggttctg cctcattccc cttcttcggt 1500
attgatgcag ttgttcttga ccctaacact ggtgaagaac ttaacaccag ccacgcagag 1560
ggtgtccttg ccgtcaaagc tgcatggcca tcatttgcaa gaactatttg gaaaaatcat 1620
gataggtatc tagacactta tttgaaccct taccctggct actatttcac tggtgatggt 1680
gctgcaaagg ataaggatgg ttatatctgg attttgggtc gtgtagacga tgtggtgaac 1740
gtctctggtc accgtctgtc taccgctgaa attgaggctg ctattatcga agatccaatt 1800
gtggccgagt gtgctgttgt cggattcaac gatgacttga ctggtcaagc agttgctgca 1860
tttgtggtgt tgaaaaacaa atctagttgg tccaccgcaa cagatgatga attacaagat 1920
atcaagaagc atttggtctt tactgttaga aaagacatcg ggccatttgc cgcaccaaaa 1980
ttgatcattt tagtggatga cttgcccaag acaagatccg gcaaaattat gagacgtatt 2040
ttaagaaaaa tcctagcagg agaaagtgac caactaggcg acgtttctac attgtcaaac 2100
cctggcattg ttagacatct aattgattcg gtcaagttgt aa 2142
<210> 3
<211> 6755
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<400> 3
atgagcgaag aaagcttatt cgagtcttct ccacagaaga tggagtacga aattacaaac 60
tactcagaaa gacatacaga acttccaggt catttcattg gcctcaatac agtagataaa 120
ctagaggagt ccccgttaag ggactttgtt aagagtcacg gtggtcacac ggtcatatcc 180
aagatcctga tagcaaataa tggtattgcc gccgtgaaag aaattagatc cgtcagaaaa 240
tgggcatacg agacgttcgg cgatgacaga accgtccaat tcgtcgccat ggccacccca 300
gaagatctgg aggccaacgc agaatatatc cgtatggccg atcaatacat tgaagtgcca 360
ggtggtacta ataataacaa ctacgctaac gtagacttga tcgtagacat cgctcgaata 420
gagcagacgt agacgccgta tgggctggct ggggtcacgc ctccgagaat ccactattgc 480
ctgaaaaatt gtcccagtct aagaggaaag tcatctttat tgggcctcca ggtaacgcca 540
tgaggtcttt aggtgataaa atctcctcta ccattgtcgc tcaaagtgct aaagtcccat 600
gtattccatg gtctggtacc ggtgttgaca ccgttcacgt ggacgagaaa accggtctgg 660
tctctgtcga cgatgacatc tatcaaaagg gttgttgtac ctctcctgaa gatggtttac 720
aaaaggccaa gcgtattggt tttcctgtca tgattaaggc atccgaaggt ggtggtggta 780
aaggtatcag acaagttgaa cgtgaagaag atttctatcg ctttatagcc accaggcagc 840
ctaacgaaat tccaggctcc cccattttca tcatgaagtt ggccggtaga gcgcgtcact 900
tggaagttca actgctagca gatcagtacg gtacaaatat ttccttgttc ggtagagact 960
gttccgttca gagacgtcat caaaaaatta tcgaagaagc accagttaca attgccaagg 1020
ctgaaacatt tcacgagatg gaaaaggctg ccgtcagact ggggaaacta gtcggttatg 1080
tctctgccgg taccgtggag tatctatatt ctcatgatga tggaaaattc tactttttag 1140
aattgaaccc aagattacaa gtcgagcatc caacaacgga aatggtctcc ggtgttaact 1200
tacctgcagc tcaattacaa atcgctatgg gtatccctat gcatagaata agtgacatta 1260
gaactttata tggtatgaat cctcattctg cctcagaaat cgatttcgaa ttcaaaactc 1320
aagatgccac caagaaacaa agaagaccta ttccaaaggg tcattgtacc gcttgtcgta 1380
tcacatcaga agatccaaac gatggattca agccatcggg tggtactttg catgaactaa 1440
acttccgttc ttcctctaat gtttggggtt acttctccgt gggtaacaat ggtaatattc 1500
acttcctttt cgagactctc agttcggcca tatttttgct tttggtgaaa atagacaagc 1560
tctccaggaa acacatggtt gttgccctga aaggaattgt ccattagggg tgatttcaga 1620
actactgtgg aatacttgat caaacttttg gaaactgaag atttcgagga taacactatt 1680
accaccggtt ggttggacga tttgattact cataaaatga ccgctgaaaa gcctgatcca 1740
actcttgccg tcatttgcgg tgccgctaca aaggctttct tagcatctga agaagcccgc 1800
cacaagtata tcgaatcctt acaaaaggga caagttctat ctaaagacct actgcaaact 1860
atgttccctg tagattttat ccatgagggt aaaagataca agttcaccgt agctaaatcc 1920
ggtaatgacc gttacagcat tatttatcaa tggttctaaa tgtgatatca tactgcgtca 1980
actatgctga tggtggtctt ttgattgcca taggcggtaa atcgacatac catctatctg 2040
gaaagaagaa gttgctgcta caagattatc cgttgactct atgactactt tgttggaagt 2100
tgaaaacgat ccaacccagt tgcgtactcc atcccctggt aaattggtta aattcttggt 2160
ggaaaatggt gaacacatta tcaagggcca accatatgca gaaattgaag ttatgaaaat 2220
gcaaatgcct ttggtttctc aagaaaatgg tatcgtccag attattaaag caacctggtt 2280
ctaccattgt tgcaggtgat atcatggcta ttatgactct tgacgatcca tccaaggtca 2340
agcacgctct accatttgaa ggtatgcttg ccagattttg gttctccagt tatcgaagga 2400
agccaaacct gcctataaat tcaagtcatt agtgtctact ttggaaaaca ttttgaaggg 2460
ttatgacaac caagttcatt atgaacgctt ccttgcaaca attgatagag gttttgagaa 2520
atccaaaact gaccttactc agaatggaaa ctacacatct ctgctttaca ttcaagattg 2580
cctgctaagc tagatgaaca aatggaagag ttagttgcac gttctttgag acgtggtgct 2640
gttttcccag ctagacaatt aagtaaattg attgatatgg ccgtgaagaa tcctgaatac 2700
aaccccgaca aattgcttga ggcgccgtcg tggaaccatt ggcggatatt gctcataagt 2760
actctaacgg gattagaagc ccatgaacat tctatatttg tccatttctt ggaagaatat 2820
tacgaagttg aaaagttatt caatggtcca aatgttcgtg aggaaaatat cattctgaaa 2880
ttgacgtgat gaaaacccta aagatctaga taaagttgcg ctaactgttt tgtctcattc 2940
gaaagtttca gcgtaagaat aacctgatcc tagctatctt gaaacattat caaccattgt 3000
gcaagttatc tttctaaagt ttctgccatt ttctctactc ctctacaaca tattgttgaa 3060
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cgctttacct tcggtcaagg aaagaactcg aacaaattga acatatctta aaatcctctg 3180
ttgtgaaggt tgcctatggc tcatccaatc caaagcgctc tgaaccagat ttgaatatct 3240
tgaaggactt gatcgattct aattacgttg tgttcgatgt tttacttcaa ttcctaaccc 3300
atcaagaccc agttgtgact gctgcagctg ctcaagtcta tattcgtcgt gcttatcgtg 3360
cttacaccat aggagatatt agagttcact gaaggtgtca cagttccaat tgttgaatgg 3420
aaattccaac taccttcagc tgcgttctcc acctttccca actgttaaat ctaaaatggg 3480
tatgaacagg gctgtttgct gtttcagatt tgtcatatgt tgcaaacagt cagatcatct 3540
ccgttaagag aaggtatttt gatggctgtg gatcatttag atgatgttga tgaaattttg 3600
tcacaaagtt tggaagttat tcctcgtcac caatcttctt ctaacggacc tgctcctgat 3660
cgttctggta gctccgcatc gttgagtaat gttgctaatg tttgtgttgc ttctacagaa 3720
ggtttcgaat ctgaagagga aattttggta aggttgagag aaattttgga tttgaataag 3780
caggaattaa tcaatgcttg ctatccgtcg tatcacattt atgttcggtt ttaaagatgg 3840
gtcttatcca aagtattata cttttaacgg tccaaattat aacgaaaatg aaacaattcg 3900
tcacattgag ccggctttgg ccttccaact ggaattagga agattgtcca acttcaacat 3960
taaaccaatt ttcactgata atagaaacat ccatgtctac gaagctgtta gtaagacttc 4020
tccattggat aagagattct ttacaagagg tattattaga acgggtcata tccgtgatga 4080
catttctatt caagaatatc tgacttctga agctaacaga ttgatgagtg atatattgga 4140
taatttagaa gtcaccgaca cttcaaattc tgatttgaat catatcttca tcaacttcat 4200
tgcgtgtgtt tgatatctct ccagaagatg tcgaagccgc cttcggtggt ttcttagaaa 4260
gatttggtaa gagattgttg agattgcgtg tttcttctgc cgaaattaga atcatcatca 4320
aagatcctca aacaggtgcc ccagtaccat tgcgtgcctt gatcaataac gtttctggtt 4380
atgttatcaa aacagaaatg tacaccgaag tcaagaacgc aaaaggtgaa tgggtattta 4440
agtctattgg gtaaacctgg atccatgcat ttaagaccta ttgctactcc ttaccctgtt 4500
aaggaatggt tgcaaccaaa acgttataag gcacacttga tgggtaccac atatgtctat 4560
gacttcccag aattattccg ccaagcatcg tcatcccaat ggaaaaattt ctctgcagat 4620
gttaagttaa cagatcgatt tctttatttc caacgagttg attgaagatg aaaactggcg 4680
aattaactga ggtggaaaga gaacctggtg ccaacgctat tggtatggtt gcctttcaag 4740
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acaccattgc agccatataa attgacttta ttggatcagt taactccacc agcttatgtt 120
ccaattgtct tcttttatcc aattacagat catgatttca atttgccaca gactttggct 180
gacttgagac aggctttgtc agaaacttta actttgtact atccattatc aggtagagtt 240
aaaaataatt tgtatataga cgatttcgaa gagggtgtcc catacttgga ggctagggtc 300
aactgcgaca tgactgattt tttgagatta agaaagattg aatgtttaaa cgaattcgtt 360
ccaataaaac cattttctat ggaagctata tctgatgaaa ggtatccatt attgggagtt 420
caagttaatg tttttgattc aggtatagct attggtgttt ctgtttctca taagttgatt 480
gatggtggta cagctgattg ttttttgaag tcttggggtg ctgttttcag gggttgtagg 540
gaaaatatta ttcatccatc tttgtctgaa gcagcattgt tgttcccacc tagggatgac 600
ttgccagaaa aatatgttga tcaaatggaa gctttatggt tcgctggtaa gaaggtcgct 660
actagaaggt ttgtcttcgg tgttaaagct atttcttcta ttcaagacga ggctaagtct 720
gagtctgtcc ctaagccatc tagagtccac gcagttactg gttttttgtg gaaacattta 780
atagctgcat ctagagcttt gacatctggt acaacatcta ctagattgtc tattgcagct 840
caggctgtca acttgaggac tagaatgaac atggaaacag ttttagacaa cgcaactggt 900
aacttgtttt ggtgggctca ggcaattttg gaattgtctc acacaacacc tgaaatatct 960
gatttgaaat tatgtgattt ggttaacttg ttaaatggtt ctgttaagca atgtaacggt 1020
gattattttg aaacttttaa aggtaaggaa ggatacggta gaatgtgtga atatttagat 1080
ttccagagaa ctatgtcttc tatggagcca gcaccagata tttacttgtt ttcttcatgg 1140
acaaatttct ttaacccatt ggatttcggt tggggtagga catcttggat tggtgttgct 1200
ggtaagattg agtctgcttc ttgcaaattc attatattgg tcccaacaca gtgcggttct 1260
ggtattgagg catgggtcaa tttggaggag gagaaaatgg ctatgttgga gcaggaccca 1320
cactttttgg ctttggcttc accaaagaca ttgatttaa 1359
<210> 7
<211> 1479
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<400> 7
tctaactgat ctatccaaaa ctgaaaatta cattcttgat taggtttatc acaggcaaat 60
gtaatttgtg gtattttgcc gttcaaaatc tgtagaattt tctcattggt cacattacaa 120
cctgaaaata ctttatctac aatcatacca ttcttataac atgtcccctt aatactagga 180
tcaggcatga acgcatcaca gacaaaatct tcttgacaaa cgtcacaatt gatccctccc 240
catccgttat cacaatgaca ggtgtcattt tgtgctctta tgggacgatc cttattaccg 300
ctttcatccg gtgatagacc gccacagagg ggcagagagc aatcatcacc tgcaaaccct 360
tctatacact cacatctacc agtgtacgaa ttgcattcag aaaactgttt gcattcaaaa 420
ataggtagca tacaattaaa acatggcggg cacgtatcat tgcccttatc ttgtgcagtt 480
agacgcgaat ttttcgaaga agtaccttca aagaatgggg tctcatcttg ttttgcaagt 540
accactgagc aggataataa tagaaatgat aatatactat agtagagata acgtcgatga 600
cttcccatac tgtaattgct tttagttgtg tatttttagt gtgcaagttt ctgtaaatcg 660
attaattttt ttttctttcc tctttttatt aaccttaatt tttattttag attcctgact 720
tcaactcaag acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc 780
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc 840
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt 900
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga 960
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc 1020
tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag 1080
cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt 1140
agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg 1200
ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca 1260
cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac 1320
atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt 1380
tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc 1440
aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaac 1479
<210> 8
<211> 1001
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<400> 8
cttcatcggt atcttcgcta tattcttttt agtcgaattt gcggggagaa gatggatcta 60
tgctaaacta aataggcatt tgaaaaacga cgacgagtta cacgacatat cgccatcttt 120
aaatgagcaa ccacactggg acctcataga ggacgggtct cgctggagta aatttttcaa 180
cgggataatt aagacgacaa gaaggttcac gaaatcttta atgaggtctt tagtcagagg 240
caggaacagc cgtcaagggg gcataagact acggtcatcc ccatctgcct cttcgtccag 300
ccttgccaac agggagttct tcagagacat ggaggctcaa aacgaaatta ttgacagcct 360
agacatcaat agtcatacaa cagaaagcga ccacccaact ttggctgata atagcgtata 420
aacaatgcat actttgtacg ttcaaaatac aatgcagtag atatatttat gcatattaca 480
tataatacat atcacatagg aagcaacagg cgcgttggac ttttaatttt cgaggaccgc 540
gaatccttac atcacaccca atcccccaca agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa 600
tgtttctact ccttttttac tcttccagat tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac 660
ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt 720
aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg 780
tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga 840
tttttttctc tttcgatgac ctcccattga tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc 900
tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt ttttacttct tgctcattag 960
aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt taattacaaa a 1001
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggttggcctc tacttactc 19
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaatatagcg aagataccga tgaaggacgg gagtggaaag aacggg 46
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tatcagatcc actagtggcc tatgcgcatc ttgccctgtg cttg 44
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccatgctacc ttccatgg 18
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtttcccgtt ctttccactc ccgtccttca tcggtatctt cgc 43
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atgattgtac ggcagagggc gacatttttg taattaaaac ttag 44
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tctaatctaa gttttaatta caaaaatgtc gccctctgcc gta 43
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agaaaagaaa aaaattgatc tatcgttaca acttgaccga atc 43
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tctaattgat tcggtcaagt tgtaattttt gacgacaacc aagag 45
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cctgcagcgt acgaagcttc agctggcatt cgaaacgaat aatccacc 48
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
taggtggatt attcgtttcg aatgctctaa ctgatctatc caaaac 46
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggccaagcac agggcaagat gcttttaacg aacgcagaat tttcg 45
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
taggtggatt attcgtttcg aatgccagct gaagcttcgt acgc 44
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggccaagcac agggcaagat gctttaaagc atcttgccct gtgcttggcc 50
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
atcgtcgacc ccacacacca tagcttca 28
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gcggtcgaca gcttgcaaat taaagcctt 29
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gtccatattc ctcgatcc 18
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
agaccccatt ctttgaaggt acttcgttac tcagtccaac actc 44
<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tatcagatcc actagtggcc tatgcgtaac acttacagag tcc 43
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
agacgacaga tgactacc 18
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gattttgagt gttggactga gtaacgaagt accttcaaag aatg 44
<210> 30
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cctgcagcgt acgaagcttc agctggagcg acctcatgct atac 44
<210> 31
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tctcaggtat agcatgaggt cgctccagct gaagcttcgt acgc 44
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cctgatagga ctctgtaagt gttacaaagc atcttgccct gtgcttggcc 50
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
aatggcaagc gaacag 16
<210> 34
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ttcagttttg gatagatcag ttagaagcac caagaccgta gatg 44
<210> 35
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
taagatcatc tacggtcttg gtgcttctaa ctgatctatc caaaac 46
<210> 36
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
atggtcttgt ggagtaagcg tccatgtttt atatttgttg taa 43
<210> 37
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ctacttttta caacaaatat aaaacatgga cgcttactcc acaag 45
<210> 38
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
agaaaagaaa aaaattgatc tatcgttagg attgttcata cttttc 46
<210> 39
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ctgggaaaag tatgaacaat cctaacgata gatcaatttt tttc 44
<210> 40
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gaatatagcg aagataccga tgaagtaacg aacgcagaat tttc 44
<210> 41
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
taactcgaaa attctgcgtt cgttacttca tcggtatctt cgc 43
<210> 42
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
attcttgctc aacttccggc ttcatttttg taattaaaac ttag 44
<210> 43
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
tctaatctaa gttttaatta caaaaatgaa gccggaagtt gagc 44
<210> 44
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ttgacctctt ggttgtcgtc aaaaactatt tcttagtaga aacgg 45
<210> 45
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ggtcgccgtt tctactaaga aatagttttt gacgacaacc aagaggtc 48
<210> 46
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
cctgcagcgt acgaagcttc agctgaccag cattcgaaac gaat 44
<210> 47
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tggattattc gtttcgaatg ctggtcagct gaagcttcgt acgc 44
<210> 48
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
agggaatgac tcggcaacca caatagcata ggccactagt ggatctg 47
<210> 49
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
tatcagatcc actagtggcc tatgctattg tggttgccga gtc 43
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gcactcaagt ggacctat 18
<210> 51
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
atacggcata aagcgc 16
<210> 52
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ttcagttttg gatagatcag ttagaaagcc acgaagggaa c 41
<210> 53
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
tatcagatcc actagtggcc tatgcaacag gaaggtggtg a 41
<210> 54
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ctgacacttg ggagca 16
<210> 55
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gaggaaaaag ttcccttcgt ggctttctaa ctgatctatc caaaac 46
<210> 56
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
cctgcagcgt acgaagcttc agctgtaacg aacgcagaat tttcg 45
<210> 57
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
taactcgaaa attctgcgtt cgttacagct gaagcttcgt acgc 44
<210> 58
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
tgccaagcat caccaccttc ctgttgcata ggccactagt ggat 44
<210> 59
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
tggcatcttc accg 14
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
cgctattatc agccaaag 18
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
cgatagatca atttttttc 19
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
gcatcttgcc ctgtgcttgg cc 22
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
cagctgaagc ttcgtacgc 19
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
agcacgggta tgaagatc 18
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
ggtctgttat cgtggcta 18
<210> 66
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
tgtgcgtctt gagttga 17
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
gcgaatttct tatgatttat g 21
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
gcataggcca ctagtggat 19
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
cagctgaagc ttcgtacgc 19
<210> 70
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
cgacggattc agaggt 16
<210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
ttgctactat cacccac 17
<210> 72
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
tgtgcgtctt gagttga 17
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
cgatagatca atttttttc 19
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
cgctattatc agccaaag 18
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
cagctgaagc ttcgtacgc 19
<210> 76
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
aagaagtcag gcaagg 16
<210> 77
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
aacaccctat ttggc 15
<210> 78
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
tgtgcgtctt gagttga 17
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
cgatagatca atttttttc 19
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
gcataggcca ctagtggatc tg 22
<210> 81
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
cagctgaagc ttcgtacgc 19
<210> 82
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
tgagccaaca cgaagta 17

Claims (8)

1.一种高产C6-C10乙基酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于：所述菌株是以酿酒酵母为出发菌株，通过同时过表达乙醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1*、脂肪酸合成酶基因FAS1和FAS2，并同时异源过表达醇酰基转移酶基因SAAT构建而成的菌株；
所述醇酰基转移酶基因SAAT的核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:6所示。
2.如权利要求1所述一种高产C6-C10乙基酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于：所述乙醛脱氢酶基因ALD6的核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示；
所述乙酰辅酶A合成酶基因ACS1的核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:2所示；
所述乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1*的核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:3所示；
所述脂肪酸合成酶基因FAS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述脂肪酸合成酶基因FAS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
3.如权利要求1所述一种高产C6-C10乙基酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于：所述C6-C10乙基酯为己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯。
4.如权利要求1所述一种高产C6-C10乙基酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于：所述酿酒酵母出发菌株的菌种保藏编号为CGMCC No.18670。
5.如权利要求1所述一种高产C6-C10乙基酯的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于：所述乙醛脱氢酶基因ALD6、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1通过串联共同替换半乳糖的转录调节因子的编码基因Gal80，并用强启动子PGK1P和TEF1P分别过表达基因ALD6和基因ACS1；
同时所述乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1*替换磷脂酸磷酸酯酶的编码基因LPP1，并用强启动子TEF1P过表达基因ACC1*；
同时所述脂肪酸合成酶基因FAS1和FAS2通过串联共同替换己糖载运蛋白酶基因HXT16，并用强启动子PGK1P和TEF1P分别过表达基因FAS1和FAS2；
同时所述异源醇酰基转移酶基因SAAT替换乙酸异戊酯氢化酶基因IAH1，并用强启动子PGK1P过表达基因SAAT。
6.权利要求1-5任一所述高产C6-C10乙基酯的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以酿酒酵母为出发菌株，以基因Gal80为整合位点，将基因Gal80的上游同源臂片段GA、启动子TEF1P、乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、终止子MFA2T、乙醛脱氢酶基因ALD6、KanMX以及基因Gal80的下游同源臂片段GB按顺序依次连接并***到整合位点上，同源重组后再用pGAPza质粒去除KanMX基因，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株；
(2)以基因LPP1为整合位点，将基因LPP1的上游同源臂LA、ACC1*基因片段、KanMX和基因LPP1的下游同源臂LB按顺序依次连接并***到整合位点上，同源重组后再用pGAPza质粒去除KanMX基因，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株；
(3)以基因HXT16为整合位点，将基因HXT16的上游同源臂HA、启动子PGK1P、基因FAS1、终止子PGK1T、启动子TEF1P、基因FAS2、终止子MFA2T、Kan、基因HXT16的下游同源臂HB按顺序依次连接并***到整合位点上，同源重组后再用pGAPza质粒去除KanMX基因，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株；
(4)以基因IAH1为整合位点，将基因IAH1上游同源臂IA、基因SAAT、KanMX、基因IAH1下游同源臂IB按顺序依次连接并***到整合位点上，同源重组后再用pGAPza质粒去除KanMX基因，传代得到不含pGAPza质粒的重组菌株。
7.权利要求1-5任一所述高产C6-C10乙基酯的酿酒酵母基因工程菌株的用途。
8.如权利要求7所述高产C6-C10乙基酯的酿酒酵母基因工程菌株的用途，其特征在于：所述用途为酿酒酵母基因工程菌株在发酵酿造、制备发酵食品、制备香精香料过程中高产己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯中的用途。
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