CN103232947A - 一株耐冷冻面包酵母菌株及其基因无痕敲除方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一株耐冷冻面包酵母菌株及其构建方法，具体是通过无痕敲除基因NTH1构建的耐冷冻面包酵母BY-14AΔU，保藏编号CGMCC No.7379。无痕基因敲除方法构建耐冷冻面包酵母，是通过融合PCR和酵母整合质粒YIplac211，敲除编码中性海藻糖酶基因NTH1来实现的。本发明实现了将面包酵母NTH1基因快速、高效地无痕敲除，菌株BY-14AΔU在其他发酵性能不受影响的情况下，胞内海藻糖含量较亲本菌株提高了134％；细胞在液体面团中冷冻21天后，存活率达到78％，是亲本菌株的2.6倍。本发明构建的酵母菌中基因组上不残留任何外源基因，因此可以安全的用于工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一株耐冷冻面包酵母菌株及其基因无痕敲除方法。
背景技术
面包酵母(Baker’s Yeast，学名Saccharomyces cerevisiae)是一种重要的工业微生物，含有丰富的营养成分，是馒头、面包、饼干等面食生产过程中最重要的微生物发酵剂、生物疏松剂和生物营养剂。随着冷冻面团生产技术的迅速发展，耐冷冻面包酵母及其耐冷冻机制得到了广泛研究，在欧美、日本等发达国家，冷冻面团技术也已广泛应用于焙烤工业。普通面包酵母的耐冷冻性差是限制冷冻面团技术发展的主要因素。海藻糖是酵母细胞内一种自身保护剂，可以保护细胞在冷冻过程免受冻伤。增加酵母胞内海藻糖含量可以提高面包酵母的耐冷冻性能。但是随着公众对食品安全的关注，通过传统遗传学方法构建的菌株，由于残留非自身的外源基因，其生产应用受到限制。因此有必要对酵母进行无痕基因敲除，以保证不会留下任何外源DNA。
酵母菌的无痕修饰起初是为了除去筛选标记，以便在单个菌株中进行多基因操作。去除筛选标记主要有两种方法，一种是在靶基因敲除后，利用敲除元件中正向重复序列(hisG)之间的同源重组。另一种则是利用重组酶介导的敲除***，例如Cre/Loxp***等。利用第一种方法，首先需要构建带有“hisG-URA3-hisG”的质粒，然后使用长引物直接PCR得到敲除元件，通过转化敲除目的基因后，再反向筛选，利用正向重复序列(hisG)之间的同源重组去除筛选标记。此法中长引物包含两部分序列，一部分是与质粒退火的序列，另一部分是与靶基因两侧的侧翼序列相同的基因序列。通过这种方法得到的转化子，其基因组的靶位置上，会残留一个重复序列。利用第二种方法，通过转化筛选标记两侧带有重组酶位点的敲除元件到酵母中，一步整合实现目的基因的敲除，然后转化另一个编码重组酶的质粒，以实现抗性标记的去除。在工业酵母的改造中，这个***具有很高的效率，但是其仍会留下外源序列(单一loxp位点)，并且在进行多基因敲除时，留下的这些位点增大了发生染色体重排的可能性。2006年，日本学者使用带有靶基因一侧40bp重复序列的长引物，通过融合PCR构建的无痕敲除元件，可以 方便的实现重组，并且不会留下外源基因。但是这种方法中，40bp的重复序列重组效率较低。总之，本领域仍需要一种高效的无痕基因敲除方法。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一株耐冷冻面包酵母菌株及其基因无痕敲除方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供的面包酵母菌株是具有快速发酵性能的耐冷冻面包酵母菌株，具体为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-14aΔU。该菌已于2013年3月28保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路甲3号)，保藏编号为CGMCC No.7379。
所述面包酵母菌株在其他发酵性能不受影响的情况下，发酵后胞内海藻糖含量占细胞干重11.7％，较亲本菌株提高了134％，细胞在液体面团中冷冻21天后，存活率达到78％，是亲本菌株的2.6倍。
所述面包酵母菌株具体可以通过对出发菌株面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616(中国工业微生物菌种保藏管理中心，公众可以通过该保藏管理中心获得出发菌株CICC31616)的中性海藻糖酶编码基因NTH1的全部序列进行无痕敲除来实现。
上述基因无痕敲除可以用以下方法实现。各步骤所涉及具体操作方法参考现有文献报道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。
用PCR方法获得突变ura3片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到面包酵母出发菌株，通过同源重组以实现出发菌株的URA3基因突变。用PCR方法分别扩增敲除靶基因NTH1的上游和下游、长度为0.5～2.0kb的同源序列片段，然后通过融合PCR，将上、下游序列融合成无缝片段。将该片段克隆至酵母整合质粒YIplac211上，获得能够进行整合敲除的质粒。在整合敲除质粒的上游同源臂或者下游同源臂中，选择合适的单一酶切位点，将质粒酶切线性化。通过醋酸锂化学转化法，将线性化的整合敲除质粒导入面包酵母中，用不含尿嘧啶(uracil)的酵母合成培养基筛选发生第一步整合重组的酵母突变株。将经过鉴定的发生第一步整合重组的酵母突变株，经含有5-氟乳清酸(5-FOA)合成培养基平板反向筛选获得发生第二步整合重组的酵母突变株。用PCR方法获得出发菌株正常的 URA3基因片段，将其导入到发生了第二步整合重组的酵母突变株中，以回复突变的ura3标记基因。
本发明所述面包酵母菌株可应用于面包生产中。
本发明同时提供了一种专门用于鉴定所述耐冷冻面包酵母菌株的基因序列，该基因序列是用NTH1-D-F和NTH1-U-R引物对以所述耐冷冻面包酵母菌株基因组为模板扩增的片段，其序列如表1所示。
有益效果：
本发明针对面包酵母传统基因敲除中筛选标记残留，不便进行多基因敲除研究，以及残留外源基因的问题，提供了一株面包酵母菌株及一种高效的无痕基因敲除方法。本发明不仅可用于研究酵母基因的功能和代谢机制，而且由于所获得的突变株不残留任何外源基因，可以安全的用于工业生产。
附图说明
图1为带有突变ura3基因面包酵母菌株BY-14aΔU的表型验证图。
图2为整合敲除质粒YIplac211-UD的构建流程示意图。
图3为整合敲除质粒YIplac211-UD的电泳验证图。
图4为整合敲除质粒YIplac211-UD与酵母基因组的两步整合重组流程示意图。
图5为发生第一步整合重组的菌株BY-14aΔU-U的电泳验证图。
图6为发生第二步整合重组的菌株BY-14aΔU-ΔN的电泳验证图。
图7为回复ura3突变的整合重组菌株BY-14aΔN靶基因位置的部分测序图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：无痕敲除中性海藻糖酶基因NTH1面包酵母的构建
本实例所用的出发菌株CICC31616，本实例中改造后的面包酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)于2013年3月28日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.7379。所述质粒YIplac211 的来源见R.D.Gietz，and A.Sugino，New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites.Gene 74(1988)527-34。所述大肠杆菌DH5a购自Takara公司。所述YPD培养基为通用的完全培养基，所述酵母合成培养基(SD)成分为2％葡萄糖、0.67％YNB、不含尿嘧啶的氨基酸混合物溶液，固体培养基含2％进口琼脂粉。
根据Genebank中的酵母基因组数据和整合质粒序列，设计了下述实施例中各引物。
表1.本实施例中所用到的引物
注：下划线表示酶切位点，斜体表示融合PCR所用引物的重叠序列。
(1)带有缺陷ura3基因的面包酵母BY-14aΔU的构建
使用Solarbio公司的酵母基因组提取试剂盒，提取实验室菌株W303-1a的基因组。利用引物对URA3-F和URA3-R，以W303-1a的基因组为模板，PCR扩增了菌株W303-1a突变ura3片段。经过试剂盒回收以后，将片段通过醋酸锂化学转化法导入到标准面包酵母BY-14a中，通过突变ura3与正常URA3之间的同源重组，实现标准菌株的URA3基因突变。转化后的菌悬液，涂布于补加了5-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶(uracil)酵母合成培养基(SD)平板上，30℃培养48h，获得带有缺陷ura3基因的面包酵母BY-14aΔU。获得的突变株经过表型验证确定正确，如图1所示BY-14aΔU在酵母合成培养基上不长，在YPD平板上生长良好。
(2)整合敲除质粒YIplac211-UD的构建
首先，以标准面包酵母BY-14a的基因组为模板，使用引物NTH1-SphI和NTH1-LRR通过PCR获得靶基因NTH1左侧1283bp的基因序列；同时使用引物 NTH1-RLL和NTH1-BamHI扩增靶基因右侧616bp的基因序列，分别命名为NTH1-D和NTH1-U。然后，以NTH1-D和NTH1-U的混合物为模板，加入引物NTH1-SphI和NTH1-BamHI进行融合PCR，获得无缝融合片段。经过切胶回收(试剂盒)后，分别用BamHI和SphI双酶切，最后亚克隆到整合质粒YIplac211的相应酶切位点中，整合敲除质粒YIplac211-UR构建成功，构建流程如图2所示。图3为整合敲除质粒YIplac211-UD的电泳验证图：其中泳道1为出发质粒YIplac211电泳结果；泳道2为整合质粒YIplac211-UD电泳结果；泳道3为BamHI单酶切质粒YIplac211后结果；泳道4为BamHI单酶切整合质粒YIplac211-UD后结果；泳道M为1Kb DNA Ladder maker；泳道5为BamHI和SphI双酶切整合质粒YIplac211-UD后结果。
上述融合PCR法为本领域公知的采用具有互补末端的引物，形成具有重叠序列PCR产物，通过PCR产物重叠序列延伸，从而将任意DNA片段连接起来的方法，此技术不需要内切酶的消化和连接酶的处理，就可实现DNA片段的体外连接，这使得整合质粒经过两步整合重组后，酵母基因组不会残留外源酶切位点。
(3)面包酵母中性海藻糖酶基因NTH1的敲除
SpeI酶切整合质粒YIplac211-UD；用醋酸锂转化法将线性化的整合质粒YIplac211-UD导入面包酵母BY-14aΔU中，经过两步整合重组后，得到无痕敲除NTH1的面包酵母，两步整合重组过程如图4。
第一步整合重组的发生，是由于导入的线性化质粒与酵母基因组的同源部分发生整合，从而将整个质粒带入基因组。转化后的菌悬液，涂布于不含尿嘧啶的酵母合成培养基平板上，30℃培养48h，获得发生第一步整合重组的酵母菌株BY-14aΔU-U。随机挑选所得到的单菌落，采用YIp-IN和NTH1-D-OUT为整合位点外侧引物，NTH1-D-F和NTH1-U-R为整合位点内侧引物，进行菌落PCR筛选。图5为发生第一步整合重组的菌株BY-14aΔU-U的电泳验证图：泳道M为DL5000 DNA Ladder maker；泳道1、2分别为使用外侧引物PCR验证结果，泳道1模板为BY-14aΔU，泳道2模板为BY-14aΔU-U；泳道3、4分别为使用内侧引物PCR验证结果，泳道3模板为BY-14aΔU，泳道4模板为BY-14aΔU-U。
经过筛选和鉴定获得的重组酵母菌株BY-14aΔU-U，取一环接到5ml液体YPD培养基中，30℃下200rpm振荡24h后，稀释10倍涂布于含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的酵母合成培养基平板上，30℃培养48h，获得发生第二步整合重组的 酵母菌株。如图4所示，第二步重组整合后，出现两种结果：一，如果上游同源序列形成的重复序列之间发生整合，则酵母回复成出发菌株BY-14aΔU；二，如果下游同源序列形成的重复序列之间整合，则中间的所有序列弹出，实现NTH1的无痕敲除，同时靶位置上不残留任何外源基因。随机挑选所得到的单菌落，采用NTH1-D-F和NTH1-U-R为整合位点外侧引物，NTH1-IN-F和NTH1-IN-R为整合位点内侧引物，进行菌落PCR筛选。图6为发生第二步整合重组的菌株BY-14aΔU-ΔN的电泳验证图：泳道M为DL5000 DNA Ladder maker；泳道1、2分别为使用外侧引物PCR验证结果，泳道1模板为BY-14aΔU-ΔN，泳道2模板为BY-14aΔU；泳道3、4分别为使用内侧引物PCR验证结果，泳道3模板为BY-14aΔU-ΔN，泳道4模板为BY-14aΔU，两泳道750bp左右条带为杂带。
(4)整合重组菌株BY-14aΔU-ΔN突变ura3基因的回复
同本实例中(1)所述的方法，利用引物对URA3-F和URA3-R，扩增BY-14a正常URA3基因片段，通过化学转化，以回复BY-14aΔU-ΔN菌株突变的ura3基因，最终构建出不残留任何外源基因序列的无痕敲除菌株BY-14aΔN。
为了进一步验证敲除靶位置的序列情况，提取无痕敲除菌株BY-14aΔN的基因组，使用引物NTH1-D-F和NTH1-U-R进行PCR扩增，获得1104bp的片段送于华大基因公司测序，结果如图7。图7a为敲除前后序列对比，图7b为敲除后靶位置80bp的测序结果，其他结果未给出，可以确定无痕敲除NTH1构建成功。
实施例2：耐冷冻面包酵母胞内海藻糖积累与冷冻后细胞存活率测定比较
将单倍体亲本及其对应的重组菌株分别同时进行48小时培养，测定胞内海藻糖积累水平与液体模拟面团冷冻后21天后细胞存活率，结果见表2。如结果所示，细胞培养48h后，构建菌株胞内海藻糖占细胞干重11.7％，较亲本菌株(5.0％)增加了134％；将单倍体亲本及其对应的重组菌株分别进行48小时培养后，冷冻21天，测定细胞存活率，突变株的细胞存活率为78％，是出发菌株(30％)的2.6倍。
表2 面包菌株胞内海藻糖积累与冷冻后细胞存活率测定
注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。
Claims (5)
1.一株耐冷冻面包酵母菌株，具体为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-14AΔU，保藏编号为CGMCC No.7379。
2.如权利要求1所述的一株耐冷冻面包酵母菌株，其特征在于，所述面包酵母菌株发酵后胞内海藻糖含量占细胞干重11.7％；细胞在液体面团中冷冻21天后，存活率达到78％，是亲本菌株的2.6倍。
3.如权利要求1所述的一株耐冷冻面包酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法是通过融合PCR技术和整合型载体质粒YIplac211介导的两步基因整合法，将编码中性海藻糖酶的基因NTH1无痕敲除来实现的。
4.如权利要求3所述的一株耐冷冻面包酵母菌株的构建方法，其特征在于，具体步骤包括：用PCR方法获得突变ura3片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到面包酵母出发菌株，通过同源重组实现出发菌株的URA3基因突变；用PCR方法分别扩增敲除靶基因NTH1上游和下游、长度为0.5～2.0kb的同源序列片段，然后通过融合PCR，将上、下游序列融合成无缝片段；将该片段克隆至酵母整合质粒YIplac211上，获得能够进行整合敲除的质粒；在整合敲除质粒的上游同源臂或者下游同源臂中，选择合适的单一酶切位点，将质粒酶切线性化；通过醋酸锂化学转化法，将线性化的整合敲除质粒导入面包酵母中，用不含尿嘧啶的酵母合成培养基筛选发生第一步整合重组的酵母突变株；将经过鉴定的发生第一步整合重组的酵母突变株，经含有5-氟乳清酸合成培养基平板反向筛选获得发生第二步整合重组的酵母突变株；用PCR方法获得出发菌株正常的URA3基因片段，将其导入到发生了二步整合重组的酵母突变株中，以回复突变的ura3标记基因。
5.如权利要求1或2所述的一株耐冷冻面包酵母菌株在面包生产中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20150624 |