CN105296596A - 一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒，涉及循环酶法检测同型半胱氨酸技术领域，特别涉及一种同型半胱氨酸检测试剂，试剂R1中含有S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、NADH、三(2羧乙基)膦氯化氢(TCEP)、α-酮戊二酸，防腐剂为叠氮钠，试剂R2中含有Hcy甲基转移酶、谷氨酸脱氢酶(GLDH)、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶(SAHase)、腺苷脱氨酶(ADA)、氯化钾、氯化钙、丙三醇、D-山梨醇和海藻糖，氯化钾和氯化钙提高了酶的活性，D-山梨醇、丙三醇和海藻糖提高了酶的热稳定性。

Description

一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及酶法同型半胱氨酸检测技术领域，特别涉及一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂。

背景技术

血浆同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)即2-氨酸-4巯基丁酸，为一种含硫氨基酸，又称为高半胱氨酸，HCY是蛋氨酸循环中S-腺苷基高半胱氨酸水解酶，水解反应的产物，细胞内的HCY有三条去路即被甲基化生成蛋氨酸，与丝氨酸缩合生成胱硫醚以及直接排出。细胞HCY是蛋氨酸新陈代谢过程中的重要中间产物，是一种有毒性作用的含硫氨基酸。血浆中HCY存在游离态与结合态两种形式。在生理条件下，人体血浆中只有极少量HCY(<0.3μmol/L)以游离状态存在，绝大部分以HCY-二硫化合物结合态存在，而结合态HCY中约70%与血浆蛋白结合，其余30%与其他硫醇结合。血浆中Hcy参考范围与年龄有关，成人≤15μmol/L，60岁以上老年人为15~20μmol/L。

当Hcy的浓度高于正常范围时，会对人体产生多方面的影响，例如：加速氧化及衰老，心血管疾病，免疫力减弱，大脑的损伤，增加疼痛、炎症及血栓等。因此，同型半胱氨酸含量是人体的重要健康指标。

临床上常用的同型半胱氨酸检测方法有荧光偏振免疫法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定和循环酶法。

1.荧光偏振免疫法

用二硫苏糖醇(dithiothrepitol)将样本还原，然后Hcy在S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的催化下与腺苷生成S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)，最后将预稀释的SAH混合物、抗-SAH单克隆抗体及带有荧光标记的S-腺苷-L-同型半胱氨酸示踪物一同孵育，用自动免疫分析仪检测偏振光的改变，标准曲线法定量。该方法操作简单，与胱氨酸和蛋氨酸无交差反应。该方法具有良好的稳定性、线性及重复性。

2.高效液相色谱法

血液标本以乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝，3000转离心2min，高氯酸沉淀蛋白质，上清液与NaBH4溶液起反应，还原二硫键，一根0.2cm×50cm装有Zi-paxSCX强阳离子交换树脂的柱子用来分离同型半胱氨酸，混合物以0.031M磷酸盐、0.118M柠檬酸缓冲液以0.75ml/M的流速洗脱，用对硫化物具有高度敏感性和特异性的金-水银薄层电化学检测仪对同型半胱氨酸进行检测。具有样本处理简单，无需衍生等特点，又具较高的灵敏性、专一性和稳定性。

3.酶联免疫吸附测定

通过特异的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶催化Hcy转变为SAH，然后加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，最后加入辣根过氧化物酶的底物和四甲基联苯胺呈色，以硫酸终止反应后在450nm处比色，标本中总Hcy与OD值呈负相关。

4.循环酶法

标本在TECP的作用下，氧化型同型半胱氨酸转化为游离型Hcy，游离型Hcy与共价底物S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionineSAM)在同型半胱氨酸甲基转移酶的催化反应形成蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)。SAH被SAH水解酶水解成腺苷和Hcy，形成的Hcy可以循环的加入反应，从而放大了检测信号，生成物腺苷(Ado)立即水解为次黄嘌呤和氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD+，样本中的Hcy的浓度与NADH的变化成正比。循环酶法在全自动生化仪上可以更加简便、灵敏、准确的检测Hcy，方法是国内常用的方法。

发明内容

本发明在在循环酶法的基础上，优化反应体系，添加多种稳定剂，显著改善了试剂的稳定性。

针对于同型半胱氨酸检测，本发明提供了一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒，该试剂盒使用简单、方便，具有很好的准确度、重复性及良好的检测范围，有利于试剂在临床上的推广应用。

基本原理

基于小分子捕获技术(SMT)的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。Hcy被转化为游离型后，通过与共价底物反应，循环放大，同时产生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD，样本中的Hcy浓度与NADH转化速率成正比。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种同型半胱氨酸检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

R1：

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)0.1mmol/L

NADH0.3mmol/L

三(2羧乙基)膦氯化氢(TCEP)0.1mmol/L

α-酮戊二酸5.0mmol/L

叠氮钠0.5g/L

R2：

Hcy甲基转移酶5KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH)3KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶(SAHase)2.5KU/L

腺苷脱氨酶(ADA)5.0KU/L

氯化钾0.1mmol/L

氯化钙0.1mmol/L

丙三醇50mmol/L

D-山梨醇250mmol/L

海藻糖250mmol/L。

所述试剂R1和试剂R2在使用时的比例为R1：R2=200：50。

所述的一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于所使用的激活剂是氯化钾和氯化钙。

所述的一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于所使用的三种酶保护剂分别是丙三醇、D-山梨醇和海藻糖。

本发明的有益效果是：

（1）本发明使用了氯化钾和氯化钙作为激活剂，提高了试剂R2中酶的活性；

（2）本发明使用了三种酶保护剂，分别是丙三醇、D-山梨醇和海藻糖，提高了酶的热稳定性。

附图说明

图1为两种试剂的相关性曲线图；

图2为本发明试剂热稳定性检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

同型半胱氨酸的检测试剂，包含试剂R1和试剂R2：

1）R1：

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)0.1mmol/L

NADH0.3mmol/L

三(2羧乙基)膦氯化氢(TCEP)0.1mmol/L

α-酮戊二酸5.0mmol/L

叠氮钠0.5g/L

2）R2：

Hcy甲基转移酶5KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH)3KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶(SAHase)2.5KU/L

腺苷脱氨酶(ADA)5.0KU/L

氯化钾0.1mmol/L

氯化钙0.1mmol/L

丙三醇50mmol/L

D-山梨醇250mmol/L

海藻糖250mmol/L

3）本实施例试剂的使用方法：

本实施例描述的同型半胱氨酸检测试剂，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用速率法进行测定。将R1和R2按照4:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1：

表1实施例1试剂检测方法

样本△A/min

样本HCY浓度=——————×标准浓度

标准△A/min

实施例2

干扰性试验：取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求。然后分别用实施例1所得试剂，与市场常见并认可的同型半胱氨酸检测试剂同时对比测定同型半胱氨酸的含量，对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。

表2实施例试剂抗干扰性能比较

由表2可以看出，实施例1试剂在血氨≤50μmol/L、谷胱甘肽≤0.5mmol/L、胱硫醚≤20μmol/L、血红蛋白≤1000mg/dL、甘油三酯≤2000mg/dL对测试结果没有明显干扰。与对照试剂检测结果一致，说明实施例1的试剂在准确度和抗干扰能力上达标。

实施例3

相关性实验：利用实施例1配方配制试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的血清铜试剂盒进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表3所示。并获得了两种试剂的相关性曲线（如图1所示），通过检测结果显示，两个试剂盒的相关系数为0.9995，说明了两者有极大的相关性。

表3实施例1试剂与市场常见并得到认可的血清铜测定试剂盒对比检测结果

试验所用校准品和质控品分别为：

校准品：北京九强同型半胱氨酸校准品0μmol/L,60μmol/L；

质控品：北京九强同型半胱氨酸质控品靶值为13.2μmol/L，范围为11.22~15.18μmol/L。

实施例4

试剂稳定性验证试验

将本发明实施例1~3中所得检测试剂作为试验组，取一种市售同型半胱氨酸检测试剂盒作为对照组，试验组与对照组试剂每组各自取相同的两份，一份做15天开瓶稳定性试验，将试剂开瓶放置在仪器的2-8℃冷藏箱中（15天不取出），作为15天开瓶稳定性检测；另一份做37℃热稳定性检测试验，封闭放置在37℃恒温水浴锅中（每天仅在检测的时候取出，检测完毕后，依然封口放回37℃水浴锅中，连续7天），作为7天37℃热稳定性验证。将试剂同时在日立7180全自动生化分析仪器上，按照表1方法进行检测，并在仪器上建立标准曲线。取北京九强的质控品，溶解均匀后，平均分成15份，-20℃储存，每天检测一次，并且跟踪检测结果，热稳定性跟踪监测趋势如图2。

Claims (4)

1.一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒，由R1、R2双试剂组成，其特征在于：

1）R1：

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)0.1mmol/L

NADH0.3mmol/L

三(2羧乙基)膦氯化氢(TCEP)0.1mmol/L

α-酮戊二酸5.0mmol/L

叠氮钠0.5g/L

2）R2：

Hcy甲基转移酶5KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH)3KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶(SAHase)2.5KU/L

腺苷脱氨酶(ADA)5.0KU/L

氯化钾0.1mmol/L

氯化钙0.1mmol/L

丙三醇50mmol/L

D-山梨醇250mmol/L

海藻糖250mmol/L。

2.根据权利要求1所述的一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2在使用时的比例为R1：R2=200：50。

3.根据权利要求1所述的一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于所使用的激活剂是氯化钾和氯化钙。

4.根据权利要求1所述的一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于所使用的三种酶保护剂分别是丙三醇、D-山梨醇和海藻糖。