JP6410731B2 - 代謝的に操作されたプロピオン酸菌を用いるn−プロパノールおよびプロピオン酸を生成するためのプロセス - Google Patents
代謝的に操作されたプロピオン酸菌を用いるn−プロパノールおよびプロピオン酸を生成するためのプロセスInfo
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Description
供し、改変されたプロピオン酸菌は、このプロピオン酸菌が、プロピオニル−CoAに対
する活性を有する、Genbank Gene ID:6062148;GI:1700
80868として同定された二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現す
るように、40%以上のGC含量を有する通性嫌気性生物から得られる挿入されたadh
E遺伝子断片を含有するゲノムDNAを有するプロピオン酸菌を含む。
本出願は、例えば以下の発明を提供する。
[1] n−プロパノール、プロピオン酸、またはこれらの組み合わせを生合成的に調製するための方法であって、
(a) 基質と、水と、プロピオニル−CoAに対して活性を有する、GenBank Gene ID:6062148;GI:170080868として同定された、二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現するために、40パーセント以上であるグアニン−シトシン含量を有する通性嫌気性生物から得られるadhE遺伝子を含むよう遺伝子改変されているプロピオン酸菌と、を含む出発発酵ブロスの発酵を行い、生成物としてn−プロパノール、プロピオン酸を含む発酵生成物ブロスを形成することと、
(b) 前記生成物のn−プロパノール、プロピオン酸、またはこれらの組み合わせの少なくとも一部を、前記発酵生成物ブロスから回収することと、を含む、方法。
[2] 前記遺伝子改変されたプロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Propionibacterium freudenreichii)種、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ(Propionibacterium acidipropionici)種、およびこれらの組み合わせから選択される、[1]に記載の方法。
[3] 前記通性嫌気性生物が、大腸菌(Escherichia coli)である、[1]または[2]に記載の方法。
[4] 前記出発発酵ブロスが、刺激剤n−プロパノールを更に含む、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5] 前記刺激剤n−プロパノールが、細胞内で生成される、[4]に記載の方法。
[6] 前記細胞内で生成されるn−プロパノールが、
(a) 基質と、水と、プロピオニル−CoAに対して活性を有する、GenBank Gene ID:6062148;GI:170080868として同定された、二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現するために、40パーセント以上であるグアニン−シトシン含量を有する通性嫌気性生物から得られるadhE遺伝子を含むよう遺伝子改変されているプロピオン酸菌と、を含むブロスの発酵を行い、細胞内で生成されるn−プロパノールを含む発酵生成物ブロスを形成することと、
(b) 前記細胞内で生成されるn−プロパノールの少なくとも一部を前記発酵生成物ブロスから回収することと、によって調製される、[5]に記載の方法。
[7] 前記基質が、グリセロール、グルコース、およびこれらの組み合わせから成る群から選択される炭素化合物を含む、[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8] 前記出発発酵ブロスが、さもなければ同一であるが、前記遺伝子改変されたプロピオン酸菌の代わりに、プロピオニル−CoAに対して活性を有する、GenBank Gene ID:6062148;GI:170080868として同定された二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現するための、40パーセント以上であるグアニン−シトシン含量を有する通性嫌気性生物から得られるadhE遺伝子の挿入によって遺伝子改変されていない、さもなければ同一のプロピオン酸菌を含有する出発発酵ブロスの前記基質の異化よりも、少なくとも5パーセント多い量だけ増加された前記基質の異化を示す、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9] 前記遺伝子改変されたプロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Propionibacterium freudenreichii)種、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ(Propionibacterium acidipropionici)種、およびこれらの組み合わせから選択される、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10] n−プロパノールまたはプロピオン酸生合成において使用するためにプロピオン酸菌を改変するための方法であって、
(a) 40パーセント以上のグアニン−シトシン含量を有する通性嫌気性生物からadhE遺伝子断片を得ることと、
(b) 前記プロピオン酸菌が、プロピオニル−CoAに対して活性を有する、GenBank Gene ID:6062148;GI:170080868として同定された、二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現するように、プロピオン酸菌のゲノムを、前記adhE遺伝子断片を含むよう改変することと、を含む方法。
[11] 前記プロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Propionibacterium freudenreichii)種、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ(Propionibacterium acidipropionici)種、およびこれらの組み合わせから選択される、[10]に記載の方法。
[12] 前記adhE遺伝子断片が、大腸菌(Escherichia coli)から得られる、[10]または[11]に記載の方法。
[13] 改変されたプロピオン酸菌であって、プロピオニル−CoAに対して活性を有する、GenBank Gene ID:6062148;GI:170080868として同定された、二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現するように、40%以上のグアニン−シトシン含量を有する通性嫌気性生物から得られた、挿入されたadhE遺伝子断片を含有するゲノムDNAを有するプロピオン酸菌を含む生合成で使用するためのプロピオン酸菌。
[14] 前記プロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Propionibacterium freudenreichii)種、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ(Propionibacterium acidipropionici)種、およびこれらの組み合わせから選択される、[13]に記載の方法。
[15] 前記通性嫌気性生物が、大腸菌(Escherichia coli)である、[13]または[14]に記載の方法。
細菌株、プラスミド、および培地:
本実施例で使用される全ての細菌株およびプラスミドを表1に列記する。大腸菌(E.coli)DH5α(40%以上のGC含量を有する通気嫌気生成物)を、その形質転換体のために、100ミリグラム毎ミリリットル(μ/ml)のアンピシリンで補充したLuria−Bertani(LB)培地中で、摂氏37度(℃)にて好気的に増殖させる。比較の目的で、通気嫌気性生物でもあるクロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)(C.acetobytylicum)アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)824を、補強クロストリジウム培地(RCM、Difco)中で37℃にて嫌気的に増殖させる。コンピテント細胞を調製し、電気穿孔後にこの細胞を回収するために、プロピオン酸菌を、10g/Lの乳酸ナトリウム、10g/Lの酵母エキス、および10g/Lのトリプチカーゼダイズ煮汁を含有するNorthern Lights BioScience(NLB)培地中で32℃にて嫌気的に増殖させる。発酵速度試験については、細胞を、10g/Lの酵母エキス、5g/Lのトリプチカーゼ、0.25g/LのK2HPO4、0.05g/LのMnSO4、炭素源としての25g/Lのグルコースまたはグリセロール、および培地のpHを緩衝処理するための2%のCaCO3を含有する培地中で増殖させる。より詳細な関連する手順については、例えば、Yang,et al.,“Propionic acid production from glycerol by metabolically engineered Propionibacterium acidipropionici”,Process Biochem.,Vol.44,2009,1346−1351を参照されたい。これらの培地を、121℃、15ポンド毎平方インチゲージ(psig)(約204.75キロパスカル、kPa)で約30分間(min)、オートクレーブ処理によって滅菌する。特に断らない限り、濾過滅菌したヒグロマイシンBを無菌培地に無菌的に添加し、培地に対して250μg/mlの最終濃度にして、血清用瓶中でプロピオン酸菌形質転換体を維持する。全ての保存培養物は、短期使用には4℃で、長期間の保存には−80℃で保持される。
10ミリグラム毎ミリリットル(mg/ml)のリゾチーム中、37℃にて20〜30分間のインキュベーション後に細胞を溶解する。次いで、QIAGENゲノムDNAキット(Qiagen,Valencia,CA)を用いて、染色体DNAを単離する。大腸菌(E.coli)のadhEおよび(比較)クロストリジウム・アセトブチリクム(C.acetobuchilicum)のaad遺伝子(aad遺伝子は、GenBank受入番号AE001438.3に基づいて、35%のGC含量を有する)を、鋳型としてそれぞれのゲノムDNAおよび導入されたBspHIおよびNdeI制限部位(表1参照)を有するプライマーを用いて、DNAエンジン(MJ Research,Reno,NV)中でPCR増幅する。5μlの10X PCR緩衝液(Invitrogen,Grand Island,NY、USA)、1μlの25mM MgCl2、1μlの10mM dNTPs(各々)、1μlの10mM 順方向プライマー、1μlの10mM 逆方向プライマー、1μlのゲノムDNA、および2.5UのTaq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を含有する反応混合物(50マイクロリットル(μl))を、94℃で2分間の初期変性工程、94℃で30秒間の繰り返し変性のサイクル(複数可)、55℃で30秒間のアニーリング、および72℃で3分間の伸長にかけ、PCR生成物の最終伸長を72℃で10分間行った。PCR生成物を、pGEM−Tベクター(Promega,Madison,WI,USA)中にクローニングして、対応するpGEM−aadおよびpGEM−adhEベクターを構築し、QIAprep MiniPrepプラスミド精製キットを用いて、これらを単離し、精製する。発現ベクターpKHEM04−aadおよびpKHEM04−adhEを構築するために、pGEM−aadおよびpGEM−adhEをBspHIおよびNdeI REで二重消化し、QIAquickゲル抽出キッをト用いるアガロースゲルからの精製後に、対応するaadおよびadhE断片を、NcoIおよびNdeI RE REで消化されたpKHEM04と結合させる(図2参照)。BspHIおよびNcoIの両方は、適合する相補末端を有し、これらのDNA配列を、オハイオ州立大学のPlant−Microbe Genomic Facilityにより配列決定する。
pKHEM04−aadおよびpKHEN04−adhEによるプロピオン酸菌の形質転換を、当業者に周知の手順に従い電気穿孔法によって実施する。追加の詳細については、例えば、Xue,et al.,“High osmolarity improves the electro−transformation efficiency of the Gram−poshitive bacteria Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis,”J.Microbiol.Methods,Vol.34,1999,183−191を参照されたい。NLB培地中で約0.6〜0.8のOD600まで増殖させた細胞を、氷水中で10分間冷却し、4℃および4,000回転数毎分(rpm)で10分間の遠心分離によって採取し、氷冷した電気穿孔培地(10%のグリセロール)で4回洗浄し、電気穿孔培地(元の培地体積の1/40)中に再懸濁させる。次いで、0.1cmのキュベット中、1〜2μgのプラスミドDNAと混合した100μlのコンピテント細胞を、氷上で2〜5分間インキュベートし、Gene−Pulser(BioRad Laboratories,Richmond,CA)を用いて、25マイクロファラッド(μF)、200オーム(Ω)、20キロボルト毎センチメートル(kv/cm)、および4.5〜5.0ミリ秒の時間定数で電気穿孔する。電気穿孔された細胞を1mlの回収培地に移し、3時間(h)培養し、その後、250μg/mlのヒグロマイシンBを含むNLB培地上で平板培養する。培養の約10日後に、プレート上のコロニーを拾い上げ、形質転換体を、表1に示す対応するadhEまたはaad遺伝子プライマーを用いてPCRによって確認する。
選別された形質転換体によるグルコースおよびグリセロールのバッチ式発酵を、32℃およびCaCO3で調整した約pH6.8にて血清瓶中で試験する。試料を定期的に採取し、基質消費およびn−プロパノールならびに有機酸の産生を監視する。n−プロパノールの細胞成長及び発酵に及ぼす影響を試験するために、様々な量のn−プロパノールを血清瓶中の培地に添加する。増殖試験用の培地には、CaCO3は添加されない。特に断らない限り、試験される各条件について、少なくとも二通りの瓶を使用する。
adhE発現およびn−プロパノール生合成のプロピオン酸発酵に及ぼす影響を評価するために、野生型および変異体における炭素フラックス分配の化学量論的分析を、補助材料で得られる化学量論的方程式および以下の前提:1)ピルベートおよびホスホエノールピルビン酸(PEP)の正味の蓄積または消費がないこと;2)NADHまたはNAD+における正味の変化がないように酸化還元が釣り合っていること;3)十分な量のアデノシン三リン酸(ATP)が細胞成長および維持に対して生成され、正味のATP生産があること、を用いて実施した。炭素フラックス分配は、最終生成物(プロピオネート、スクシネート、アセテート、ならびにn−プロパノール)の量および発酵中に消費された基質(グルコースまたはグリセロール)の量に基づいて推定される。発酵最終生成物および細胞バイオマスへのモル炭素フラックス分配は、消費された基質で標準化される。
分光光度計(Shimazu,Columbia,MD、UV−16−1)を用いて1.5−mLのキュベット(光路長=1cm)内で600nmにおける光学密度(OD600)を測定することによって、細胞成長を監視する。炎イオン化検出器(FID)及び30.0mの溶融シリカカラム(Stabiwax−DA、0.25ミリメートル(mm)のフィルム厚および0.25mmのID、Restek,Bellefonte,PA)を装備するガスクロマトグラフ(GC)(GC−2014Shimazu,Columbia,MD)を用いて、n−プロパノールを分析する。注入温度は200℃であり、自動注入器(AOC−20i,Shimazu)を用いて、1μlの試料を注入する。最初に、カラム温度を60℃で3分間保持する。次いで、カラム温度を30℃毎分の一定速度で上昇させて、150℃で4分間、試料当たり合計10分間維持する。0.6ml/分で溶出液として0.01NのNH2SO4を用いて45℃で動作する、有機酸カラム(Bio−Rad、HPX−87)を備えた高速液体クロマトグラフ(HPLC)を用いて、当業者によって一般的に使用される手順に従って、グルコース、グリセロール、および有機酸(酢酸、コハク酸およびプロピオン酸)を分析する。更なる詳細については、例えば、Suwannakham,et al.,“Enhanced propionic acid fermentation by Propionibacterium acidipropionici mutant obtained by adaptation in a fibrous−bed bioreactor,”Biotechnol.Bioeng.,Vol. 91,2005,325−337を参照されたい。
特に断らない限り、全ての実験は二通りで行われ、平均値及び標準誤差が報告される。データ分析を、p<0.05の統計的有意差で、適切なソフトウェアを用いてt検定値を計算することによって実施する。
クロストリジウム・アセトブチリクム(C.acetobuchilicum)ATCC 824および大腸菌(E.coli)K−12菌株、DH10B亜系それぞれからのaadおよびadhE遺伝子を、pKHEM04に首尾よくクローニングし、このpKHEM04は、遺伝子発現のために、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Propionibacterium freudenreichii)(P. freudenreichii)亜種シャーマニイ(shermanii)IFO12424からの強力なp4プロモーターを含有する(例えば、先に言及したPiaoを参照)。得られたプラスミドpKHEM04−aadおよびpKHEM04−adhEを、電気穿孔法によって、3つの異なるプロピオン酸菌(プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ(P.acidipropionici)ATCC 4875、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(P.freudenreichii)DSM 20271およびプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(P.freudenreichii)DSM 4209)に形質転換する。プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ(P.acidipropionici)からはコロニーが得られず、これはpKHEM04−adhE宿主細胞との不和合性だけを示唆していると解釈され、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ(P.acidipropionici)が、アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現するために、同一または異なるベクターを用いて、遺伝子改変されることができないということではない。安定なコロニーは、pKHEM04−aadおよびpKHEM04−adhEで形質転換された両方のプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(P.freudenreichii)菌株について得られる。汚染から生じるいかなる偽陽性も排除するために、NLB寒天プレート上のコロニーを拾い上げ、液体培地中でプロピオン酸を生成するそれらの能力について検査する。陽性形質転換は、aadまたはadhEについてのプライマーにより陽性培養PCRをもたらすコロニー、および変異体から抽出されたプラスミドを鋳型として用いるaadまたはadhEプライマーにより陽性PCRをもたらすコロニーについて確認される。最終的に、形質転換体から抽出されたプラスミドを大腸菌(E.coli)に形質転換し、再抽出して、陽性PCRを大腸菌(E.coli)培養物からのおよび再抽出されたプラスミドからのaadまたはadhEプライマーで検出する。
図3、4および5は、グルコースを基質として増殖させた、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(P.freudenreichii)DSM 4209の野生型(WT)及びadhE遺伝子を発現する2つの変異体、Pf(adhE)−1ならびにPf(adhE)−2を用いる発酵速度を示す。予想通りに、WTではなく、2つの変異体だけがn−プロパノールを産生することができる。n−プロパノールは、72時間後に変異体の発酵ブロス中で検出され、約270時間で最大濃度(Pf(adhE)−1では342mg/LおよびPf(adhE)−2では291mg/L)に到達する。その後、プロパノール産生は、培地中のグルコースの限定された利用度のために、横ばい状態になる。グルコース消費および酸産生の両方が、WTを用いるよりも変異体を用いることで著しく速くなることは注目に値する。WTを用いるものに比べて変異体を用いる発酵では、プロピオン酸および酢酸の両方がより速い速度で産生され、より高い最終濃度に到達する。変異体では約9.9〜11.1g/Lのプロピオン酸および4〜4.5g/Lの酢酸が産生され、一方わずか8.7g/Lのプロピオン酸および2.8g/Lの酢酸がWTによって産生される。
基質としてグリセロールを用いるバッチ式発酵
種々の菌株を用いるバッチ式発酵の速度を、炭素源としてグリセロールを用いて更に検討し、結果を図6、7および8に示し、これと共に重要な速度パラメータを表2に要約する。今度も変異体は相当量のn−プロパノールを産生し、一方WTはいかなる検出可能な量も産生しない。グルコース発酵と比較すると、50〜65%多いn−プロパノールが高速でグリセロールから産生され、発酵の終わりには約500mg/Lの最大プロパノール力価に到達する。変異体が、200時間内に全ての20g/Lのグリセロールが消費される(消費速度:約0.10g/L・h)状態で、非常に速くかつより有効にグリセロールを使用することができるが、一方WTは300時間以内に約10g/Lのグリセロールを使用する(消費速度:約0.032g/L・h)にすぎないことは特に注目に値する。その結果、多量のプロピオン酸が、0.047g/L・hのより高い生産性で変異体によって産生され、この生産性はWTによるもの(0.021g/L・h)の二倍を超える生産であり、グルコースを炭素源として用いる場合(約0.031g/L・h)よりもさらに速い。しかしながら、プロピオン酸収率は、約0.64g/gでWTおよび変異体の双方で同様であり、これはグルコースからのもの(約0.49g/g)よりも高い。グルコース発酵と同様に、より多くのアセテートもWTによるよりも変異体によって産生される(約1.35対(vs.)約0.6g/L)。グリセロール発酵からのP/A比は、グルコースを用いるものよりも3〜4倍高く(約10対約3)、このことは、より多くのグリセロール炭素が、酢酸生合成よりもプロピオン酸生合成に向けられることを示唆している。
adhEの発現およびn−プロパノール生合成は、NADHバランスを変化させることができ、したがって、プロピオン酸発酵における炭素フラックス分配に影響を及ぼすことができる。発酵中間体(ピルベートおよびPEP)および酸化還元バランスで正味の変化がないとの前提条件に基づいて、様々な発酵条件下のモルフラックス分配を、基質(グルコースまたはグリセロール)消費および生成物形成に関する実験データから計算し、その結果を表3に要約する。グルコースを基質として用いる場合、ピルベートの大部分は、エムデン−マイヤーホフ−パルナス)(EMP)経路を通して生成される。WTと比較して、変異体は、細胞バイオマスに向けられるより少ない基質炭素を有する(5.9%対15.8%)が、アセテートに向けられるより多くの基質炭素を有し(28.0%%対21.1%)、これはおそらく、細胞がn−プロパノールおよびプロピオン酸生合成の増加により多くのNADHを必要とするためである。より還元された基質のグリセロールを用いる場合、全てのピルベートはEMP経路を通して生成され、変異体は、WTと比べて、細胞バイオマスに向けられるより多くの基質炭素を有し(11.9%対5.3%)及びスクシネートに向けられるより少ない炭素を有する(4.8%対11.6%)。その一方で、プロピオネートおよびn−プロパノールへの相対的炭素フラックスは、変異体及びWTについて約75%でほぼ同様である。アセテートへの炭素フラックスもまた、変異体(8.6%)およびWT(8.2%)の双方について同様である。n−プロパノールの生合成においてadhEによる追加のNADH消費を補償するために、僅かに多いアセテートが変異体で生成される。炭素フラックスを決定するために使用される等式が表5および6に提供されている。
プロパノールのプロピオン酸発酵に及ぼす影響:
n−プロパノールの細胞成長および発酵に及ぼす影響を例示するために、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(P.freudenreichii)DSM 4209 野生型細胞を、炭素源としてグリセロールおよび様々な量のn−プロパノール(0、0.5、1、5および10g/L)を含む培地中で培養する。図9、10および11に示すように、プロパノールは、0.1〜1g/Lの低濃度では細胞成長または発酵に著しく影響を及ぼさないが、10g/Lのより高い濃度では、非常に長い遅延期で細胞成長を阻害する。しかしながら、5g/Lのプロパノールの存在下では、細胞はグリセロールを消費することができ、遅延期の短期の適応の後に、非常に速い速度でプロピオン酸を産生することができる。特定の増殖速度、グリセロール消費速度、およびプロピオン酸生産性ならびに収率を、時間経過データから推定し、表4に要約する。この結果は、プロピオン酸生産性および力価が、5g/Lのn−プロパノールの存在下で約20%まで増加することを示している(p<0.05)。これと同時に、アセテート産生は、5〜10g/Lのプロパノールの存在下で著しく減少するが、低濃度レベルにおけるアセテート産生の大きな変動のために、P/A比に及ぼす影響は重要ではない。コハク酸産生は、試験された濃度範囲では、n−プロパノールによって影響されない。
Claims (21)
- n−プロパノール、プロピオン酸、またはこれらの組み合わせを生合成的に調製するための方法であって、
(a) 基質と、水と、プロピオニル−CoAに対して活性を有する、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現するために、40パーセント以上であるグアニン−シトシン含量を有する通性嫌気性生物から得られるadhE遺伝子を含むよう遺伝子改変されているプロピオン酸菌と、を含む出発発酵ブロスの発酵を行い、生成物としてn−プロパノール、プロピオン酸を含む発酵生成物ブロスを形成することと、
(b) 前記生成物のn−プロパノール、プロピオン酸、またはこれらの組み合わせの少なくとも一部を、前記発酵生成物ブロスから回収することと、を含む、方法。 - 前記遺伝子改変されたプロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Propionibacterium freudenreichii)種、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ(Propionibacterium acidipropionici)種、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記通性嫌気性生物が、大腸菌(Escherichia coli)である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記出発発酵ブロスが、刺激剤n−プロパノールを更に含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記刺激剤n−プロパノールが、細胞内で生成される、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞内で生成されるn−プロパノールが、
(a) 基質と、水と、プロピオニル−CoAに対して活性を有する、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現するために、40パーセント以上であるグアニン−シトシン含量を有する通性嫌気性生物から得られるadhE遺伝子を含むよう遺伝子改変されているプロピオン酸菌と、を含むブロスの発酵を行い、細胞内で生成されるn−プロパノールを含む発酵生成物ブロスを形成することと、
(b) 前記細胞内で生成されるn−プロパノールの少なくとも一部を前記発酵生成物ブロスから回収することと、によって調製される、請求項5に記載の方法。 - 前記基質が、グリセロール、グルコース、およびこれらの組み合わせから成る群から選択される炭素化合物を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記プロピオン酸菌が、前記adhE遺伝子を含むように遺伝子改変されていないプロピオン酸菌よりも、前記基質をn−プロパノールへと異化させるのに少なくとも5%以上効率的である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記遺伝子改変されたプロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Propionibacterium freudenreichii)種、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ(Propionibacterium acidipropionici)種、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- n−プロパノールまたはプロピオン酸生合成において使用するためにプロピオン酸菌を改変するための方法であって、
(a) 40パーセント以上のグアニン−シトシン含量を有する通性嫌気性生物からadhE遺伝子断片を得ることと、
(b) 前記プロピオン酸菌が、プロピオニル−CoAに対して活性を有する、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現するように、プロピオン酸菌のゲノムを、前記adhE遺伝子断片を含むよう改変することと、を含む方法。 - 前記プロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Propionibacterium freudenreichii)種、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ(Propionibacterium acidipropionici)種、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記adhE遺伝子断片が、大腸菌(Escherichia coli)から得られる、請求項10または11に記載の方法。
- 改変されたプロピオン酸菌であって、プロピオニル−CoAに対して活性を有する、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現するように、40%以上のグアニン−シトシン含量を有する通性嫌気性生物から得られた、挿入されたadhE遺伝子断片を含有するゲノムDNAを有するプロピオン酸菌を含む生合成で使用するための、改変プロピオン酸菌。
- プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ(Propionibacterium freudenreichii)種、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ(Propionibacterium acidipropionici)種、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項13に記載の改変プロピオン酸菌。
- 前記通性嫌気性生物が、大腸菌(Escherichia coli)である、請求項13または14に記載の改変プロピオン酸菌。
- n−プロパノール、プロピオン酸またはこれらの組み合わせを生合成的に調製するための方法であって、
出発発酵ブロスを培養してn−プロパノールおよびプロピオン酸を含む発酵生成物ブロスを形成すること、並びに
n−プロパノール、プロピオン酸またはこれらの組み合わせの少なくとも一部を前記発酵生成物ブロスから回収すること、
を含み、
前記出発発酵ブロスが基質、水およびプロピオン酸菌を含み、
前記プロピオン酸菌が、大腸菌株K−12から得られたadhE遺伝子断片を含むように遺伝子改変されており、前記adhE遺伝子断片によってコードされる二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現しており、
前記二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼがプロピオニルCoAに対する活性を有している、方法。 - 前記adhE遺伝子断片が、配列番号2に記載のヌクレオチド配列を有するPCRプライマーおよび配列番号3に記載のヌクレオチド配列を有するPCRプライマーを用いて大腸菌株K−12から得られたものである、請求項16に記載の方法。
- 大腸菌株K−12からadhE遺伝子断片を得ること、
前記adhE遺伝子断片を含むように前記プロピオン酸菌のゲノムを改変して、前記プロピオン酸菌が前記adhE遺伝子断片によってコードされる二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現させること、
を含む、n−プロパノールまたはプロピオン酸の生合成に使用するためのプロピオン酸菌を改変する方法。 - 前記adhE遺伝子断片が、配列番号2に記載のヌクレオチド配列を有するPCRプライマーおよび配列番号3に記載のヌクレオチド配列を有するPCRプライマーを用いて大腸菌株K−12から得られたものである、請求項18に記載の方法。
- 生合成で使用するための改変プロピオン酸菌であって、adhE遺伝子断片が挿入されたゲノムDNAを有しており、前記adhE遺伝子断片によってコードされる二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを発現しており、
前記adhE遺伝子断片が大腸菌株K−12から得られたものである、改変プロピオン酸菌。 - 前記adhE遺伝子断片が、配列番号2に記載のヌクレオチド配列を有するPCRプライマーおよび配列番号3に記載されるヌクレオチド配列を有するPCRプライマーを用いて大腸菌株K−12から得られたものである、請求項20に記載の改変プロピオン酸菌。
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