CN104059160B - 一种猴头菌细胞壁多糖及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种猴头菌细胞壁多糖及其制备方法，该猴头菌细胞壁多糖包含水溶性和碱溶性的细胞壁多糖，是通过胞内多糖的去除、粉碎水提、碱提和醇沉而制备得到的。本发明的方法充分提取了猴头菌中的细胞壁多糖，所得胞壁多糖的得率及含量都很高，可明显促进RAW264.7巨噬细胞株释放NO，具有体外免疫活性。
Description
技术领域
本发明涉及食药用真菌提取领域，具体的说是涉及一种猴头菌细胞壁多糖及其制备方法
背景技术
猴头菌(Hericium erinaceus)，在分类学上隶属于菌物界，担子菌门，担子菌纲，猴菇目，猴菇科，猴菇属，又名猴头蘑、熊头菇、刺猬菌，肉嫩味美，营养丰富，是著名的药食两用菌，国内已经广泛用于医治消化不良、胃溃疡、食道癌、胃癌、十二指肠癌、贲门癌等消化***的疾病。猴头多糖是猴头菌的主要有效成分，研究表明猴头多糖具有抗肿瘤、提高免疫力、降血糖、抗突变、抗衰老等功效。
目前针对猴头菌多糖的研究和利用主要是针对水提胞内多糖，其相关的制备工艺已有很多报道，但对于细胞壁多糖的提取还没有***全面的报道。值得说明的是，常规水提多糖后的猴头菌子实体残渣量非常可观，含有丰富的细胞壁多糖且它主要是由几丁质和葡聚糖组成，这部分多糖通常没有继续提取利用而被丢弃。真菌细胞壁多糖通常是β构型的葡聚糖，而且多以β-1,3、β-1,6方式连接，这部分葡聚糖具有很强的免疫活性。我们研究也发现猴头菌细胞壁多糖是以β构型的葡聚糖为主要成分，对其开发利用将有利于充分发挥猴头菌多糖的功效作用。
发明内容
本发明提供了一种猴头菌细胞壁多糖的制备方法，该方法包括如下步骤：
①胞内多糖的去除：将猴头菌加入10-20倍重量的水，常温浸泡30-60min，加热至沸腾，保持60-120min，过滤，收集残渣1；
②粉碎水提：将残渣1粉碎，加入10-20倍重量的水，常温浸泡30-60min，沸水提取，离心，分别收集上清液和残渣2；
③碱提：将残渣2，按料液比1:10-1:20(w/v)加入0.1-1M的NaOH溶液，4-10℃浸提2-4h，离心，收集提取液；
④醇沉：对步骤②中收集的上清液和步骤③中收集的提取液进行醇沉，离心收集沉淀，即为猴头菌细胞壁多糖。
其中步骤④中，对步骤②中收集的上清液和步骤③中收集的提取液进行醇沉，可以分别进行，得到的沉淀再合并；也可以先将上清液和提取液合并后再醇沉，最后收集沉淀。
其中步骤②中收集的上清液进行醇沉后，得到的沉淀为水溶性猴头菌细胞壁多糖；对步骤③中收集的提取液进行醇沉后，得到的沉淀为碱溶性猴头菌细胞壁多糖。
本发明还提供了一种由上述方法制备得到的猴头菌细胞壁多糖，其包括水溶性细胞壁多糖和碱溶性细胞壁多糖。
本发明采用残渣粉碎水提和水提后再碱提的方法制备猴头菌细胞壁多糖，得到的细胞壁多糖颜色浅、得率高，达到9.7％，多糖含量在50％以上。该发明能充分提取猴头菌子实体中的细胞壁多糖，提高了猴头菌子实体原料的利用率，且制备的猴头菌细胞壁多糖能够显著刺激巨噬细胞释放NO，从而增强机体的抗肿瘤能力。
具体实施方式
制备猴头菌水溶性细胞壁多糖：
①胞内多糖的去除：将猴头菌子实体加入10-20倍重量的水，常温浸泡30-60min，加热至沸腾，保持60-120min，过滤，残渣重复上述步骤，至滤液通过苯酚-硫酸法检测不到多糖为止，40-60℃烘干残渣；
②粉碎水提：将上述残渣粉碎5-20min(粉碎粒度200-300目)，加入10-20倍重量的水，常温浸泡30-60min，加热至沸腾，保持60-120min，9803g离心15min，残渣重复上述步骤，再提取1-2次，收集上清液和残渣；
③醇沉：上清液浓缩至料液比(w/v)为1:4-1:6，然后添加入无水乙醇，至乙醇终浓度达到60％-80％，4℃静置8-12h，离心收集沉淀，用70％-90％的乙醇洗涤沉淀2-3次；
④干燥：沉淀加水溶解，挥干乙醇后冷冻干燥即获得所需的水溶性胞壁多糖；
制备碱溶性细胞壁多糖：
将上述制备猴头菌水溶性细胞壁多糖步骤②中收集的残渣于40-60℃烘干，按料液比1:10-1:20(w/v)加入0.1-1M的NaOH溶液，4-10℃浸提2-4h，高速离心，残渣重复上述步骤，再提取1-2次，合并提取液；
提取液通过3-6M的HCl调PH7.0，高速离心，浓缩至料液比(w/v)为1:4-1:6，向该浓缩液中加入无水乙醇，至乙醇终浓度达到60％-80％，4℃静置8-12h，离心收集沉淀，用70％-90％的乙醇洗涤沉淀2-3次；
沉淀加水溶解，挥干乙醇后冷冻干燥即获得所需的碱溶性细胞壁多糖。
合并水溶性细胞壁多糖和碱溶性细胞壁多糖，即得到所需的猴头菌细胞壁多糖。
实施例1：
水溶性猴头菌细胞壁多糖的提取：
猴头菌子实体购于上海国森生物科技有限公司。
将猴头菌加入15倍重量的水，常温浸泡30min，加热至沸腾，保持120min，过滤，收集残渣，重复上述步骤至胞内多糖提取完全，收集残渣1；
将残渣1粉碎15min(粉碎粒度200-300目)，称取200g，加入4L水，室温浸泡30min，加热至沸腾，保持120min，9803g离心15min，沉淀重复上述步骤，再提取2次，合并提取液，留取残渣2备用；
提取液高速离心，浓缩至料液比1:5，然后添加入无水乙醇，至乙醇终浓度达到重量百分比为70％，4℃静置12h，离心收集沉淀，用80％的乙醇洗涤沉淀3次；
最后沉淀加水溶解，挥干乙醇后冷冻干燥即获得所需的水溶性猴头菌细胞壁多糖。
碱溶性猴头菌胞壁多糖的提取：
将残渣2于50℃烘干；
将残渣2和碱液按照料液比1：20(w/v)加入0.5M的NaOH溶液，4℃浸提4h，浸提1次，9803g离心15min，收集提取液；
提取液用6M的HCl调PH7.0，再经高速离心，浓缩至料液比1：5，向该浓缩液中加入无水乙醇，至乙醇终浓度达到重量百分比为70％，4℃静置12h，离心收集沉淀，用80％的乙醇洗涤沉淀3次；
沉淀加水溶解，挥干乙醇后冷冻干燥即获得所需的碱溶性猴头菌细胞壁多糖。
合并水溶性猴头菌细胞壁多糖和碱溶性猴头菌细胞壁多糖，即得猴头菌细胞壁多糖。
多糖得率及含量测定：多糖得率＝多糖的质量(g)/子实体的质量(g)×100％
多糖含量用苯酚-硫酸法测定，精密称取本品10mg置100ml容量瓶中，加水约80ml，加热助溶后冷却至室温，在100ml容量瓶中定容。精密吸取样品1.0ml，置15ml试管中，分别加入苯酚、硫酸试剂，充分反应后在490nm处测定吸光度值，以葡聚糖为标准品计算样品的糖含量。
制备所得的猴头菌细胞壁多糖得率为9.7％，多糖含量为58.4％。
实施例2：
细胞壁多糖体外刺激巨噬细胞释放NO的活性测定
1、样品准备：称取实施例1中制备得到的猴头菌细胞壁多糖于灭菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配置成浓度5mg/mL的溶液。充分溶解后以15000r/min离心30min，无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成2mg/ml、0.5mg/mL待用。
2、细胞培养：取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞株(购自中科院细胞所)，用DMEM完全培养基(购自Gibco公司)在37℃、含5％CO2条件下传代培养，用0.05％胰酶或5％EDTA溶液消化，混悬液1000rpm/min离心3min后收集细胞，计数备用。
3、试剂配制及标准曲线绘制
Griess试剂的配制：在烧杯中加入6.25ml H3PO3，加入蒸馏水250ml，分别加入2.5g的sulfanilamide(4-氨基苯磺酰胺，Sigma公司)和0.25g的naphthylethylenediamine dihydrochloride(盐酸萘乙二胺，Sigma公司)用磁力搅拌器至全部溶解，棕色试剂瓶4℃冰箱保存。
标准曲线绘制：配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35、40μM共九个；取100μL于96孔板孔，加入50μL Griess试剂，测定543nm吸光值，标准曲线每个浓度3个重复，根据吸光值绘制标准曲线。
4、样品刺激巨噬细胞释放NO量的测定：收集RAW264.7细胞，用无色RPMI1640培养基(购自Gibco公司)(10％胎牛血清+1％抗生素液体)将细胞稀释至5×105/mL，加入96孔板，每孔加入180μL，然后再加入20μL待测样品，使得样品终浓度依次为500μg/ml，200μg/ml和50μg/ml，阳性对照为LPS(终浓度为1μg/mL)，阴性对照为PBS，37℃培养48小时。取100μL上清于96孔板孔，加入50μl Griess试剂，室温孵浴10分钟，测定543nm吸光值。根据标准曲线计算细胞NO的释放量。
实验结果：
由本发明制备的猴头菌细胞壁多糖在浓度50μg/mL时，刺激巨噬细胞产生NO的量(单位：μmoL/5.0×105cells)为：22.35；在浓度200μg/mL时，产生NO量为31.92；在浓度500μg/mL时，产生NO量为46.01；阴性对照7.40，阳性对照(浓度1μg/mL)39.37。由此可以看出猴头菌细胞壁多糖，具有刺激巨噬细胞产生NO的活性，从而增强机体的抗肿瘤能力。
Claims (2)
1.一种猴头菌细胞壁多糖的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
①胞内多糖的去除：将猴头菌加入10-20倍重量的水，常温浸泡30-60min，加热至沸腾，保持60-120min，过滤，收集残渣1；
②粉碎水提：将残渣1粉碎，粉碎粒度200-300目，加入10-20倍重量的水，常温浸泡30-60min，沸水提取，离心，分别收集上清液和残渣2；
③碱提：将残渣2，按料液比1:10-1:20w/v加入0.1-1M的NaOH溶液，4-10℃浸提2-4h，离心，收集提取液；
④醇沉：对步骤②中收集的上清液和步骤③中收集的提取液进行醇沉，离心收集沉淀，即为猴头菌细胞壁多糖。
2.一种由权利要求1所述方法制备得到的猴头菌细胞壁多糖。
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