CN104049025A - 微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析*** - Google Patents

微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析*** Download PDF

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一种微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，包括：直流高压电源、内置纳升样品环的纳升进样阀、微量注射泵、毛细管三通、分离毛细管、检测器和装有电泳缓冲液且带有瓶塞的电泳废液瓶；本发明毛细管电泳分析***，用微量注射泵以nL/min的流速驱动液流在毛细管中整体地从正极朝负极方向移动，通过用微量注射泵驱动液流代替电渗流，使样品中各组分由于电泳速度的不同而实现分离；具有分离效率高、分析速度快、操作简单、重现性好等特点。

Description

微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***
（一）技术领域
本发明涉及毛细管电泳分析***，特别是涉及微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***及其操作方法。
（二）背景技术
自20世纪70年代以来，毛细管电泳因其分离效率高、试剂消耗少、分析时间短等优点在化学、生物学、环境学、食品、药学、医学等领域应用广泛。区带毛细管电泳是毛细管电泳中最常用的一种分离方式，对于离子型化合物有很好的分离能力，已广泛地应用于氨基酸、药物、金属离子、环境试样中的有毒有害物质等小分子量化合物的分离分析，也可用于蛋白质等生物大分子的分离。
毛细管电泳所用的石英毛细管柱，在pH>3情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成了双电层。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗；在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流两种速度的矢量和，正离子的电泳方向和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的电泳方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出。虽然样品中各组分均以相同的电渗流速度朝负极方向移动，但由于样品中各组分因其分子大小、所带电荷数的不同，在电场中电泳速度不同而实现分离。
由于温度、pH、电解质溶液的成分与浓度、毛细管内壁的活化状况和对溶质的吸附都影响电渗流的大小，且影响毛细管电泳进样量的因素较多，因此毛细管电泳的分离和测定的重现性不如高效液相色谱和气相色谱，在实际应用中受到限制。
（三）发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、重现性好、不依靠电渗流驱动的毛细管电泳分析***。用微量注射泵以nL/min的流速驱动液流在毛细管中整体地从正极朝负极方向移动，通过用微量注射泵驱动液流代替电渗流，使样品中各组分由于电泳速度的不同而实现分离。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，所述的毛细管电泳分析***由微量注射泵、纳升进样阀连接后通入毛细管三通的第一端口，所述毛细管三通的第二端口连接分离毛细管，分离毛细管通过检测器的检测窗口后通入装有电泳缓冲液的电泳废液瓶中电泳缓冲液的液面下，所述毛细管三通的第三端口通过第一铂丝接入直流高压电源的接地电极，所述直流高压电源的高压输出端通过第二铂丝***所述的电泳废液瓶电泳缓冲液的液面下；在实现高压屏蔽的同时，通过分离毛细管中的电泳缓冲液，与分离毛细管的入口端经高压电源的接地电极构成电泳回路，所述的电泳废液瓶瓶口带有密封瓶塞，所述的分离毛细管及所述第二铂丝各自穿过所述的密封瓶塞并与所述的密封瓶塞紧密配合。
进一步，本发明所述的微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，其中所述的检测器选自紫外-可见光分光检测器、激光诱导荧光检测器、发光检测器或电化学检测器中的任一种。
再进一步，本发明所述的微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，其中所述的分离毛细管选自石英毛细管，玻璃毛细管或聚合物毛细管中的任一种。
更进一步，所述的电泳废液瓶为带有瓶塞的玻璃瓶，电泳废液瓶的瓶塞上插有一根0.5mm内径的PEEK管，分离毛细管通过所述PEEK管***所述的电泳废液瓶的电泳缓冲液的液面下。
本发明微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，其中所述的纳升进样阀内置纳升体积的样品环，进样时样品环内样品全部注入分离毛细管，进样精确且高度重现，并且，不同体积的样品环也可自由更换，从而实现不同体积的纳升试样引入分离毛细管。
本发明还提供了微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***的应用方法，所述的应用方法包括进样和分离两个阶段：(1)进样阶段，在高压电源的控制面板上设定输出电压，在紫外-可见光分光检测器的控制面板上设定待测样品合适的波长；启动高压电源和检测器，通过进样针将待测样品手动注入到纳升进样阀的样品环，然后将纳升进样阀切换至注射状态，此时微量注射泵输送电泳缓冲液将样品区带注入到充满电泳缓冲液的分离毛细管中；(2)分离阶段，纳升进样阀的样品区带在电场力和微量注射泵驱动力的共同作用下向电泳废液瓶运动，样品中各组分因其分子大小、所带电荷数的不同，在电场中电泳速度不同实现分离，经过检测器进行分析检测得出结论。
本发明微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***在操作时，可通过调节微量注射泵的流速优化样品的分析时间，对于电泳速度差异大的分析物可使用高的流速，对于电泳速度差异小的分析物可使用较低的流速，对于含电泳速度差异大小不一的复杂体系甚至可以用流速梯度实现快速高效分离。
本发明微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，主要使用微量注射泵来驱动毛细管内液流，焦耳热效应远小于现有的电渗流驱动的毛细管电泳分析***，因此本发明微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***可使用比电渗流驱动液流的毛细管电泳分析***更高的分离场强。
本发明微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，其中分离毛细管使用前不需要进行物理或者化学处理，并且在更换电泳缓冲液时，可以通过增加微量注射泵的流速来大大缩短电泳缓冲液和分离毛细管表面的平衡时间。
本发明提供的微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，具有分离效率高、分析速度快、操作简单、重现性好等特点。
（四）附图说明
图1是微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***示意图；
图中：1－高压电源，2－纳升进样阀，3－微量注射泵，4－毛细管三通，5－分离毛细管，6－检测器，7－电泳废液瓶，8－第一铂丝，9－第二铂丝；
图2是常规毛细管电泳分析***示意图；
图中：a－温控***，b－分离毛细管，c－紫外检测器，d－高压电源，e－第三铂丝，f－第四铂丝，g－第一缓冲液瓶，h－第二缓冲液瓶，i－记录/处理***，j－电泳图；
图3是微量注射泵的流量为0.15μL/min时碘离子和碘酸根的电泳图；
图4是微量注射泵的流量为0.25μL/min时碘离子和碘酸根的电泳图；
图5是微量注射泵的流量为0.375μL/min时碘离子和碘酸根的电泳图；
图6是采用常规毛细管电泳分离碘离子和碘酸根的电泳图。
（五）具体实施方式
本说明书的实施例所述的内容仅仅是对发明构思的实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式，本发明的保护范围也及于本领域技术人员根据本发明构思所能够想到的等同技术手段。
实施例1
参见图1，本发明微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，包括：直流高压电源1、内置纳升样品环的纳升进样阀2、微量注射泵3、毛细管三通4、分离毛细管5、检测器6和装有电泳缓冲液且带有瓶塞的电泳废液瓶7；所述的毛细管电泳分析***由微量注射泵3、纳升进样阀2连接后通入毛细管三通4的第一端口，所述毛细管三通的第二端口连接分离毛细管5，分离毛细管5通过检测器6的检测窗口后通入装有电泳缓冲液且带有瓶塞的电泳废液瓶7中电泳缓冲液的液面下，所述毛细管三通的第三端口通过第一铂丝8接入直流高压电源的接地电极，所述直流高压电源的高压输出端通过第二铂丝9也***所述的电泳废液瓶7中电泳缓冲液的液面下；在实现高压屏蔽的同时，通过分离毛细管中的电泳缓冲液，与分离毛细管的入口端经高压电源的接地电极构成电泳回路，所述的电泳废液瓶瓶口带有密封瓶塞，所述的分离毛细管及所述第二铂丝各自穿过所述的密封瓶塞并与所述的密封瓶塞紧密配合。
所述的检测器选自紫外-可见光分光检测器；所述的分离毛细管选自石英毛细管，所述的电泳废液瓶为带有瓶塞的玻璃瓶，电泳废液瓶的瓶塞上插有一根0.5mm内径的PEEK管，分离毛细管通过所述PEEK管***所述的电泳废液瓶的电泳缓冲液的液面下。所述的微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，所述的纳升进样阀内置纳升体积的样品环。
操作条件：分离毛细管为聚酰亚胺涂层的熔融石英毛细管，总长度为50cm（有效分离长度32cm），外径为365μm，内径为50μm，聚酰亚胺涂层厚20μm；检测器为紫外-可见光分光检测器（波长范围190～700nm），检测波长为210nm；电泳缓冲液为5mM的硼砂；样品环的体积为10nL；分离场强为-200V/cm；分析物为碘离子（10mg/L）和碘酸根离子（20mg/L）。
具体操作方法由基线平衡、进样和分离三个阶段组成：
在基线平衡阶段，先截取50-cm的商品石英毛细管，在32-cm处用丁烷打火机烧掉表面的聚酰亚胺涂层，再用甲醇清洗灼烧处，得到洁净的检测窗；按照图1连接好装置，然后在微量注射泵的控制面板上将其流速设定为1μL/min，在高压电源的控制面板上设定输出电压为-10kV，在紫外-可见光分光检测器的控制面板上设定检测波长为210nm；启动微量注射泵、高压电源和紫外-可见光分光检测器，同时在电脑上通过软件监测基线，当基线平稳后，即可消除检测背景的影响，停止微量注射泵、高压电源和紫外-可见光分光检测器，进入进样阶段。
在进样阶段，在微量注射泵的控制面板上将其流速设定为0.15μL/min并启动微量注射泵开始输液；然后将纳升进样阀的阀位置为Load(载样)状态，通过10-μL规格的平头液相进样针吸入2μL试样，将样品手动注入到纳升进样阀的样品环后，手动将进样阀切换至Inject(注射)状态，此时微量注射泵输送电泳缓冲液将样品区带注入到充满电泳缓冲液的分离毛细管中，同时启动高压电源和紫外-可见光分光检测器以及信号采集，进入分离阶段；
在分离阶段，纳升进样阀的样品区带在电场力和微量注射泵驱动力的共同作用下向电泳废液瓶运动，由于样品中各组分因其分子大小、所带电荷数的不同，在电场中电泳速度不同实现分离，经过检测器测定其紫外吸收，得到吸收信号随时间变化的电泳图3。
在微量注射泵的控制面板上将其流速设定为0.25μL/min，其他条件不变，重复进样阶段和分离阶段，可得到电泳图4。
在微量注射泵的控制面板上将其流速设定为0.375μL/min，其他条件不变，重复进样阶段和分离阶段，可得到电泳图5。
电泳缓冲液在分离毛细管中流动的线速度等于微量注射泵的体积流速除以毛细管横截面积，即微量注射泵的流量分别为0.15μL/min、0.25μL/min或0.375μL/min时，电泳缓冲液在分离毛细管中流动的线速度分别为1.27mm/s、2.12mm/s或3.18mm/s。
对比例1
参见图2，常规的毛细管电泳分析***，包括：温控***a、分离毛细管b、紫外检测器c、高压电源d、第三铂丝e、第四铂丝f、第一缓冲液瓶g、第二缓冲液瓶h、记录/处理***i、电泳图j；所述第一缓冲液瓶g和第二缓冲液瓶h中装有电泳缓冲液，所述高压电源d的高压输出端通过第三铂丝e***第一缓冲液瓶g中电泳缓冲液的液面下，接地端通过第四铂丝f***第二缓冲液瓶h中电泳缓冲液的液面下，所述分离毛细管b的一端***第一缓冲液瓶g中电泳缓冲液的液面下，另一端通过紫外检测器c的检测窗口后***第二缓冲液瓶h中电泳缓冲液的液面下，由此构成电泳回路；所述紫外检测器c与记录/处理***i连接，检测信号经过记录/处理***i处理后输出电泳图。
操作条件：分离毛细管为聚酰亚胺涂层的熔融石英毛细管，总长度为50cm（有效分离长度32cm），外径为365μm，内径为50μm，聚酰亚胺涂层厚20μm；检测器为紫外-可见光分光检测器（波长范围190～700nm），检测波长为210nm；电泳缓冲液为5mM的硼砂；进样方式为电动进样，进样电压10kV，进样时间10s；分离场强为-200V/cm；分析物为碘离子（10mg/L）和碘酸根离子（20mg/L）。
操作过程：由毛细管预处理、基线平衡、进样和分离三个阶段组成：
（1）毛细管预处理：截取50-cm的商品石英毛细管，在32-cm处用丁烷打火机烧掉表面的聚酰亚胺涂层，再用甲醇清洗灼烧处，得到洁净的检测窗；然后依次用1M NaOH、超纯水、5mM硼砂各冲洗15分钟，将分离毛细管充满5mM硼砂后待用。
（2）基线平衡阶段：将分离毛细管穿过检测器的光窗，毛细管两端***第一缓冲液瓶和第二缓冲液瓶的液面下，高压电源输出高压端通过第三铂丝***到第一缓冲液瓶的液面下，其接地端通过第四铂丝***到第二缓冲液瓶的液面下。在高压电源的控制面板上设定分离电压为10kV，在紫外-可见光分光检测器的控制面板上设定检测波长为210nm；启动高压电源和紫外-可见光分光检测器，同时在电脑上通过软件监测基线，当基线平稳后，即可消除检测背景的影响，停止高压电源和紫外-可见光分光检测器，进入进样阶段。
（3）进样阶段：在高压电源的控制面板上设定进样电压为10kV，设定进样时间为10s；用装有碘离子（10mg/L）和碘酸根离子（20mg/L）混合溶液的样品瓶替换第一缓冲液瓶，然后启动高压电源的进样电压，在进样电压产生的电动力作用下，分析物进入到分离毛细管，当进样时间结束后，再用第一缓冲液瓶替换装有碘离子和碘酸根离子混合溶液的样品瓶。
（4）分离阶段：启动高压电源的分离电压，样品区带在电场力和电渗流的共同作用下向第二缓冲液瓶运动，由于样品中各组分因其分子大小、所带电荷数的不同，在电场中电泳速度不同实现分离，经过检测器测定其紫外吸收，得到吸收信号随时间变化的电泳图6。一次进样完毕后，依次用0.1M NaOH、超纯水、5mM硼砂各冲洗5分钟，将分离毛细管充满5mM硼砂后等待下一次进样。
通过实施例1和对比例1的比较可以看出：常规毛细管电泳要花费很长的时间处理分离毛细管，而且其分析速度较慢。同时，其进样和分离均受电渗流的影响，重现性较差。而本发明通过用微量注射泵驱动液流代替电渗流，不仅效率更高，且重现性好，操作也更为简单。

Claims (7)

1.一种微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，其特征在于，所述的毛细管电泳分析***由微量注射泵、纳升进样阀连接后通入毛细管三通的第一端口，所述毛细管三通的第二端口连接分离毛细管，分离毛细管通过检测器的检测窗口后通入装有电泳缓冲液的电泳废液瓶中电泳缓冲液的液面下，所述毛细管三通的第三端口通过第一铂丝接入直流高压电源的接地电极，所述直流高压电源的高压输出端通过第二铂丝***所述的电泳废液瓶电泳缓冲液的液面下；在实现高压屏蔽的同时，通过分离毛细管中的电泳缓冲液，与分离毛细管的入口端经高压电源的接地电极构成电泳回路，所述的电泳废液瓶瓶口带有密封瓶塞，所述的分离毛细管及所述第二铂丝各自穿过所述的密封瓶塞并与所述的密封瓶塞紧密配合。 
2.如权利要求1所述的微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，其特征在于所述的检测器选自紫外-可见光分光检测器、激光诱导荧光检测器、发光检测器或电化学检测器中的任一种。 
3.如权利要求1所述的微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，其特征在于所述的分离毛细管选自石英毛细管，玻璃毛细管或聚合物毛细管中的任一种。 
4.如权利要求1所述的微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***，其特征在于所述电泳废液瓶的瓶塞上插有一根0.5mm内径的PEEK管，所述的分离毛细管通过所述PEEK管***所述的电泳废液瓶的电泳缓冲液的液面下。 
5.如权利要求1所述的微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析 ***，其特征在于所述的纳升进样阀内置纳升体积的样品环。 
6.一种如权利要求1所述的微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***的应用方法，其特征在于所述的应用方法包括进样和分离两个阶段；(1)进样阶段，在高压电源的控制面板上设定输出电压，在紫外-可见光分光检测器的控制面板上设定待测样品合适的波长；启动高压电源和检测器，通过进样针将待测样品手动注入到纳升进样阀的样品环，然后将纳升进样阀切换至注射状态，此时微量注射泵输送电泳缓冲液将样品区带注入到充满电泳缓冲液的分离毛细管中；(2)分离阶段，纳升进样阀的样品区带在电场力和微量注射泵驱动力的共同作用下向电泳废液瓶运动，样品中各组分因其分子大小、所带电荷数的不同，在电场中电泳速度不同实现分离，经过检测器进行分析检测得出结论。 
7.如权利要求7所述的微量注射泵驱动液流的毛细管电泳分析***的分析方法，其特征在于所述的方法通过调节微量注射泵的流速优化样品的分析时间，根据样品中各组分电泳速度差异来确定微量注射泵的流速。 
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