JP6422131B2 - 分離分析用キャピラリーデバイス、分離分析用マイクロ流体チップ、タンパク質又はペプチド分析方法、電気泳動装置、及び分離分析用マイクロ流体チップ電気泳動装置 - Google Patents

Description

本発明は、分離分析用キャピラリーデバイス、分離分析用マイクロ流体チップ、タンパク質又はペプチド分析方法、電気泳動装置、及び分離分析用マイクロ流体チップ電気泳動装置に関する。
本願は、２０１３年１１月１２日に、日本に出願された特願２０１３−２３４１４６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

タンパク質はリン酸化や糖鎖付加などの翻訳後修飾によって、同一の遺伝子に由来しながら複数の分子型として存在することが多い。このような分子型の分布パターンは細胞や個体における当該タンパク質機能の調節に関わっており、また、裏を返せば細胞や個体の状態を反映していると考えられ、そのパターンから生体の状態に関する有用な情報を得ることができる。タンパク質の翻訳後修飾による分子型パターンの解析に大きな可能性を持つ方法として、分離能が高く、短時間に分離を完了するキャピラリー等電点電気泳動がある。

しかし、血清などの生体試料をキャピラリー等電点電気泳動で分析する場合には主に２つの問題がある。
一つは、アルブミンなどの高濃度タンパク質が分析対象である低濃度タンパク質を覆い隠してしまい、分析対象タンパク質の検出を困難にする点である。また高濃度タンパク質が分離過程で沈殿し、検出の際のノイズ発生の原因にもなる。
もう一つは、試料中に存在する塩が、等電点電気泳動の焦点化に要する時間を長引かせ、また分離パターンを変えてしまう点である。

これに対して、非特許文献１では、タンパク質分析装置を用いた分析方法であって、固相抽出と等電点電気泳動を連動させる方法が提案されている。

従来、固相抽出と、ゾーン電気泳動分離とのオンライン結合を目的としたデバイスが提案されている。
例えば、特許文献１には、キャピラリー電気泳動装置、並びにそこで用いられるゾーン電気泳動用キャピラリーと一体化したオンライン試料濃縮担体の構造が開示されている。
特許文献２には、キャピラリーゾーン電気泳動における希薄試料の濃縮を目的とした、オンライン吸着カラムの構造が提案されている。
特許文献３には、キャピラリーゾーン電気泳動において低濃度試料の濃縮のために吸着担体をオンライン結合することが提案されている。
非特許文献２には、内壁にオクタデシル基を結合した固相抽出用キャピラリーとゾーン電気泳動用キャピラリーとを結合し、オクタデシル基結合部分で濃縮した試料をオンライン分離することにより検出感度を向上できることが示されている。
また、非特許文献３〜６では、固相抽出と、キャピラリーゾーン電気泳動とのオンライン結合についての検討がなされている。

一方、非特許文献７〜８には、分岐路を介して固相抽出と等電点電気泳動の統合を目的とするマイクロ流体チップが開示されている。具体的には、非特許文献７〜８に記載のマイクロ流体チップは、固相抽出担体から目的タンパク質を等電点電気泳動用チャネルに溶離させた後、等電点電気泳動用チャネルを挟み込むように作られた分岐チャネルに電極液を満たして、電極に接続するように構成されている。

米国特許第５２０２０１０号 米国特許第５２４６５７７号 米国特許第５３４０４５２号

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しかしながら、非特許文献１で用いられる固相抽出担体は、外径０．３４ｍｍの光ファイバーの先端部表面に抽出相を有するものであり、試料液に一定時間浸すことによって、試料成分を吸着するものである。該固相抽出担体は試料中の標的分子の一部を吸着するようにデザインされており、標的分子のほぼ完全な捕捉を目的としたものではない。そのため、定量を目的とする場合には吸着時間、温度、試料液の粘性など、吸着反応の速度論に関係する因子を精密に制御しなければならない。また、標的分子の一部のみを吸着するので、最大の感度を得ることができない。キャピラリー等電点電気泳動分析の際には、該固相抽出担体を等電点電気泳動用キャピラリーの一端に設けられた内径０．３８ｍｍの固相抽出ファイバー挿入口内に挿入して電気泳動を開始する。該固相抽出担体を用いるには等電点電気泳動用キャピラリーと電極液の電気的接続のためにミクロ多孔性膜を介する必要があるなど、一般的キャピラリー電気泳動装置では該固相抽出担体を用いることができない。

また、特許文献１〜３及び非特許文献２〜６に記載されたデバイスはいずれも、固相抽出とキャピラリーゾーン電気泳動とのオンライン結合を目的としたものであって、固相抽出とキャピラリー等電点電気泳動とを組み合わせることについては一切記載も示唆もしていない。また、固相抽出とキャピラリーゾーン電気泳動をオンライン結合した分析法は広く使われるに至っていない。

また、非特許文献７〜８においては、固相抽出と、等電点電気泳動とを、分岐チャネルを接続しているが、固相抽出担体に捕捉された試料の全量を等電点電気泳動チャネルに移行させるためには、溶離した試料ゾーンの全体が等電点電気泳動用チャネルに納まるように、幅の狭いゾーンとして溶離する必要があるが、これを実現することは必ずしも容易ではないという問題があった。
加えて、非特許文献７に記載されたようなマイクロ流体チップの使用には、チップのチャネル入口で流れを止めるためのマイクロバルブが複数個（非特許文献７では８個）必要であるが、所望の流体制御が可能な加工精度の微細バルブの製造が困難であるという問題があった。
さらに、等電点電気泳動用流路の陰極端と電極を接続するチャネルには、水酸化ナトリウム溶液等の塩基溶液を満たす必要がある。しかしながら、この塩基溶液が、電気浸透を抑制するためにチャネル内壁に施された中性ポリマーコーティングの剥離を加速し、再現性の検討などに要する多数回の分析を不可能にするという問題があった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便かつ高感度にタンパク質又はペプチドを分析することができる分離分析用キャピラリーデバイス、分離分析用マイクロ流体チップ、タンパク質又はペプチド分析方法、電気泳動装置、及び分離分析用マイクロ流体チップ電気泳動装置を提供する。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、固相抽出カラムと等電点電気泳動用キャピラリーを一体化することにより、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記の特徴を有する分離分析用キャピラリーデバイス、分離分析用マイクロ流体チップ、タンパク質又はペプチド分析方法、電気泳動装置、及び分離分析用マイクロ流体チップ電気泳動装置を提供する。

（１）等電点電気泳動用キャピラリーと、該等電点電気泳動用キャピラリーに直結する固相抽出カラムと、を一体として備えてなることを特徴とする分離分析用キャピラリーデバイス。
（２）前記等電点電気泳動用キャピラリーは、内壁に親水性ポリマーが結合されてなる前記（１）の分離分析用キャピラリーデバイス。
（３）前記固相抽出カラムは、アフィニティークロマトグラフィー担体、イオン交換クロマトグラフィー担体、又は、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体を有する前記（１）又は（２）の分離分析用キャピラリーデバイス。
（４）前記固相抽出カラムに電荷を有する解離基を導入することにより、該固相抽出カラムで発生する電気浸透を抑制した前記（１）〜（３）のいずれかの分離分析用キャピラリーデバイス。
（５）前記（１）〜（４）のいずれかの分離分析用キャピラリーデバイスに相当する構造を備えたことを特徴とする分離分析用マイクロ流体チップ。
（６）前記（１）〜（４）のいずれかの分離分析用キャピラリーデバイスを用いたタンパク質又はペプチド分析方法であって、
標的タンパク質又はペプチドを含有する試料を、固相抽出カラムに導入し、固相抽出カラムに標的タンパク質又はペプチドを吸着させる工程１と、
前記固相抽出カラムに吸着させた標的タンパク質又はペプチドを分離分析用キャピラリーデバイス内に溶離する工程２と、
前記分離分析用キャピラリーデバイスに電圧を印加し、溶離した前記標的タンパク質又はペプチドを、前記等電点電気泳動用キャピラリー内で、焦点化する工程３と、
焦点化後、前記標的タンパク質又はペプチドを検出する工程５と、
を有することを特徴とするタンパク質又はペプチド分析方法。
（７）前記工程３と、前記工程５の全体に亘って、前記等電点電気泳動用キャピラリー両端の圧力差を調整して前記固相抽出カラムで発生する電気浸透を制御する工程４を有する前記（６）のタンパク質又はペプチド分析方法。
（８）前記（１）〜（４）のいずれかの分離分析用キャピラリーデバイスと、該分離分析用キャピラリーデバイス中に存在する２種以上の液の境界位置を検出する一以上の境界検出器を有する検出装置と、を備えた電気泳動装置。
（９）前記境界検出器が、注入された試料液と、他の液との境界位置を検出する境界検出器である前記（８）の電気泳動装置。
（１０）前記境界検出器が、両性担体液と、溶離液または電極液との境界位置を検出する境界検出器である前記（８）又は（９）の電気泳動装置。
（１１）前記境界検出器が、非接触若しくは接触型の電気伝導度検出器、屈折率検出器、吸光度検出器、蛍光検出器、又は散乱光検出器である前記（８）〜（１０）のいずれかの電気泳動装置。
（１２）前記検出装置が、さらに、等電点電気泳動により分離された試料を検出する試料検出器を有する前記（８）〜（１１）のいずれかの電気泳動装置。
（１３）前記分離分析用キャピラリーデバイスが、逆Ｕ字型に配置された前記（８）〜（１２）のいずれかの電気泳動装置。
（１４）前記（８）〜（１３）のいずれかの電気泳動装置と機能的に同じ構造を備えたことを特徴とする分離分析用マイクロ流体チップ電気泳動装置。

本発明によれば、試料に含まれる妨害物質を簡便に除去し、高感度かつ高精度にタンパク質又はペプチドを等電点の違いに基づいて分離して分析することができる。

本発明に係る分離分析用キャピラリーデバイスの実施形態の一例を示す断面図である。 本発明に係る分離分析用マイクロ流体チップの実施形態の一例を示す断面図である。 本発明に係るタンパク質又はペプチド分析方法の実施形態の一例の説明図である。 実施例の結果である。 本発明に係る電気泳動装置の実施形態の一例を示す概略説明図である。

以下、図を用いて実施形態を具体的に説明するが、本発明は各図に示す実施形態に限定されるものではない。

＜分離分析用キャピラリーデバイス＞
図１に示すように、本発明の分離分析用キャピラリーデバイス１は、固相抽出カラム２と、該固相抽出カラム２に直結する等電点電気泳動用キャピラリー３と、を一体として備えてなる。本発明において「直結する」とは、固相抽出カラムと、等電点電気泳動用キャピラリーとが、他のカラム、キャピラリー、流路、チャネル等を介さずに連結していることをいう。
キャピラリー等電点電気泳動は、様々な等電点をもつ両性電解質の混合物である両性担体とタンパク質などの試料とをキャピラリー内に導入し、電圧印加により試料成分の等電点の違いにより分離を行う手法である。以下、便宜上、「試料」を「タンパク質」と言うことがあるが、試料はタンパク質に限定されるものではない。

分離分析用キャピラリーデバイス１に用いられるキャピラリーとしては、耐食性に優れ、電気伝導率が低く、非常に透明であるなどの観点から溶融シリカキャピラリーが好ましいが、それに限らず同等あるいはそれに優る性質を有するものであればよい。
分離分析用キャピラリーデバイス１の内径は、１〜５００μｍが好ましい。分離分析用キャピラリーデバイス１の内径が係る範囲内にあることにより、電圧印加に伴うジュール熱の放熱性が高く、高電圧の印加が可能である。従って、微小量の試料で高速分離が可能である。

等電点電気泳動用キャピラリー３は、内壁に溶融シリカ由来のシラノール基を有することによる、タンパク質又はペプチドの吸着と電気浸透流を抑制する観点から、キャピラリーの内壁に親水性ポリマーを結合させたものが好ましい。親水性ポリマーとしては、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリジエチルアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリオール類（ポリグリセリン）、デキストラン、アガロース等が挙げられる。結合は物理的吸着であっても、化学結合によるものであってもよい。例えば、内壁に親水性ポリマーを予め化学的あるいは物理的に結合させたキャピラリーを用いてもよく、両性担体液（分離液）中に親水性ポリマーを添加し、当該親水性ポリマーをキャピラリー内壁に物理的に吸着させて用いてもよい。

固相抽出カラム２は、等電点電気泳動用キャピラリー３に直結するものであり、特定の標的物質を可逆的に吸着、脱着する観点から、アフィニティークロマトグラフィー担体を有するものが好ましい。この場合、固相抽出カラム２にあるアフィニティーリガンドに親和性をもつタンパク質が特異的に固相に捕捉される。固相からの溶離は遊離リガンドによる競合、酸性化またはアルカリ性化などのｐＨ変化、高濃度の尿素などによるタンパク質の変性などによってなし得る。
また、固相抽出カラム２は、イオン交換クロマトグラフィー担体を有するもの、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー担体を有するものも好ましい。イオン交換クロマトグラフィー担体を用いることにより、所望の有効表面電荷を有するタンパク質を特異的に固相に捕捉することができる。また、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体を用いることにより、目的とするタンパク質と固相リガンドとの相互作用を利用して、当該目的タンパク質を好適に固相に捕捉することができる。

固相抽出カラム２の固相担体としては、キャピラリーの内壁を用いる方法、重合反応によって多孔性ゲルを作製して得られるモノリスカラムを用いる方法、ビーズ状の固相担体を充填したカラムを用いる方法、多孔性の膜を固相担体として用いる等が挙げられる。
等電点電気泳動用キャピラリー３の断面積と、固相抽出カラム２の断面積は同一である必要はなく、適宜最適化されうる。また、固相抽出カラム２と等電点電気泳動用キャピラリー３とが分離しており、操作開始時または固相抽出工程の完了後に一体化して用いてもよい。

アフィニティークロマトグラフィー担体を用いる場合の、標的分子／アフィニティーリガンドの組み合わせとしては、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、オリゴヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、抗原分子（エピトープ）／抗体、抗体／プロテインＡ、抗体／プロテインＧ、抗体／プロテインＬ、レクチン／糖、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどが例として挙げられる。
これらの中で標的分子／アフィニティーリガンドの組合せとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質／ビオチン、オリゴヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、抗体／抗原分子（エピトープ）、抗原分子（エピトープ）／抗体、抗体／プロテインＡ、抗体／プロテインＧ、抗体／プロテインＬ、レクチン／糖、などが好ましい。

本発明の分離分析用キャピラリーデバイス１によれば、等電点電気泳動用キャピラリー３と、固相抽出カラム２が直結しているため、試料中の高濃度タンパク質と塩を除去して、低濃度タンパク質の等電点電気泳動による分析を可能にする。
また、本発明の分離分析用キャピラリーデバイスによれば、標的タンパク質又はペプチドは、固相抽出カラム２により濃縮されるため、固相抽出カラム２に流す試料の量を増すことにより検出感度を大幅に向上することができる。

＜分離分析用マイクロ流体チップ＞
本発明の分離分析用マイクロ流体チップは、上述した本発明の分離分析用キャピラリーデバイスと機能的に同様の構造を備えたものである。すなわち、本発明の分離分析用マイクロ流体チップは、少なくとも、等電点電気泳動用流路と、当該流路に直結された固相抽出カラムとを備える。
図２に示すように、本発明の分離分析用マイクロ流体チップ１０は、一例として、固相抽出カラム２と、等電点電気泳動用流路３と、電極液を導入する電極液リザーバー４と、もう一つの電極液を導入する電極液リザーバー５とが形成された基板１１を備えている。
基板１１の材料としては、例えば、プラスチック材料、ガラス、シリカ、石英、光硬化性樹脂、熱硬化性樹脂、シリコーン等が挙げられる。

電気泳動を行うための電極（図示省略）は、各リザーバー（電極液リザーバー４、電極液リザーバー５）に予め備え付けられ、例えばスパッタなどにより基板上の各リザーバー部位に形成されてもよいし、又は各リザーバーに電極を挿入する機構を備え、必要時に基板１１外から電極を基板１１上に差し込む構成であってもよい。
電気泳動を行う際は、電極間に電圧を印加する。電圧は、直流電圧であることが好ましい。

本発明の分離分析用マイクロ流体チップ１０は、電圧を印加する機構を備えていてもよく、流路に順番に注入された２種の液体の境界を検出する検出装置（図示省略）と、標的タンパク質又はペプチドを検出するための検出装置（図示省略）とをさらに備えていてもよい。
検出装置としては、伝導度検出器、または屈折率、光散乱、ＵＶ吸収、蛍光などの光検出装置が好ましい。光検出装置は、光源と検出器を備える。光源としては、レーザー、ＬＥＤ、ランプが挙げられ、検出器は、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、マルチピクセル光検出器、ＣＣＤカメラが挙げられる。

本発明の分離分析用マイクロ流体チップ１０は、本発明の分離分析用キャピラリーデバイスをチップ化したものであるため、高感度のタンパク質又はペプチドの分析を容易に行うことができる。

＜タンパク質又はペプチド分析方法＞
本発明のタンパク質又はペプチド分析方法は、本発明の分離分析用キャピラリーデバイスを用いたタンパク質又はペプチド分析方法であって、
標的タンパク質又はペプチドを含有する試料を、分離分析用キャピラリーデバイスに導入し、固相抽出カラムに標的タンパク質又はペプチドを吸着させる工程１と、
前記固相抽出カラムに吸着させた標的タンパク質又はペプチドを分離分析用キャピラリーデバイス内に溶離する工程２と、
前記分離分析用キャピラリーデバイスに電圧を印加し、溶離した前記標的タンパク質又はペプチドを、前記等電点電気泳動用キャピラリー内で、焦点化する工程３と、
焦点化後、前記標的タンパク質又はペプチドを検出する工程５と、
を有する。
以下、図３を参照しながら本発明のタンパク質又はペプチド分析方法の好ましい実施形態について説明する。

［工程１］
工程１において、標的タンパク質又はペプチドを含有する試料を、固相抽出カラムに導入する。固相抽出カラムは、標的タンパク質又はペプチドに親和性を有するため、該固相抽出カラムに標的タンパク質又はペプチドが特異的に吸着する。
次いで、必要に応じて、前記固相抽出カラムを洗浄する。適当な緩衝液を分離分析用キャピラリーデバイスに導入することにより不要な高濃度タンパク質及び塩などの妨害物質は、標的タンパク質又はペプチドから除かれる。
次いで、分離分析用キャピラリーデバイスを両性担体溶液で満たす。等電点電気泳動を行うため、等電点電気泳動用キャピラリーには、電圧印加によりｐＨ勾配が形成されるよう、弱酸性と弱塩基性の両方の解離基をもつ複数の両性電解質からなる両性担体溶液が充填されることが好ましい。
両性担体のｐＨ勾配の幅は、測定対象のタンパク質又はペプチドの等電点が含まれるように選択可能である。陽極槽には例えば、リン酸溶液などの酸を含む陽極液が充填され、陰極槽には例えば、水酸化ナトリウム溶液などの塩基を含む陰極液が充填される。

［工程２］
工程２において、固相抽出カラムに吸着させた標的タンパク質又はペプチドを溶離する。溶離方法としては特に限定されず、固相抽出カラムに遊離リガンドを導入して競合させる方法、酸溶液を導入して酸性化により溶離させる方法、塩基溶液を導入して塩基性化により溶離させる方法、高濃度の尿素などの変成剤を導入して溶離させる方法等が挙げられる。

［工程３］
工程３において、分離分析用キャピラリーデバイスに電圧を印加し、溶離した前記標的タンパク質又はペプチドを、前記等電点電気泳動用キャピラリーで、焦点化（分離、泳動）する。
印加電圧値の範囲は、等電点電気泳動用キャピラリーの長さ１ｃｍあたり１００〜１０００Ｖが好ましい。電気泳動を行う間、ジュール熱の影響を除去するために、例えば冷却溶媒の外部循環、送風、ペルチェなどで冷却を行ってもよい。電圧を印加することにより、等電点電気泳動用キャピラリー内に両性担体によるｐＨ勾配が形成される。タンパク質及びペプチドは両性物質であり、ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖解離基の種類とその量が異なれば等電点も異なるので、分離分析用キャピラリーデバイス内に存在するタンパク質又はペプチドは、それぞれの等電点と等しいｐＨの位置に収束し分離される。
工程２において、塩基性化により標的タンパク質又はペプチドを溶離させる場合には、極性を逆にして等電点電気泳動を行う。
また、工程２において、競合反応や変性により標的タンパク質又はペプチドを溶離させる場合には、競合する物質または変成剤と、両性担体を含む溶液とを固相抽出カラムに導入し、次に固相抽出カラム部を陽極液又は陰極液で満たして等電点電気泳動を開始する。固相抽出カラムを陽極液で満たした場合には、固相抽出カラム側を陽極にし、固相抽出カラムを陰極液で満たした場合には、固相抽出カラム側を陰極にする。

［工程４］
本実施形態において、工程３と、工程５の全体に亘って、前記等電点電気泳動用キャピラリー両端の圧力差を調整して前記固相抽出カラムで発生する電気浸透を制御する工程４を有することが好ましい。
工程４において、必要に応じて、前記分離分析用キャピラリーデバイス両端の圧力差を調整して前記固相抽出カラムで発生する電気浸透を制御する。一例として、固相抽出カラム側を陽極液、等電点電気泳動用キャピラリー側を陰極液に浸して電圧を印加する。固相抽出カラム部は酸性化により陽電荷を帯びる可能性が高い。その場合、陽極液の電気伝導度に依存して陽極方向に電気浸透が発生し、標的タンパク質又はペプチドを含むｐＨ勾配全体が陽極方向に移動する。
しかし、工程４において陽極端に適度の圧力を加えることで、この電気浸透流による流れを実質的にキャンセルし、等電点電気泳動による焦点化を、等電点電気泳動用キャピラリー内で起こさせることができる。また、前記分離分析用キャピラリーデバイス両端の圧力差の調整は、静水圧を用いてもよい。

また、上述した工程４に代えて、前記固相抽出には無関係な電荷をあらかじめ固相抽出担体に結合させることにより、前記固相抽出カラムで発生する電気浸透を制御することも好ましい。
例えば、工程２における溶離液として酸液を用いる場合であれば、固相担体が陽電荷を帯び、固相抽出カラムにおいて陽極方向への電気浸透流が発生するおそれがある。この電気浸透流は、工程４として上述したような圧力差の調整により制御を行うこともできるが、酸性化によって固相抽出担体が帯びる正電荷とつり合う負電荷をあらかじめ結合させておくことによっても、酸性化にともなう電気浸透流の発生を制御することが可能である。

電荷を加える方法は特に限定されるものではない。一例として、固相抽出に酸液を用いる場合であれば、予め固相抽出カラムにスルホン酸基などの強酸性の解離基を導入しておくことにより、固相抽出担体に捕捉した標的タンパク質又はペプチドを溶離するために固相抽出担体を酸液で満たしたとしても、固相抽出カラムの実効電荷をゼロの状態とすることができる。これにより電気浸透流の発生を抑制し、等電点電気泳動による焦点化を、等電点電気泳動用キャピラリー内で行うことができる。また、電気浸透流の発生を抑制することにより、等電点電気泳動用キャピラリーの内壁コーティングに悪影響を及ぼし得る塩基性の陰極液の流入を防ぐことができる。

［工程５］
工程５において、焦点化後、前記標的タンパク質又はペプチドを検出する。一例として、標的タンパク質又はペプチドに予め付した標識からの信号を取得する。
蛍光色素を標識として用いる場合、蛍光色素の励起波長に応じた励起光を照射し、蛍光色素から放出される蛍光を取得する。励起光源として、レーザー、ＬＥＤ、ランプなどを用いることが可能であり、必要に応じて励起波長の光のみを照射するよう、例えばバンドパスフィルタなどのフィルタを使用する。
蛍光を取得するには、例えば光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、マルチピクセル光検出器、ＣＣＤカメラ等を用いる。蛍光色素からの蛍光波長に相当する光のみを測定するよう例えばバンドパスフィルタやノッチフィルタなどのフィルタを使用することが好ましい。上記以外のあらゆる光源と検出器の組合せを用いることも可能である。

測定は、走査型検出器を用いてキャピラリーを走査検出する方法により行ってもよく、固定型検出器を用いて検出する方法により行ってもよい。また、ＣＣＤカメラなどを用いて画像として検出してもよい。固定型検出器を用いる場合には、分離分析用キャピラリーデバイス両端の圧力差を制御することにより、焦点化した標的タンパク質又はペプチドを含むｐＨ勾配全体を固定型検出器に対して移動させて検出を行うことが好ましい。ｐＨ勾配全体の移動は、陰極液に塩化物イオンなどを添加してｐＨ勾配全体を酸性化することによって、焦点化したタンパク質を陰極方向へ電気泳動させる方法によって行ってもよい。電気泳動による移動は、陽極液にナトリウムイオンなどを添加することによって、逆の陽極方向に行うこともできる。

分離分析用キャピラリーデバイス中のタンパク質又はペプチドは、自身の等電点と等しいｐＨの位置に収束し分離される。標的タンパク質又はペプチドの量は、これらの等電点位置の標識からの信号量から算出される。
なお、工程５では、上記蛍光色素を用いた光測定に代えて、標的タンパク質又はペプチドの等電点位置でのＵＶ吸収値や電気伝導度により測定を行ってもよい。

本発明のタンパク質又はペプチド分析方法によれば、本発明の分離分析用キャピラリーデバイスを用い、固相抽出カラムで試料中の標的分子のほとんどすべてを捕捉し、そのほとんどすべてを等電点電気泳動用キャピラリーで分離定量することができるため、高感度のタンパク質又はペプチドの分析を容易に行うことができる。

＜電気泳動装置＞
本発明の電気泳動装置は、上述した本発明の分離分析用キャピラリーデバイスと、該分離分析用キャピラリーデバイス中に存在する２種以上の液の境界位置を検出する一以上の境界検出器を有する検出装置と、を備えたものである。

図５に示す本発明の電気泳動装置２０は、一例として、固体抽出カラム２及び等電点電気泳動用キャピラリー３を備える分離分析用キャピラリーデバイス１と、電極液リザーバー４、電極液リザーバー５、境界検出器６及びタンパク質検出器（試料検出器）７を有する検出装置と、を備えている。
電極液リザーバー４は陽極を備え、電極液リザーバー５は陰極を備えており、これら陽極及び陰極は電源と接続されて、電気泳動の際に電極間に電圧が印加される。

図５に示す本発明の電気泳動装置２０において、分離分析用キャピラリーデバイス１は、好ましい配置の一例として逆Ｕ字型に配置されているものであって、電極液リザーバー４及び陽極側に固相抽出カラム２が配され、電極液リザーバー５及び陰極側に等電点電気泳動用キャピラリー３が配されている。

検出装置が有する境界検出器６は、分離分析用キャピラリーデバイス中に存在する２種以上の液の境界位置を検出するものである。
たとえば、図５に示す境界検出器６は、等電点電気泳動時に等電点電気泳動用キャピラリー内を充たす両性担体液と、固相抽出カラム２から標的タンパク質又はペプチドを溶離する際の溶離液や電極液との境界位置を検出することができる。
通常の中空キャピラリーの場合、該キャピラリー中の液の移動速度及び液の境界の位置は、付与する圧力等に応じて算出及び調整することができる。しかしながら、本発明の固相抽出キャピラリー内に充填材等の構造を有する場合は、充填材等の充填状況あるいは試料などに混入した粒子状物質等による目詰まりなどにより抵抗が変わるため、液の境界位置を特定することが従来困難であった。
一方、本実施形態のように、境界検出器６を有する場合であれば、圧力と流量の関係が不明の場合でも両性担体液と溶離液や電極液との境界位置を検出することができ、その境界を適切な位置に調節することによって標的タンパク質又はペプチドの分離分析を精度高く効率的に行うことができる。
本発明の電気泳動装置２０は、境界検出器６に加えて、さらに他の境界検出器を備えていてもよい（図示省略）。複数の境界検出器を備えることにより、液の注入過程における流量の変化を知ることができ、注入液への粒子状物質の混入などの問題の発生を検知することができる。

境界検出器の他の用途は、固相抽出カラム２に注入された試料液と、試料液注入前に分離分析用キャピラリーデバイス１中を充たしている液との境界位置の検出が挙げられる。該境界位置を検出することにより、試料液の注入量を測ることができ、定量的に分離分析を行うことができる。

上述した境界検出器（境界検出器６、他の境界検出器）としては、非接触若しくは接触型の電気伝導度検出器、屈折率検出器、吸光度検出器、蛍光検出器、又は散乱光検出器が好ましい。
なかでも、簡易に検出が可能であり、且つ、分離分析用キャピラリーの材料や形状への制約を設けずに設置し得ることから、非接触型の電気伝導度検出器であることが特に好ましい。例えば、両性担体液と電極液との境界位置の検出であれば、一般的に両性担体液は電気伝導度が低く、電極液は一般的に電気伝導度が高いため、電気伝導度を用いて容易に検出を行うことができる。

本態様の検出装置は、さらに、等電点電気泳動により分離された試料を検出するタンパク質検出器（試料検出器）７を備える。タンパク質検出器７は、等電点電気泳動により焦点化された標的タンパク質又はペプチドを検出するものであって、上述した走査型検出器、固定型検出器、画像検出器等を用いることができる。

本発明の電気泳動装置は、本発明の分離分析用キャピラリーデバイスの両端の圧力差を制御する機構を備えることにより、該キャピラリーデバイス内への液の注入、固相抽出担体で発生する電気浸透による等電点電気泳動用キャピラリー内の液の流れの制御を行うことができる。等電点電気泳動による焦点化（分離、泳動）の際には圧力の制御によって、固相抽出担体で発生する電気浸透の影響を最少にすることが望ましいが、例えば境界検出器６の位置に両性担体液と陽極液の境界を置いた状態で等電点電気泳動を開始し、その境界が固相抽出担体内で発生する電気浸透によって移動しないように、境界の位置を連続的にモニターしつつ、圧力を動的に制御することによって実際上境界が移動しないように制御することができる。

本発明の電気泳動装置は、本発明の分離分析用キャピラリーデバイスの性能を最大限引き出すことができるものであるため、タンパク質又はペプチドの分析及び検出を高感度かつ容易に行うことができる。

＜分離分析用マイクロ流体チップ電気泳動装置＞
本発明の分離分析用マイクロ流体チップ電気泳動装置は、上述した本発明の電気泳動装置と機能的に同様の構造を備えたものである。
本発明の分離分析用マイクロ流体チップ電気泳動装置は、本発明の電気泳動装置と同様、タンパク質又はペプチドの分析及び検出を高感度かつ容易に行うことができる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

溶融シリカキャピラリー（内径５０μｍ、外径３６５μｍ、長さ７０ｃｍ）を用意し、キャピラリー内を３−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン／酢酸／アセトン（１０／４５／４５，ｖ／ｖ／ｖ）混合液で満たし、一晩室温に放置し、内壁にメタクリルオキシプロピル基を結合させた。
キャピラリーを洗浄、乾燥後、一端から４０ｃｍの位置にマーカーペン等で外壁に印を付け、長い方のキャピラリーの端からこの印の位置までジメチルアクリルアミド重合液を注入し、両端をゴムセプタムで閉じて５０°Ｃ、２時間反応させることにより、ジメチルアクリルアミドと、先にキャピラリー内壁に結合させたメタクリルオキシ基との共重合を引き起こすことより、内壁に電気浸透とタンパク質の吸着を抑制するポリジメチルアクリルアミドを結合させた。
キャピラリーを洗浄、乾燥後、短い方のキャピラリーの端から印の位置までメタクリル酸グリシジル重合液を注入し、両端をゴムセプタムで閉じて５０°Ｃ、一夜反応させることにより、メタクリル酸グリシジルと、先にキャピラリー内壁に結合させたメタクリルオキシ基との共重合を引き起こすことより、内壁にポリメタクリル酸グリシジルを結合させた。
キャピラリーを洗浄、乾燥後、ポリメタクリル酸グリシジルを結合した部分のみをイミノジ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ９．０）で満たし、５０°Ｃに１．６時間置いて、イミノジ酢酸を結合させた。イミノジ酢酸を結合させたキャピラリー部分は印から２０ｃｍの位置で、ポリジメチルアクリルアミドを結合させたキャピラリー部分は印から３０ｃｍの位置で切断し、全長を５０ｃｍとした。このキャピラリーを分離分析用キャピラリーデバイスとして用いた。
イミノジ酢酸結合側を陽極側にして、この分離分析用キャピラリーデバイスをベックマンコールター社製Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ 全自動キャピラリー電気泳動装置に取り付け、陰極端から１０ｃｍの位置で５３２ｎｍのレーザー光を励起光として５９０ｎｍ付近の蛍光を検出した。
この分離分析用キャピラリーデバイスに陽極側から平衡化液として０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を２psiの圧力で1分間流した後に、１００ｍＭ塩化ニッケル水溶液を２psiの圧力で1分間流し、イミノジ酢酸にニッケルイオンを結合させ、ヘキサヒスチジンタグをもつタンパク質を標的とする固相抽出カラムとした。以下の送液は常に陽極側から陰極側に向けて行った。
過剰のニッケルイオンを除くために、洗浄液として１０ｍＭのイミダゾールと０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を２psiの圧力で1分間流した。
次にヘキサヒスチジンタグをもつマウス組換え抗体Ｆａｂ断片を蛍光標識、精製して得た等電点７．７０の標識Ｆａｂ試料２０ｎＭを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（０．１％ツイーン２０を含む）を０．５psiの圧力で２分間注入（キャピラリーの長さにして約７．５ｃｍ）し、Ｆａｂを固相抽出カラムに吸着させた。次いで、上記の洗浄液を２psiの圧力で1分間流し、さらに、４種の蛍光標識ペプチドを等電点マーカーとしてそれぞれ２．５ｎＭ含む両性担体液（２．５％（ｖ／ｖ）ファルマライト３−１０、０．１％酢酸、０．６％テトラメチルエチレンジアミン）を４０psiの圧力で０．３分間流し、デバイス内を等電点マーカーと両性担体を含む液で置換した。
次いで、溶離液として、また陽極液としても用いる１００ｍＭリン酸を２psiの圧力で１．３分間流し、固相抽出カラム部分のみを陽極液で満たすとともに固相抽出カラムに結合したＦａｂを溶離した。この状態では、試料のＦａｂは固相抽出カラムと等電点電気泳動用キャピラリーの境界付近に溶離されたと考えられる。イミノジ酢酸に結合したニッケルイオンも遊離し、イミノジ酢酸のカルボキシル基の解離は抑制され、イミノ基には正電荷が残るので、固相抽出カラムは正の電荷を帯びるようになる。
次に、陽極液として１００ｍＭリン酸、陰極液として１００ｍＭ水酸化ナトリウムを用い、最大電流２０μＡの制限下に２５ｋＶの直流電圧を印加し、また、固相抽出カラムで発生する電気浸透流を抑制するために、陽極端に０．２psiの圧力を加えた。
固相抽出カラムは正電荷を帯びているので、陽極方向への電気浸透が発生する。電気泳動開始時に陽極液に浸された固相抽出カラム部分には大きな電圧がかかり、電気浸透も大きいが、電気伝導率の小さなｐＨ勾配が形成されるに伴ってｐＨ勾配による電圧降下が大きくなるので、固相抽出カラム部分にかかる電圧はしだいに低下し、電気浸透流もしだいに小さくなる。
ここで用いたキャピラリー電気泳動装置の圧力制御の設定は最少０．１psi刻みであり、０．１psiが最少設定値である。陽極端に加える圧力は、電気泳動による焦点化を開始して最初の２分間を０．２psi、それ以降を０．１psiとすることで、電気泳動初期の陽極方向へのｐＨ勾配の移動をほぼ抑制することができた。その後、０．１psiの圧力を加え続けることで、焦点化を進めつつ、ｐＨ勾配を検出点にむけて徐々に動かすことによって、焦点化終了後のｐＨ勾配全体の検出が可能になった。等電点７．７０のＦａｂは分析開始から２２．７分の位置に検出された。この位置は同時に分離した等電点マーカーの分離結果からみて妥当な位置である。

図４に示すように、所定のｐＩを有するＨｉｓ・ｔａｇ付き蛍光標識組換えＦａｂが高感度に検出された。

１ 分離分析用キャピラリーデバイス
２ 固相抽出カラム
３ 等電点電気泳動用キャピラリー
４ 電極液リザーバー
５ 電極液リザーバー
６ 境界検出器
７ タンパク質検出器（試料検出器）
１０ 分離分析用マイクロ流体チップ
１１ 基板
２０ 電気泳動装置

Claims (12)

1. 内壁に親水性ポリマーを化学的に結合又は物理的に吸着させた等電点電気泳動用キャピラリーと、前記等電点電気泳動用キャピラリーに直結する固相抽出カラムと、を一体として備えた分離分析用キャピラリーデバイスと、前記分離分析用キャピラリーデバイスの両端の圧力差を制御する機構と、を備えた電気泳動装置を用いたタンパク質又はペプチド分析方法であって、
   標的タンパク質又はペプチドを含有する試料を、固相抽出カラムに導入し、固相抽出カラムに標的タンパク質又はペプチドを吸着させた後、前記分離分析用キャピラリーデバイスを両性担体溶液で満たす工程１と、
   前記固相抽出カラムに吸着させた標的タンパク質又はペプチドを、固相抽出カラムを電極液または酸溶液もしくは塩基溶液で満たすことによって溶離し、あるいは両性担体を含む溶離液で溶離後、固相抽出カラムを電極液または酸溶液もしくは塩基溶液で満たし、キャピラリー等電点電気泳動による分離を開始する工程２と、
   前記分離分析用キャピラリーデバイスに電圧を印加し、溶離した前記標的タンパク質又はペプチドを、前記等電点電気泳動用キャピラリー内で焦点化する工程３と、
   焦点化後、前記標的タンパク質又はペプチドを検出する工程５と、を有し、
   等電点電気泳動による焦点化を前記等電点電気泳動用キャピラリー内で行う、タンパク質又はペプチド分析方法。
2. 前記固相抽出カラムを、電極液または酸溶液もしくは塩基溶液で満たして等電点電気泳動による焦点化を前記等電点電気泳動用キャピラリー内で行うことにより、前記固相抽出カラムで発生する電気浸透を抑制する、請求項１に記載のタンパク質又はペプチド分析方法。
3. 前記工程１及び／又は前記工程２において、前記両性担体溶液中に前記親水性ポリマーを添加し、前記親水性ポリマーをキャピラリー内壁に物理的に吸着させる請求項１又は２に記載のタンパク質又はペプチド分析方法。
4. 前記工程３と、前記工程５の全体に亘って、前記分離分析用キャピラリーデバイス両端の圧力差を調整して前記固相抽出カラムで発生する電気浸透流を制御する工程４を有し、
   前記工程４において、固相抽出カラムで発生する電気浸透流を、逆向きの圧力を加えてキャンセルすることによって、固相抽出カラムの電気浸透流の影響が等電点電気泳動用キャピラリーに及ばないようにする請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチド分析方法。
5. 前記固相抽出カラムで発生する電気浸透を、前記固相抽出カラムに付加的な電荷を導入することによって抑制することにより、固相抽出カラムの電気浸透の影響が等電点電気泳動用キャピラリーに及ばないようにする請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチド分析方法。
6. 前記固相抽出カラムは、アフィニティークロマトグラフィー担体、イオン交換クロマトグラフィー担体、又は、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体を有する請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチド分析方法。
7. 前記電気泳動装置は、前記分離分析用キャピラリーデバイス中に存在する２種以上の液の境界を検出する一以上の境界検出器を有する検出装置を更に備えた請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチド分析方法。
8. 前記境界検出器が、注入された試料液と、他の液との境界を検出する境界検出器である請求項７に記載のタンパク質又はペプチド分析方法。
9. 前記境界検出器が、両性担体液あるいは両性担体を含む溶離液と、電極液または酸溶液もしくは塩基溶液との境界を検出する境界検出器である請求項７又は８に記載のタンパク質又はペプチド分析方法。
10. 前記境界検出器が、非接触若しくは接触型の電気伝導度検出器、屈折率検出器、吸光度検出器、蛍光検出器、又は散乱光検出器である請求項７〜９のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチド分析方法。
11. 前記検出装置が、さらに、等電点電気泳動により分離された試料を検出する試料検出器を有する請求項７〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチド分析方法。
12. 前記分離分析用キャピラリーデバイスが、逆Ｕ字型に配置され、そのいずれかの直線部において、分離された試料の走査型検出を行える請求項７〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチド分析方法。

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