CN102226159B - 一株阴沟肠杆菌及其在制备2，3-丁二醇中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM)及其在制备2，3-丁二醇中的应用。该阴沟肠杆菌溶解亚种保藏号为CGMCC No.4230。本发明的菌株能够利用五碳糖、六碳糖、糖蜜、淀粉类原料水解液、木质纤维素原料水解液，具有转化率高，产物浓度高，底物谱广等优点。本发明所述操作方法简单，成本较低，效率高，发酵罐补料分批发酵2，3-丁二醇产量可达到125～162g/L，转化率达到理论转化率的90～95％，2，3-丁二醇最大生产率为4.1g/(L·h)，极具工业化推广应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株阴沟肠杆菌溶解亚种及其应用，尤其涉及一株高产2，3-丁二醇的阴沟肠杆菌溶解亚种及其在制备2，3-丁二醇中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
2，3-丁二醇(2，3-butanediol)是一种潜在的非常有价值的平台化合物，广泛用于医药、化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域( E.，Grajek，W.，2009.Biotechnol.Adv.27，715-725.)。左旋形式的2，3-丁二醇由于其具有较低的凝固点可以作为抗冻剂。2，3-丁二醇可以作为前体物质用于生产在化工领域具有极其广泛用途的甲乙酮和1，3-丁二烯。2，3-丁二醇的燃烧值为27200kJ/kg，同乙醇相当(29055kJ/kg)，是一种潜在价值很高的燃料添加剂。2，3-丁二醇还可用来制备聚合物、油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、***以及药物的手性载体等等。2，3-丁二醇如此广泛的用途导致其在国际市场上的需求不断上涨，作为液体燃料添加剂的研究也引起了世界的广泛关注。
2，3-丁二醇的生产主要是微生物发酵法，与化学合成法相比，该方法环境友好，工艺简单，技术上较为成熟，符合绿色化工的要求。细菌是对发酵生产2，3-丁二醇有工业价值的微生物。用于发酵生产2，3-丁二醇的细菌菌属主要有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)和气单胞菌属(Aeromonas)等。关于肠杆菌属(Enterobacter)生产2，3-丁二醇的报道较少，其2，3-丁二醇的产量均较低(中国专利CN101709281A，CN101709280A；Saha，B.C.，Bothast，R.J.，1999.Appl.Microbiol.Biotechnol.52，321-326，赵世敏等，2008年.食品与发酵工业.34(3)，25-28)。
经检索，目前未见有使用阴沟肠杆菌溶解亚种发酵生产2，3-丁二醇的专利报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是：提供一株高产2，3-丁二醇的阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)，及其所述菌在制备2，3-丁二醇中的应用。
本发明所述产2，3-丁二醇的阴沟肠杆菌溶解亚种，其特征在于：该菌株名为阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM，菌株已于2010年10月19日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.4230。
上述阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)菌株SDM是从山东济南郊区的农田土壤中筛选得到。经德国Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(简称DSMZ)鉴定，其生物学特征是：
革兰氏阴性，兼性厌氧，具有运动性的棒杆菌，长1.2～2.5μm，宽0.7～0.8μm。VP反应，ONPG反应，过氧化氢酶，尿酶，精氨酸双水解酶，鸟氨酸脱羧酶呈阳性。甲基红反应，氧化酶反应，明胶水解反应和吲哚产生反应呈阴性。其菌落颜色为黄白色，圆形、凸起、有光泽、表面光滑、直径2～3mm。它可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、D-木糖、蔗糖、海藻糖、L-***糖、鼠李糖、半乳糖、柠檬酸盐和丙二酸盐，37℃发酵葡萄糖产酸产气。能在KCN上生长。其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示，序列长度为1504bp，所述序列与多株阴沟肠杆菌溶解亚种的16S rDNA序列比对相似性达到99.9％。
本发明所述由阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDMCGMCC No.4230发酵生产2，3-丁二醇的方法，其涉及的步骤是：
(1)菌种选择。
选阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No.4230。
(2)斜面培养活化：将阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No.4230菌种接种于斜面培养基，30～40℃条件下，静置培养10～14小时，备用；
(3)摇瓶发酵种子培养：将步骤(2)培养的斜面菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于40～60mL液体种子培养基的300mL三角瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，30～40℃培养10～16小时，得到种子培养液；
(4)发酵罐发酵种子培养：
一级种子培养：将步骤(2)培养的斜面菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于80～120mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，30～40℃培养10～16小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以5～10％(体积比)的接种量接种于0.8～1.2升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，30～40℃培养10～16小时，得到二级种子培养液；
(5)发酵培养：
摇瓶发酵：以5～10％(体积比)的接种量，将种子液接种于装有80～120mL发酵培养基的500mL三角瓶瓶中，置于转速为150～200rpm的摇床上，30～40℃培养16～30小时，当发酵液中2，3-丁二醇浓度不再上升时，发酵停止。
50升发酵罐发酵：以体积比5～10％的接种量，将二级种子液接种于50升发酵罐中，发酵罐装液量为30升，然后以初始碳源浓度为60～120g/L、温度30～40℃、搅拌转速200～600rpm、通气量0.5～1.5vvm进行通风搅拌发酵培养，培养时间为20～60小时；发酵液初始pH值调至5.5～7.0，发酵过程中，通过流加3～6M的KOH和2～5M的H3PO4来调节pH值，使之控制在pH5.5～6.5；发酵过程中，每隔3～5小时取样测定发酵液中的残糖量和2，3-丁二醇浓度，并依据残糖浓度流加碳源，当2，3-丁二醇浓度不再上升时，发酵结束。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化钠2g/L， 氯化钾2g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂粉18g/L，pH值调至5.5～7.0，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
上述种子培养基组成为：碳源30～40g/L，磷酸二氢钾3～10g/L，氯化铵3～12g/L，氯化钠1～4g/L，硫酸镁0.05～0.1g/L，硫酸亚铁0.05～0.1g/L，pH值调至5.5～7.0，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
上述发酵培养基组成为：碳源60～120g/L，玉米浆干粉5～20g/L，磷酸二氢钾3～10g/L，氯化铵5～25g/L，乙酸钾1～4g/L，氯化钠1～4g/L，氯化钙0.05～0.1g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，硫酸锌0.2～0.6g/L，硫酸亚铁0.2～0.6g/L，pH值调至5.5～7.0，自来水配制，115℃灭菌20分钟；
上述50升发酵罐发酵培养中流加方式优选脉冲流加，其方法是当糖浓度降到10～30g/L时，脉冲流加底物，使糖浓度达到50～70g/L。
上述种子培养基中的碳源至少含有葡萄糖或木糖。
上述发酵培养基中的碳源至少含有葡萄糖、木糖、蔗糖糖蜜、木糖母液、淀粉类原料水解液、木质纤维素原料水解液中的一种；该碳源单独灭菌，无需调节pH。其中，所述淀粉类原料水解液以如下方法制得：取淀粉类原料，以2～8U/g淀粉类原料干重的酶用量加入α-淀粉酶，95℃处理0.5h，得到淀粉类原料液化液，然后调pH至4.2，加入糖化酶，糖化酶的添加量为100～1000U/g淀粉类原料干重，置于60℃水浴摇床中处理至葡萄糖彻底水解，得含糖浓度以质量体积比计为15％～40％的淀粉类原料水解液；所述木质纤维素原料水解液以如下方法制得：取粉碎的木质纤维素原料，以质量体积比计，按木质纤维素原料∶质量分数为1％硫酸＝1∶10～1∶3的量加入硫酸，120℃处理1小时，常规离心，上清液即为含糖浓度以质量体积比计为15％～35％的木质纤维素原料水解液。
上述淀粉类原料优选淀粉或木薯粉；木质纤维素原料优选木头、玉米芯或秸秆。
上述淀粉类原料水解液中糖浓度以质量体积比计优选为25％～35％；上述木质纤维素原料水解液中糖浓度以质量体积比计优选为25％～30％。
上述的应用中，步骤(2)、(3)、(4)、(5)所述培养温度优选37±0.2℃；
上述的应用中，步骤(2)所述培养时间优选12小时；
上述的应用中，步骤(3)所述培养时间优选12～14小时；
上述的应用中，步骤(4)所述培养时间优选12～14小时；
上述的应用中，步骤(5)所述50升发酵罐发酵培养基初始糖浓度优选60～80g/L。
上述的应用中，步骤(5)所述50升发酵罐发酵液pH优选6.0±0.2。
本发明的显著特点是：
从农田土层中筛选得到一株具有发酵潜力的产2，3-丁二醇的菌株，经鉴定为阴沟肠杆菌溶解亚种，命名为阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDMCGMCC No.4230。
本发明的用于发酵制备2，3-丁二醇的菌株阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No.4230，具有转化率高，产物浓度高，底物谱广等特点，可以稳定地进行2，3-丁二醇的发酵生产，发酵罐补料分批发酵2，3-丁二醇的产量能够 达到125～162g/L，2，3-丁二醇生产率最大为4.1g/(L·h)，转化率达到理论转化率的90～95％，极具工业化应用潜力。
具体实施方式
一般性说明：
取淀粉类原料，以2～8U/g淀粉类原料干重的酶用量加入α-淀粉酶，95℃处理0.5h，得到淀粉类原料液化液，然后调pH至4.2，加入糖化酶，糖化酶的添加量为100～1000U/g淀粉类原料干重，置于60℃水浴摇床中处理至葡萄糖彻底水解，得含糖浓度以质量体积比计为15％～40％的淀粉类原料水解液。
上述淀粉类原料优选淀粉或木薯粉。
同步糖化发酵底物的准备：将α-淀粉酶液化好的淀粉类原料液化液115℃灭菌20分钟，用于下一步的同步糖化发酵。
木质纤维素原料水解液的制备：取粉碎的直径在0.45～0.9mm的木质纤维素原料，以质量体积比计，按木质纤维素原料∶质量分数为1％硫酸＝1∶10～1∶3的量加入硫酸，120℃处理1小时，常规离心，上清液即为含糖浓度以质量体积比计为15％～35％的木质纤维素原料水解液。
上述木质纤维素原料优选木头、玉米芯或秸秆。
上述淀粉类原料水解液中糖浓度以质量体积比计优选为25％～35％；上述木质纤维素原料水解液中糖浓度以质量体积比计优选为25％～30％。
木质纤维素原料水解液成分以及总糖分析方法参考(Wang AL，et al.Appl Microbiol Biotechnol，2010，87：965-970)。
葡萄糖购自济南市历城区昌英达化工经营部，木糖购自济南圣泉唐和唐生物科技有限公司，玉米芯、木糖母液购自山东龙力生物科技股份有限公司，蔗糖糖蜜购自广西华商国糖贸易有限公司，木薯粉购自上海祥亨贸易有限公司。
葡萄糖的测定方法为：发酵液稀释后离心，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。测定原理为利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一性测定葡萄糖含量。
木糖检测方法为：Agilent l100高效液相色谱仪，G1311A四元泵，示差折光分析检测器，进样量10μL。Agilent HPLC 2D色谱工作站。色谱柱为ZORBAX碳水化合物分析柱(4.6×150mm)，柱温30～50℃，流动相为乙腈∶水＝80∶20(v/v)，流速1.2mL/min。以保留时间定性，外标法定量。
2，3-丁二醇的测定方法：VARIAN CP-3380气相色谱仪检测。乙酸丁酯为萃取剂，体积比1∶1萃取，取上层有机相检测。具体测定的条件是：火焰离子监测器(FID)温度为280℃，进样器温度为220℃，而毛细管柱温是从50℃升温到180℃，升温速度20℃/min，载气为氮气。利用2，3-丁二醇标准品(德国Sigma-Aldrich公司，货号：361461)做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中2，3-丁二醇的含量。
实施例1：阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No.4230的分离筛选及鉴定
该实施例中所用的培养基的组成如下：
液体筛选培养基：葡萄糖50g/L，乙酸钠5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸镁0.15g/L，七水硫酸亚铁0.05g/l，七水硫酸锰0.03g/l，pH为7。
固体筛选养基：液体筛选培养基，琼脂粉18g/l，pH为7。
发酵培养基：葡萄糖100g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，乙酸钠5g/L，pH为7。
营养肉汤培养基：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH为7。
该实施例的具体操作过程如下：
1、分离筛选
从农田取得土壤，取1g加入装有50mL灭菌的液体筛选培养基的300mL三角瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以120rpm的转速培养48小时。取1ml培养液转接到相同的液体筛选培养基中相同条件下培养46小时。将培养液以10-3、10-4两个稀释度涂布在固体筛选养基的培养皿中，37℃培养20小时，待长出单菌落后，挑选菌落面积大的菌落，接种到发酵培养基中，置于摇床上以180rpm的转速，37℃培养20小时，通过VP反应进行初筛，根据反应时间和颜色变化筛选出阳性菌株。然后测定初筛的阳性菌株的2，3-丁二醇的产量，获得产量最高的菌株。
2、菌株的鉴定
将上述筛选得到的菌株在德国Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(简称DSMZ)进行鉴定，鉴定结果表明：该菌为革兰氏阴性，兼性厌氧，具有运动性的棒杆菌，长1.2～2.5μl，宽0.7～0.8μl。VP反应，ONPG反应，过氧化氢酶，尿酶，精氨酸双水解酶，鸟氨酸脱羧酶呈阳性。甲基红反应，氧化酶反应，明胶水解反应和吲哚产生反应呈阴性。其菌落颜色为黄白色，圆形、凸起、有光泽、表面光滑、直径2～3mm。它可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、D-木糖、蔗糖、海藻糖、L-***糖、鼠李糖、半乳糖、柠檬酸盐和丙二酸盐，37℃发酵葡萄糖产酸产气。能在KCN上生长。其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示，序列长度为1504bp，所述序列与多株阴沟肠杆菌溶解亚种的16S rDNA序列比对相似性达到99.9％。综合分析，菌株鉴定为阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)，命名为阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM。
上述菌株阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae ssp.dissolvens)SDM已于2010年10月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏编号为CGMCC No.4230。
实施例2、利用阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDMCGMCC No.4230以葡萄糖为碳源发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No.4230；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，37℃条件下，静置培养12小时；
(3)种子培养：
一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，37℃培养12小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以10％(体积比)的接种量接种于1升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，37℃培养12小时，得到二级种子培养液；
(4)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)50升发酵罐中加入30升发酵初始培养基。在发酵培养基中接入3升二级种子培养液，发酵罐搅拌转速400rpm，37℃条件下发酵50小时。每隔3小时取样测定发酵液中的残糖量和2，3-丁二醇浓度。发酵过程中脉冲补加葡萄糖，使发酵液中的葡萄糖浓度维持在20～40g/L。
(5)测定分析：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、葡萄糖浓度，计算糖转化率、2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得葡萄糖的浓度为2.7±0.5g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度161.3±0.7g/L(平均值±标准差)，糖转化率达到理论转化率的92.1±0.8％(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为3.23±0.01g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化钠2g/L，氯化钾2g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂粉18g/L，pH值调至6.0，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
上述种子培养基组成为：葡萄糖40g/L，磷酸二氢钾8g/L，氯化铵5g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁0.05g/L，硫酸亚铁0.05g/L，pH值调至6.0，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
上述发酵培养基组成为：葡萄糖65g/L，玉米浆干粉6g/L，磷酸二氢钾4g/L，氯化铵20g/L，乙酸钾4g/L，氯化钠2g/L，氯化钙0.08g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锌0.3g/L，硫酸亚铁0.3g/L，pH值调至6.0，自来水配制，115℃灭菌20分钟；葡萄糖单独灭菌。
实施例3、利用阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDMCGMCC No.4230以木糖为碳源发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No.4230；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，35℃条件下，静置培养12小时；
(3)种子培养：
一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，35℃培养12小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以10％(体积比)的接种量接种于1升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，35℃培养12小时，得到二级种子培养液；
(4)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)50升发酵罐中加入30升发酵培养基。在发酵培养基中接入3升二级种子培养液，发酵罐搅拌转速300rpm，35℃条件下发酵24小时。每隔3小时取样测定发酵液中的残糖量和2，3-丁二醇浓度。
(5)测定分析：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、木糖浓度，计算糖转化率、2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得木糖的浓度为2.5±0.2g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度53.6±0.9g/L(平均值±标准差)，糖转化率达到理论转化率的91.2±1.5％(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为2.23±0.04g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化钠2g/L，氯化钾2g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂粉18g/L，pH值调至7.0，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
上述种子培养基组成为：木糖40g/L，磷酸二氢钾6g/L，氯化铵5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，pH值调至7.0，蒸馏水配制，115℃条件下灭菌20分钟；
上述发酵培养基组成为：木糖120g/L，玉米浆干粉15g/L，磷酸二氢钾7g/L，氯化铵15g/L，乙酸钾4g/L，氯化钠2g/L，氯化钙0.075g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锌0.4g/L，硫酸亚铁0.2g/L，pH值调至7.0，自来水配制，115℃灭菌20分钟；木糖单独灭菌。
实施例4、利用阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDMCGMCC No.4230以蔗糖糖蜜为碳源发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No.4230；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，40℃条件下，静置培养10小时；
(3)种子培养：
一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，40℃培养12小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以10％(体积比)的接种量接种于1升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，40℃培养13小时，得到二级种子培养液；
(4)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)50升发酵罐中加入30升发酵初始培养基。在发酵培养基中接入3升二级种子培养液，发酵罐搅拌转速600rpm，40℃条件下发酵40小时。其中，发酵到5小时，开始脉冲流加总糖浓度以质量体积比计为55％的蔗 糖糖蜜。每隔4小时取样测定发酵液中的残糖量和2，3-丁二醇浓度。当发酵液中总糖浓度降到20g/L左右时，脉冲流加蔗糖糖蜜使总糖浓度到50g/L左右。
(5)测定分析：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、总糖浓度，计算2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得总糖的浓度为3.1±0.6g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度112.4±2.2g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为2.81±0.06g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化钠2g/L，氯化钾2g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂粉18g/L，pH值调至6.5，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
上述种子培养基组成为：葡萄糖35g/L，磷酸二氢钾6g/L，氯化铵8g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.06g/L，硫酸亚铁0.08g/L，pH值调至6.5，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
上述发酵培养基组成为：总糖浓度以质量体积比计为55％的蔗糖糖蜜100g/L，玉米浆干粉8g/L，磷酸二氢钾12g/L，氯化铵12g/L，乙酸钾4g/L，氯化钠3g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸锌0.4g/L，硫酸亚铁0.4g/L，自来水配制，该发酵培养基的初始pH为6.5，115℃灭菌20分钟；蔗糖糖蜜单独灭菌。
实施例5、利用阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDMCGMCC No.4230以木糖母液为碳源发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No.4230；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，30℃条件下，静置培养14小时；
(3)种子培养：
一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，37℃培养12小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以10％(体积比)的接种量接种于1升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，37℃培养13小时，得到二级种子培养液；
(4)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)50升发酵罐中加入30升发酵初始培养基。在发酵培养基中接入3升二级种子培养液，发酵罐搅拌转速400rpm，37℃条件下发酵44小时。其中，发酵到5小时，开始脉冲流加总糖浓度以质量体积比计为68％的木糖母液。每隔4小时取样测定发酵液中的残糖量和2，3-丁二醇浓度。当发酵液中总糖浓度降到20g/L左右时，脉冲流加木糖母液使总糖浓度到50g/L左右。
(5)测定分析：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、总糖浓度，计算2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得总糖的浓度为4.7±0.8g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度67.9±1.7g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为1.54±0.04g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化钠2g/L，氯化钾2g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂粉18g/L，pH值调至6.5，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
上述种子培养基组成为：木糖35g/L，磷酸二氢钾6g/L，氯化铵8g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.06g/L，硫酸亚铁0.08g/L，pH值调至6.5，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
上述发酵培养基组成为：总糖浓度以质量体积比计为68％的木糖母液90g/L，玉米浆干粉10g/L，磷酸二氢钾10g/L，氯化铵5g/L，乙酸钾4g/L，氯化钠3g/L，氯化钙0.05g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸锌0.4g/L，硫酸亚铁0.4g/L，自来水配制，该发酵培养基的初始pH为6.5，115℃灭菌20分钟；木糖母液单独灭菌。
实施例6、利用阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDMCGMCC No.4230以木薯粉水解液为碳源发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No.4230；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，40℃条件下，静置培养12小时；
(3)种子培养：
一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，40℃培养12小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以10％(体积比)的接种量接种于1升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，40℃培养13小时，得到二级种子培养液；
(4)发酵培养：德国贝朗(BIOSTAT B，B.Braun)50升发酵罐中加入30升发酵初始培养基。在发酵培养基中接入3升二级种子培养液，发酵罐搅拌转速400rpm，40℃条件下发酵51小时。每隔3小时取样测定发酵液中的残糖量和2，3-丁二醇浓度。根据残糖浓度来脉冲流加总糖浓度为320g/L的木薯粉水解液，维持糖浓度在40～80g/L。
(5)测定分析：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、糖浓度，计算糖转化率、2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得葡萄糖的浓度为4.0±0.4g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度58.3±1.5g/L(平均值±标准差)，糖转化率达到理论转化率的70.6±1.6％(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为1.14±0.03g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化钠2g/L，氯化钾2g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂粉18g/L，pH值调至7.0，蒸馏水配制，115℃灭菌 20分钟；
上述种子培养基组成为：葡萄糖40g/L，磷酸二氢钾6g/L，氯化铵5g/L，氯化钠3g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，pH值调至7.0，蒸馏水配制，115℃条件下灭菌20分钟；
上述发酵培养基组成为：总糖浓度为320g/L的木薯粉水解液100g/L，玉米浆干粉15g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵5g/L，乙酸钾4g/L，氯化钠2g/L，氯化钙0.075g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锌0.4g/L，硫酸亚铁0.2g/L，pH值调至7.0，自来水配制，115℃灭菌20分钟。
实施例7：利用阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDMCGMCC No.4230以淀粉水解液为碳源同步糖化发酵生产2，3-丁二醇
应用方法涉及的步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No.4230；
(2)斜面培养：将菌种接种于斜面培养基上，40℃条件下，静置培养12小时；
(3)种子培养：
一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，40℃培养12小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以10％(体积比)的接种量接种于1升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为150rpm的摇床上，40℃培养13小时，得到二级种子培养液；
(4)淀粉处理及同步糖化分批发酵培养基的制备：
将350g淀粉加水调制成淀粉浆定容至1L，调节pH至6.0，按加酶量为3U/g淀粉干重加入α-淀粉酶，在95℃条件下蒸煮4小时，得到淀粉液化液，115℃灭菌20分钟，冷却后作为碳源，用于制备进行同步糖化分批发酵的发酵培养基；
(5)50升发酵罐同步糖化分批发酵生产2，3-丁二醇：
无菌条件下将培养好的阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC No.4230种子液按体积比为5％的接种量接入灭菌的发酵培养基，同时补加过滤除菌的糖化酶，糖化酶添加量为200U/g淀粉干重；发酵罐总装液量为30L，以发酵温度为37℃，搅拌转速为350rpm，通气量为1.0vvm进行发酵；发酵初始pH值为6.5，发酵过程中pH值控制在pH 6.0；发酵时间为40小时。每隔5小时取样测定发酵液中的残糖量和2，3-丁二醇浓度。发酵过程中加入灭菌的淀粉液化液和过滤除菌的糖化酶，糖化酶添加量为200U/g淀粉干重，保持发酵液中葡萄糖浓度在15～40g/L。
(6)测定分析：取上述发酵液，8,000rpm离心5分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2，3-丁二醇浓度、糖浓度，计算糖转化率、2，3-丁二醇生产率。
发酵结束，测得总糖的浓度为3.6±0.4g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇浓度82.5±1.7g/L(平均值±标准差)，2，3-丁二醇生产率为2.06±0.04g/(L·h)(平均值±标准差)。
上述斜面培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏4g/L，氯化钠2g/L，氯化钾2g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂粉18g/L，pH值调至6.5，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
上述种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵8g/L，氯化钠4g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸亚铁0.05g/L，pH值调至6.5，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
上述发酵培养基组成为：淀粉液化液，其用量为500mL/L，玉米浆干粉7g/L，磷酸二氢钾6g/L，氯化铵15g/L，乙酸钾4g/L，氯化钠3g/L，氯化钙0.1g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锌0.2g/L，硫酸亚铁0.2g/L，自来水配制，该发酵培养基的初始pH为6.5，115℃灭菌20分钟；淀粉液化液单独灭菌。
Claims (1)
1.一株产2,3-丁二醇的阴沟肠杆菌溶解亚种，其特征在于：该菌株名为阴沟肠杆菌溶解亚种（Enterobacter cloacae subsp. dissolvens）SDM，菌株已于2010年10月19日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No. 4230。
2.权利要求1所述阴沟肠杆菌溶解亚种在制备2,3-丁二醇中的应用，其特征在于：由阴沟肠杆菌溶解亚种（Enterobacter cloacae subsp. dissolvens）SDM CGMCC No. 4230发酵生产2,3-丁二醇；其中涉及的方法是:
斜面活化培养：将阴沟肠杆菌溶解亚种（Enterobacter cloacae subsp. dissolvens）SDM CGMCC No. 4230菌种接种于斜面培养基，30～40℃条件下，静置培养10～14小时，备用；
一级种子培养：将上述培养的斜面菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于80～120 mL液体种子培养基的500 mL三角瓶中，置于转速为100～200 rpm的摇床上，30～40℃培养10～16小时，得到一级种子培养液；
扩大培养：将上述培养的一级种子，在无菌条件下以体积比5～10%的接种量接种于0.8～1.2升液体种子培养基的5升三角瓶中，置于转速为100～200 rpm的摇床上，30～40℃培养10～16小时，得到二级种子培养液；
50升发酵罐发酵：以体积比5～10%的接种量，将二级种子液接种于50升发酵罐中，发酵罐装液量为30升，然后以初始碳源浓度为60～120 g/L、温度30～40℃、搅拌转速200～600 rpm、通气量0.5～1.5 vvm进行通风搅拌发酵培养，培养时间为20～60小时；发酵液初始pH值调至5.5～7.0，发酵过程中，通过流加3～6 M的KOH和2～5 M的H3PO4来调节pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；发酵过程中，每隔3～5小时取样测定发酵液中的糖残量和2,3-丁二醇浓度，并依据底物的浓度流加底物，当发酵液中2,3-丁二醇浓度不再上升时，发酵结束；
其中：上述培养中涉及的培养基及配方是：
斜面培养基组成为：葡萄糖15 g/L，蛋白胨4 g/L，酵母膏4 g/L，氯化钠2 g/L，氯化钾2 g/L，硫酸镁1.5 g/L，琼脂粉18 g/L，pH值调至5.5～7.0，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
种子培养基组成为：碳源30～40 g/L，磷酸二氢钾3～10 g/L，氯化铵3～12 g/L，氯化钠1～4 g/L，硫酸镁0.05～0.1 g/L，硫酸亚铁0.05～0.1 g/L，pH值调至5.5～7.0，蒸馏水配制，115℃灭菌20分钟；
发酵培养基组成为：碳源60～120 g/L，玉米浆干粉5～20 g/L，磷酸二氢钾3～10 g/L，氯化铵5～25 g/L，乙酸钾1～4 g/L，氯化钠1～4 g/L，氯化钙0.05～0.1 g/L，硫酸镁0.1～0.5 g/L，硫酸锌0.2～0.6 g/L，硫酸亚铁0.2～0.6 g/L，pH值调至5.5～7.0，自来水配制，115℃灭菌20分钟。
3. 如权利要求2所述阴沟肠杆菌溶解亚种在制备2,3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述50升发酵罐发酵培养中流加方式为脉冲流加。
4. 如权利要求3所述阴沟肠杆菌溶解亚种在制备2,3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述脉冲流加的方式是当糖浓度降到10～30 g/L时，脉冲流加底物，使糖浓度达到50～70 g/L。
5. 如权利要求2所述阴沟肠杆菌溶解亚种在制备2,3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述种子培养基中的碳源至少含有葡萄糖或木糖。
6. 如权利要求2所述阴沟肠杆菌溶解亚种在制备2,3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述发酵培养基中的碳源至少含有葡萄糖、木糖、蔗糖糖蜜、木糖母液、淀粉类原料水解液、木质纤维素原料水解液中的一种；该碳源单独灭菌，无需调节pH；其中，所述淀粉类原料水解液以如下方法制得：取淀粉类原料，以2～8 U/g淀粉类原料干重的酶用量加入α-淀粉酶，95℃处理0.5 h，得到淀粉类原料液化液，然后调pH至4.2，加入糖化酶，糖化酶的添加量为100～1000 U/g淀粉类原料干重，置于60℃水浴摇床中处理至葡萄糖彻底水解，得含糖浓度以质量体积比计为15%～40%的淀粉类原料水解液；所述木质纤维素原料水解液以如下方法制得：取粉碎的木质纤维素原料，以质量体积比计，按木质纤维素原料:质量分数为1%硫酸 = 1:10～1:3的量加入硫酸，120℃处理1小时，常规离心，上清液即为含糖浓度以质量体积比计为15%～35%的木质纤维素原料水解液。
7. 如权利要求6所述阴沟肠杆菌溶解亚种在制备2,3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述淀粉类原料选淀粉或木薯粉；所述木质纤维素原料选木头、玉米芯或秸秆。
8. 如权利要求6所述阴沟肠杆菌溶解亚种在制备2,3-丁二醇中的应用，其特征在于：所述淀粉类原料水解液中糖浓度以质量体积比计为25%～35%；所述木质纤维素原料水解液中糖浓度以质量体积比计为25%～30%。
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