CN102433354B

CN102433354B - 一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法

Info

Publication number: CN102433354B
Application number: CN201110361128.7A
Authority: CN
Inventors: 乔利仙; 于明洋; 孙明明; 丁霄; 隋炯明; 刘文平; 陈立涛; 王晶珊
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2031-11-15
Also published as: CN102433354A

Abstract

本发明提供了一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，它包括构建含有目的基因的重组载体；将重组载体转化花生胚小叶外植体；将转化后胚小叶外植体转移到添加有蔗糖和木糖的诱导培养基上进行培养，直至诱导出体胚；将体胚转移到萌发培养基上进行培养，直至诱导成苗；对再生苗进行PCR检测，获得转基因阳性植株；将转基因阳性植株通过嫁接方法移栽田间。本发明使用添加了5g/L的蔗糖和10g/L的木糖的培养基进行培养，非转化体由于不能利用木糖生长受到抑制不能成苗，转化体由于能够利用木糖可以再生成苗，因此可以筛选出转基因植株，避免了使用抗生素进行筛选可能造成的安全隐患；转化效率高，是一种安全、高效的筛选方法。

Description

一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法

技术领域

本发明涉及花生分子育种领域，具体涉及一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法。

背景技术

花生是我国重要的油料作物和经济作物，在农业乃至整个国民经济中均具有重要地位。然而，由于花生栽培种遗传基础狭窄、抗逆性差，尤其易感多种病虫害，严重影响其产量和品质。随着生物技术的发展，利用转基因技术来改进花生栽培种受到研究者的广泛重视。而在花生遗传转化过程中利用抗生素类基因和抗除草剂类基因进行筛选，有可能会对环境及人类健康产生不良影响和损害。因此，利用无争议的生物安全标记基因来构建表达载体，便逐渐成为新的研究热点。木糖是半纤维素的主要组成部分，自然界中存在着某些利用木糖的丝状真菌、酵母菌和细菌，但是许多植物细胞不能利用木糖，所以难以将木糖基因等安全标记基因用于植物中以筛选转化体。

发明内容

针对现有技术中花生遗传转化过程中利用抗生素类基因和抗除草剂类基因进行筛选存在的缺陷和不足，本发明提供了一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法。本发明构建了含有xylA基因的植物表达载体pCAMBIA1301-xylA，并通过农杆菌介导法转化花生胚小叶外植体，在添加了蔗糖（5g/L）和木糖（10g/L）的培养基上进行筛选，诱导成苗率达15.25%，转基因阳性率达到77.27%。本发明避免了利用抗生素筛选可能造成的安全隐患，而且转化效率高，是一种安全、高效的筛选方法。

为达到解决上述技术问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，它包括以下步骤：

(1)将目的基因***到含木糖异构酶基因xylA的植物表达载体中，构建含有目的基因的重组载体；

(2)将重组载体转化花生胚小叶外植体；

(3)将转化后胚小叶外植体转移到添加有蔗糖和木糖的诱导培养基上进行培养，4~5周后诱导出体胚；

(4)将体胚转移到添加有蔗糖和木糖的萌发培养基上进行培养，4~5个月后诱导成苗；

(5)对再生苗进行PCR检测，获得转基因阳性植株；

(6)将转基因阳性植株通过嫁接方法移栽田间。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(1)中植物表达载体为pCAMBIA1301-xylA。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(2)中利用农杆菌介导法将重组载体转化花生胚小叶外植体。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(3)中诱导培养基是含有5g/L蔗糖、10g/L木糖、10mg/L2,4-D的MS-B₅培养基。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(4)中萌发培养基是含有5g/L蔗糖、10g/L木糖、4mg/LBAP的MS-B₅培养基。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(3)和(4)中的培养条件为25℃、3000lx、每日光照13h。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(5)中PCR检测的xylA基因引物为：

上游引物为5ˊ-CTCGAGATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3ˊ，

下游引物为5ˊ-CTCGAGATTATTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3ˊ。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明所述将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，使用添加了蔗糖（5g/L）和木糖（10g/L）的培养基进行培养，转化体在木糖异构酶基因xylA的催化下能将木糖转化为木酮糖，再经过磷酸戊糖途径分解代谢，为细胞生长所利用，在以木糖为主要碳源的培养基上，转化细胞因能利用木糖而呈现优势生长，非转化体则因碳源供应不足而使生长受到抑制不能成苗。因此可以筛选出转化体，避免了使用抗生素进行筛选可能造成的安全隐患。

2、在添加蔗糖（5g/L）和木糖（10g/L）的培养基进行培养，诱导成苗率达15.25%，所得到的再生植株经PCR检测阳性率高达77.27%，是一种安全、高效的筛选方法。

附图说明

图1是本发明中花生胚小叶外植体在添加蔗糖（10g/L）的培养基上的生长情况。

图2是本发明中花生胚小叶外植体在添加蔗糖（5g/L）的培养基上的生长情况。

图3是本发明中转基因植株在添加蔗糖（5g/L）和木糖（10g/L）的培养基上筛选后的PCR检测结果。

图4是本发明中转基因再生植株嫁接移栽田间生长情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明。

实施例1、建立将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法

1、xylA基因的克隆

根据GenBank中xylA基因序列（登录号No.X04691）设计引物，并在引物5ˊ末端添加XhoⅠ酶切位点（斜体部分）：

上游引物为5ˊ-CTCGAGATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3ˊ，

下游引物为5ˊ-CTCGAGATTATTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3ˊ。

以大肠杆菌DH-5α菌株基因组DNA为模板进行PCR反应，扩增xylA基因并将其克隆到pMD18-T载体（购自宝生物大连工程有限公司）上，得到T-xylA重组质粒。

2、植物表达载体pCAMBIA1301-xylA的构建

用XhoⅠ酶切pCAMBIA1301质粒（购自上海希匹吉生物技术有限公司），去掉潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin-B-phosphotransferase,Hpt)，用XhoⅠ酶切T-xylA重组质粒，切下xylA基因片段。回收pCAMBIA1301质粒大片段和xylA基因小片段，用T₄DNA连接酶将xylA片段连接到切除Hpt基因的pCAMBIA1301质粒上，得到重组质粒pCAMBIA1301-xylA。

3、将表达载体转化花生，包括以下步骤：

a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将pCAMBIA1301-xylA重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株EHA105（购自北京天恩泽基因科技有限公司）感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB（利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L）液体培养基中，28℃、180rpm培养至OD₆₀₀=0.5~0.8时，取2mL菌液转移到50mLYEB（利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L）培养基中，培养到OD₆₀₀=0.6~0.8。将菌液于5000rpm离心15min后，用相同体积的液体MS-B₅悬浮备用。

b、花生胚小叶外植体的分离：将连同胚轴的花生胚小叶切下，在70%乙醇中浸泡10~20s，0.1%升汞中浸泡8min，无菌水冲洗后浸泡过夜，次日将胚轴切去分离出胚小叶，放入MS-B₅培养基中预培养3天，培养条件为25℃、3000lx、每日光照13h。

c、农杆菌介导的遗传转化：将预培养3天后的胚小叶外植体浸于已备好的农杆菌菌液中，28℃、90rpm温和震荡侵染15min。用无菌滤纸将残留菌液吸干，接种到MS-B₅培养基中共培养3天后，转移到添加羧苄青霉素（500mg/L）的体胚诱导培养基（MS-B₅，添加10mg/L2,4-D）中培养，约4~5周后诱导出体胚。培养条件为25℃、3000lx、每日光照13h。

4、木糖筛选体系的建立，包括以下步骤：

a、基本培养基和培养条件：培养基为MS-B₅，添加不同浓度的蔗糖/木糖浓度比、0.8%琼脂，pH为5.8，在121℃、105Kpa条件下灭菌20min。培养条件为25℃、3000lx、每日光照13h。

b、最适蔗糖浓度的确定：取花生品种“花育22”成熟种子24粒，分为4组，每组6粒。分离胚小叶外植体（方法同上），0.1%升汞消毒10min，然后转移到MS-B₅培养基进行培养，蔗糖浓度分别为5g/L，10g/L，20g/L，30g/L。培养4~5个月后进行统计分析。结果表明当蔗糖浓度在10g/L及以上浓度时，外植体可以分化成苗（如图1所示）；当蔗糖浓度为5g/L时，外植体停留在体胚阶段，不能分化成苗（如图2所示）。所以最终确定5g/L为蔗糖最低临界浓度。

c、最适木糖浓度的确定：利用农杆菌介导法将重组质粒pCAMBIA1301-xylA转化花生胚小叶外植体，然后转移到添加了蔗糖（5g/L）和不同浓度木糖（5g/L，10g/L，20g/L，30g/L）的体胚诱导培养基上进行培养。诱导出的体胚转到添加了蔗糖（5g/L）和不同浓度木糖（5g/L，10g/L，20g/L，30g/L）的体胚萌发培养基上进行培养，约4~5个月诱导成苗后进行统计分析。结果如表1所示，随着木糖浓度的升高，诱导成苗率有所下降；当木糖浓度为5g/L时，诱导成苗率最高（17.54%），但植株生长较弱；当木糖浓度为10g/L时，诱导成苗率较高（15.25%），植株生长健壮，且嫁接成活率高；所以最终确定10g/L为最适木糖浓度。

表1：不同木糖浓度下外植体的成苗率及再生苗生长情况

木糖浓度	外植体数	成苗数	成苗率	再生苗生长情况
					5g/L	285	50	17.54%	生长较弱，嫁接成活率低
10g/L	282	43	15.25%	生长正常，嫁接成活率高
					20g/L	272	29	10.66%	生长正常，嫁接成活率高
30g/L	302	18	5.96%	生长正常，褐化死亡率高

4、转基因植株的PCR检测

提取再生植株的基因组DNA，利用上述xylA基因引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃，5min；95℃50s，56℃50s，72℃70s，30个循环；72℃，10min。转基因阳性率达到77.27%，PCR电泳图谱如图3所示。

5、对转基因阳性植株进行嫁接移栽

以12~15d苗龄的“花育20”无菌实生苗为砧木，切除距子叶节约2cm以上的主茎部分，用手术刀将砧木上端垂直劈开，切口深约0.5~1cm。当转基因植株长到约2~3cm时，从芽丛基部切下再生小苗做接穗，下端切成长约0.5~1cm的V形伤口，切口平整。将接穗***砧木中，使砧木和接穗的形成层紧密接触，然后用封口膜缠绕接口，松紧适度。将嫁接苗置于MS-B₅培养基中无菌培养3~4天；然后移栽于灭菌的育苗基质中（包括蛭石、草炭土和珍珠岩）进行驯化3周，之后移栽到田间。转基因植株在田间生长情况表现正常，如图4所示。

实施例2、利用木糖筛选方法检验葡聚糖酶基因Glu的转化

本发明所述的将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法具体包括如下步骤：

1、构建含目的基因的重组质粒：将目的基因β-1,3-葡聚糖酶基因(Glu)（登录号M58462.1）***植物表达载体pCAMBIA1301-xylA，得到含有目的基因Glu的重组质粒pCAMBIA1301-xylA-Glu。

2、将含有目的基因的重组质粒转化花生

利用农杆菌介导法将得到的重组质粒pCAMBIA1301-xylA-Glu转化花生胚小叶外植体（转化方法同实例1）。

3、将转化后胚小叶外植体转移到体胚诱导培养基上培养

将转化后胚小叶外植体转移到添加了蔗糖（5g/L）和木糖（10g/L）的体胚诱导培养基（MS-B₅，添加10mg/L2,4-D）上进行培养，约4~5周后得到体胚。具体培养条件为25℃、3000lx、每日13h光照。

4、诱导出的体胚转移到体胚萌发培养基上培养

诱导出的体胚转移到含有蔗糖（5g/L）和木糖（10g/L）的体胚萌发培养基（MS-B₅，添加4mg/LBAP）上进行培养，约4~5个月后诱导成苗。具体培养条件为25℃、3000lx、每日13h光照。

5、再生苗的统计及PCR检测

经4~5个月培养后，213个胚小叶外植体共得到32棵再生植株，诱导成苗率15%。

PCR检测的引物为：

上游引物为5ˊ-CTCGAGATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3ˊ，

下游引物为5ˊ-CTCGAGATTATTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3ˊ。

PCR反应程序为：95℃，5min；95℃50s，56℃50s，72℃70s，30个循环；72℃，10min。检测表明转基因阳性率达到75%以上。

6、将转基因阳性苗嫁接移栽田间

采用如实施例1所示无菌嫁接方法将转基因植株进行嫁接，之后移栽田间。转基因植株在田间生长情况表现正常。

本发明用大肠杆菌木糖异构酶基因xylA替换掉pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶基因，构建植物表达载体pCAMBIA1301-xylA，将表达载体转入农杆菌菌株EHA105，利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-xylA导入花生胚小叶外植体，转移到添加了蔗糖（5g/L）和木糖（10g/L）的体胚诱导培养基（MS-B₅，添加10mg/L2,4-D）及体胚萌发培养基（MS-B₅，添加4mg/LBAP）上进行培养，培养条件为25℃、3000lx、每日光照13h。转化植株培养4个月后，诱导成苗率达15.25%，转基因阳性率达到77.27%。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)构建含目的基因的重组质粒：将登录号M58462.1的目的基因β-1，3-葡聚糖酶基因Glu***植物表达载体pCAMBIA1301-xylA，得到含有目的基因Glu的重组质粒pCAMBIA1301-xylA-Glu；

(2)将含有目的基因的重组质粒转化花生

利用农杆菌介导法将得到的重组质粒pCAMBIA1301-xylA-Glu转化花生胚小叶外植体；

(3)将转化后胚小叶外植体转移到体胚诱导培养基上培养

将转化后胚小叶外植体转移到添加了蔗糖5g/L和木糖10g/L的体胚诱导培养基上进行培养，体胚诱导培养基为添加10mg/L2，4-D的MS-B₅，4～5周后得到体胚，具体培养条件为25℃、3000lx、每日13h光照；

(4)诱导出的体胚转移到体胚萌发培养基上培养

诱导出的体胚转移到含有蔗糖5g/L和木糖10g/L的体胚萌发培养基上进行培养，体胚萌发培养基为添加4mg/LBAP的MS-B₅，4～5个月后诱导成苗，具体培养条件为25℃、3000lx、每日13h光照；

(5)再生苗的统计及PCR检测

PCR检测的引物为：

上游引物为5′-CTCGAGATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3′，

下游引物为5′-CTCGAGATTATTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3′；

PCR反应程序为：95℃，5min；95℃50s，56℃50s，72℃70s，30个循环；72℃，10min，检测表明转基因阳性率达到75％以上；

(6)将转基因阳性苗嫁接移栽田间。